苘娜娜馬煥艷魯華云倪春霄孟祥坤余榮峰魯興萌

（1杭州市種子總站，浙江杭州 310020；2浙江大學(xué)蠶蜂研究所，浙江杭州 310058；3

淳安縣繭絲綢總公司，浙江淳安 311700）

不同分子類型家蠶病原性白僵菌的分離及致病性試驗(yàn)

苘娜娜1馬煥艷2魯華云1倪春霄1孟祥坤2余榮峰3魯興萌2

（1杭州市種子總站，浙江杭州 310020；2浙江大學(xué)蠶蜂研究所，浙江杭州 310058；3

淳安縣繭絲綢總公司，浙江淳安 311700）

基于家蠶白僵病在部分蠶區(qū)季節(jié)性流行較為嚴(yán)重的現(xiàn)象，為了解家蠶病原性白僵菌在養(yǎng)蠶生產(chǎn)中是否存在菌種多樣性或存在主流菌種，從浙江省淳安縣（CA）、桐鄉(xiāng)市（TX）、臨安市（LA）和桐廬縣（TL）蠶區(qū)采集的86份白僵病蠶或病蛹樣品中分離得到53個(gè)菌株；通過(guò)核糖rDNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列分析和形態(tài)學(xué)觀察確認(rèn)，有47個(gè)分離菌株為球孢白僵菌屬，3個(gè)為蠟蚧屬，3個(gè)為擬青霉屬；對(duì)ITS序列存在差異的7個(gè)分離菌株進(jìn)行家蠶致病力試驗(yàn)，結(jié)果顯示，不同菌株對(duì)家蠶的致病力存在一定差異，家蠶致病力依次為CA-12（球孢白僵菌屬，76.67%）＞CA-15（球孢白僵菌屬，53.33%）＞TX-1（蠟蚧屬，28.33%）＞CA-1（球孢白僵菌屬，16.67%）＞CA-6（擬青霉屬，10.00%）＞TX-12（蠟蚧屬，0）＝TX-13（0，蠟蚧屬），球孢白僵菌株對(duì)家蠶的致病力最強(qiáng)，病勢(shì)也最急，其他菌株對(duì)家蠶的致病力有高有低；推測(cè)家蠶白僵病致病性菌種呈多樣性，試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究家蠶白僵病的防控提供了參考依據(jù)。

家蠶；白僵菌；菌株；ITS序列分析；致病力

家蠶白僵病是養(yǎng)蠶生產(chǎn)上一種常見(jiàn)且危害嚴(yán)重的寄生性真菌蠶病，在我國(guó)江蘇、浙江、廣西、廣東等主要蠶區(qū)都曾嚴(yán)重暴發(fā)［1-4］，導(dǎo)致蠶繭大幅減產(chǎn)甚至絕收。球孢白僵菌［Beauveria bassiana（Bals）Vuill，以下簡(jiǎn)稱白僵菌］是該病的主要病原。白僵菌寄主范圍非常廣，可寄生15個(gè)目700多種昆蟲(chóng)及螨類［5］，家蠶等鱗翅目昆蟲(chóng)也是白僵菌易感宿主。白僵菌具有極其豐富的遺傳多樣性［6-7］和種群異質(zhì)性［8］，不同菌株的生態(tài)習(xí)性及對(duì)寄主昆蟲(chóng)的致病力都存在較大的差異［9］；因此，開(kāi)展白僵菌分類研究具有重要意義。傳統(tǒng)上的白僵菌分類主要是依據(jù)分生孢子和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的形態(tài)特征，但對(duì)于形態(tài)特征不明顯的菌株，若用傳統(tǒng)的方法又很難準(zhǔn)確鑒定［10］。目前隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，利用核糖rDNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal Transcribed Spacer ITS）序列測(cè)定，能實(shí)質(zhì)性地反映出屬間、種間以及菌株間的堿基對(duì)差異而成為真菌分類研究的一項(xiàng)重要技術(shù)手段［11］。

本研究從浙江省淳安縣、桐鄉(xiāng)市、臨安市和桐廬縣等蠶區(qū)采集的白僵病蠶或僵蛹中分離出菌株，通過(guò)ITS序列分析、形態(tài)學(xué)觀察及家蠶致病力試驗(yàn)，尋求養(yǎng)蠶生產(chǎn)中是否存在白僵菌主流菌種，或存在菌種多樣性，以期為家蠶白僵病的防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試白僵蠶或僵蛹：2010年在春蠶和夏蠶的5齡僵蠶或僵蛹中采集樣品，從淳安縣采集21份，桐鄉(xiāng)市采集36份，臨安市采集9份，桐廬縣采集20份，共計(jì)86份。樣品采集后裝袋、按地區(qū)編號(hào)（淳安縣樣品代號(hào)為“CA-X”，X＝1～21份；桐鄉(xiāng)市樣品代號(hào)為“TX-X”，X＝1～36份；臨安市樣品代號(hào)為“LA-X”，X＝1～9份；桐廬縣樣品代號(hào)為“TL-X”，X＝1～20份）；放入冰箱中4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

對(duì)照菌株：以本實(shí)驗(yàn)室保存的已確定種名的球孢白僵菌（BJ）為對(duì)照。

蠶品種：菁松×皓月，由桐鄉(xiāng)市蠶業(yè)有限公司生產(chǎn)，在浙江大學(xué)家蠶病理學(xué)與病害控制研究室飼養(yǎng)至2齡起蠶備用。

主要試劑和儀器：DNA buffer（含Mg2＋）、dNTP、Taq酶、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、DNA marker、蛋白酶K等，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；PCR所需引物，由生工生物工程（上海）有限公司合成；酸化玻璃珠（直徑425～600μm），購(gòu)自Sigma公司（美國(guó)）；氯化芐、醋酸鈉（NaAc）等其它化學(xué)試劑，均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口的分析純；培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）?？焖俸怂崽崛xFastPrep-24，由美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)；PCR儀Veriti 96，由美國(guó)Ap?plied Biosystems公司生產(chǎn)；數(shù)碼顯微鏡三維分析系統(tǒng)VHX-900，由日本KEYENCE公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 白僵菌菌株分離與鑒定 將采集的86份白僵病蠶或僵蛹的樣品及對(duì)照菌株BJ，參照文獻(xiàn)［12-13］的方法對(duì)白僵蠶或僵蛹樣品菌株進(jìn)行分離和鑒定，菌株編號(hào)沿用初始樣品編號(hào)。

1.2.2 分離菌株基因組DNA的提取 參照氯化芐提取白僵菌基因組DNA的方法［14］提取分離菌株基因組DNA，并做了適當(dāng)改進(jìn)。改進(jìn)之處是取新鮮氣生菌絲使用酸化玻璃珠破碎法振蕩，以及在提取過(guò)程中加入蛋白酶K。具體步驟：刮取培養(yǎng)皿內(nèi)分離菌株的純培養(yǎng)物（氣生菌絲），加0.5 mL DNA提取液（100 mmol／L Tris-Cl、40 mmol／L EDTA），0.1 mL 10%十二烷基磺酸鈉（SDS），0.3 mL氯化芐，2倍菌絲體積的酸化玻璃珠混合。使用快速核酸提取儀4 000 r／min劇烈振蕩40 s×5次，使管內(nèi)混合物呈乳狀；加2μL濃度為20 mg／mL的蛋白酶K后50℃溫浴1 h；冷卻至室溫后，加入0.3 mL預(yù)冷的3 mol／L醋酸鈉（NaAc，pH 5.2）溶液，混勻后冰浴15 min，4℃8 000 r／min離心15 min；取上清液移至新EP管中，加入等體積-20℃預(yù)冷的異丙醇于室溫沉淀30 min，4℃12 000 r／min離心15min，沉淀用-20℃預(yù)冷的75%乙醇洗滌1次，干燥后溶于200μL雙氧水（ddH2O）中；加2μL濃度為10 mg／mL的RNA酶，37℃水浴1 h；加入等體積的Tris飽和酚，4℃12 000 r／min離心10 min；取上清加入等體積酚—氯仿—異戊醇（25∶24∶1）4℃12 000 r／min離心10 min；取上清加入等體積氯仿—異戊醇（24∶1）4℃12 000 r／min離心10 min；取上清移至新EP管中加入1／10體積濃度為3 mol／L的NaAc（pH 5.2），再加入等體積-20℃預(yù)冷的異丙醇，放入-20℃冰箱使DNA沉淀30 min；4℃12 000 r／min離心10min，沉淀用75%預(yù)冷的乙醇4℃6 000 r／min離心3 min，洗滌2次，待乙醇揮發(fā)完全后，加100μL ddH2O溶解沉淀物，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR擴(kuò)增及測(cè)序 采用真菌通用引物［15］ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）和ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）進(jìn)行擴(kuò)增，由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。PCR反應(yīng)體系（50μL）：0.5μL Taq酶，5μL 10×PCR buffer（含Mg2＋），2μL濃度為2.5 mmol／L的dNTP，1μL模板DNA，引物各0.5μL，40.5μL雙蒸水。擴(kuò)增反應(yīng)條件：94℃5 min；94℃1 min，55℃50 s，72℃55 s，32個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳20 min檢測(cè)是否有目的條帶，純化后由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建 將PCR產(chǎn)物測(cè)序所得的核苷酸序列通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源檢索（http：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi）；用ClustalW軟件進(jìn)行多序列比對(duì)；Gene.Doc軟件進(jìn)行序列編輯；用MEGA4軟件包中的Neighbor-Joining法構(gòu)建分子進(jìn)化系統(tǒng)樹(shù)，并用Bootstrap分析方法對(duì)所構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行可靠性檢驗(yàn)。

1.2.5 菌落分生孢子著生狀態(tài)和形態(tài)觀察 將白僵蠶或蛹來(lái)源的分離菌株與對(duì)照菌株提取的DNA，PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后，將ITS序列有差異的菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d（26℃）后，取分生孢子以0.1%Tween-80的無(wú)菌水配制成濃度1×107個(gè)／mL的分生孢子懸浮液，然后用接種針?lè)謩e將各分生孢子懸浮液點(diǎn)植于PDA平板培養(yǎng)基上，每皿3點(diǎn)，成正三角形排列，每個(gè)菌株3個(gè)培養(yǎng)皿，倒置于26℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第7天通過(guò)數(shù)碼顯微鏡三維分析系統(tǒng)VHX-900，放大900倍，利用實(shí)時(shí)2D、快速深度合成技術(shù)觀察記錄各菌株分生孢子的著生狀態(tài)。

1.2.6 不同菌株對(duì)家蠶致病力的測(cè)定 將每個(gè)菌株配制成濃度為1×107個(gè)／mL的分生孢子懸浮液，取5 mL分生孢子懸浮液放在細(xì)胞培養(yǎng)皿（35 mm× 10 mm）中，將2齡起蠶（菁松×皓月）浸2 s后取出正常飼養(yǎng)，每區(qū)20頭蠶，3次重復(fù)。實(shí)驗(yàn)室保存的BJ菌株設(shè)為陽(yáng)性對(duì)照組，處理同上，空白對(duì)照組用無(wú)菌水處理。每天調(diào)查蠶的死亡情況，3齡起蠶后結(jié)束統(tǒng)計(jì)。蟲(chóng)尸保濕放置，檢查是否會(huì)產(chǎn)生菌絲。計(jì)算僵蟲(chóng)率，找出致病力較強(qiáng)的菌株。

將致病力較強(qiáng)的菌株分別配制成濃度為1× 102、1×103、1×104、1×105、1×106個(gè)／mL的分生孢子懸浮液，試驗(yàn)方法同上。采用Excel進(jìn)行回歸分析［16］，計(jì)算LC50，并對(duì)各菌株進(jìn)行毒力比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌菌株的分離與鑒定

從浙江省淳安縣、桐鄉(xiāng)市、臨安市和桐廬縣等蠶區(qū)采集的86份白僵蠶或蛹樣品中，分離得到53個(gè)菌株，其中：淳安縣9個(gè)菌株，桐鄉(xiāng)市30個(gè)菌株，臨安市9個(gè)菌株，桐廬縣5個(gè)菌株。對(duì)53個(gè)分離菌株的DNA特異擴(kuò)增了rDNA的ITS序列（18S rDNA，ITS 1，5.8S rDNA和ITS 2），擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，得到1條清晰目的條帶，分子量在580 bp左右。PCR產(chǎn)物純化經(jīng)雙向測(cè)序后，與GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已登陸的基因序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)：有47個(gè)分離菌株為球孢白僵菌，其中40個(gè)與對(duì)照菌株ITS序列完全相同，7個(gè)分離菌株（CA-1、CA-2、CA-10、CA-12、CA-13、CA-15、CA-16）與對(duì)照菌株存在個(gè)別堿基差異，并存在3個(gè)不同序列。其余分離菌株中有3個(gè)（TX-1、TX-12和TX-13）為蠟蚧屬（Lecanicillium），其種名分別為L(zhǎng).attenuatum［17］、L.saksenae［18］、L.aphanocladii［19］；3個(gè)分離菌株（CA-6、CA-20和TX-30）為擬青霉屬（Paecilomy?ces），即家蠶灰僵菌，但通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)Blast比對(duì)尚不足以鑒定到具體的“種”，需進(jìn)一步結(jié)合形態(tài)學(xué)特征確定種名，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 分離菌株基于ITS序列分析的分類鑒別

2.2 分子進(jìn)化樹(shù)分析

將同屬白僵菌屬但I(xiàn)TS序列存在差異的3個(gè)分離菌株CA-1、CA-12和CA-15，及擬青霉屬的CA-6和蠟蚧屬的TX-1、TX-12、TX-13與對(duì)照菌株BJ進(jìn)行核苷酸序列聯(lián)配比較，采用MEGA的Neighbor?Joining法構(gòu)建ITS序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，如圖1所示。從系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果分析，分離菌株可被劃分為3類：CA-15、CA-12、CA-1與對(duì)照菌株BJ聚為一類，置信值為100%，親緣關(guān)系密切；蠟蚧菌TX-1、TX-12、TX-13聚為一類，置信值大于80%；灰僵菌CA-6自成一類。

圖1 基于ITS核酸序列的系統(tǒng)樹(shù)

2.3 菌落特征和分生孢子的形態(tài)

從表2可以看出，將7個(gè)分離菌株（CA-1、CA-12、CA-15、CA-6、TX-1、TX-12、TX-13）及對(duì)照菌株BJ在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行菌落形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，不同屬間菌株表現(xiàn)出不同的形態(tài)特征。

2.4 分生孢子的著生狀態(tài)

從菌株分生孢子的著生狀態(tài)來(lái)看，白僵菌BJ（對(duì)照）、CA-1、CA-12、CA-15的分生孢子梗多與氣生菌絲呈直角分叉對(duì)生或散生狀態(tài)，在頂生的分生孢子下方不遠(yuǎn)處反復(fù)分枝產(chǎn)孢，形成“之”字形彎曲的產(chǎn)孢軸，成簇生長(zhǎng)的分生孢子梗上的分生孢子集積而成為葡萄狀；蠟蚧菌TX-1、TX-12、TX-13分生孢子梗為離散的皮刺狀，輪狀著生或單生，長(zhǎng)錐型，端部漸狹；灰僵菌CA-6在培養(yǎng)基上培養(yǎng)數(shù)日后集積的分生孢子呈淡灰色，在分生孢子梗上下的每個(gè)小梗頂端串生分生孢子形成孢子鏈（圖2）。

表2 ITS序列有差異的菌株在PDA培養(yǎng)基上的形態(tài)特征比較

圖2 不同白僵菌菌株分生孢子的生長(zhǎng)形態(tài)

2.5 不同白僵菌菌株對(duì)家蠶的致病力測(cè)定

選用2齡起蠶（菁松×皓月），配制孢子懸浮液濃度為1×107個(gè)／mL，采用浸蟲(chóng)法［20-21］測(cè)定各分離菌株的致病力。從表3可見(jiàn)，不同白僵菌菌株對(duì)家蠶的致病力不同，CA-12、CA-15這2個(gè)菌株的致病力較高，對(duì)家蠶的致死率分別達(dá)到76.67%、 53.33%，TX-1、CA-1、CA-6這3個(gè)菌株的致病力相對(duì)偏弱，對(duì)家蠶的致死率分別為28.33%、16.67%和10.00%，而TX-12、TX-13這2個(gè)菌株在觀察期內(nèi)未發(fā)現(xiàn)致病力，對(duì)家蠶的致死率為0。不同白僵菌菌株對(duì)家蠶的致病力依次排序?yàn)镃A-12＞CA-15＞TX-1＞CA-1＞CA-6＞TX-12＝TX-13。

表3 不同白僵菌菌株對(duì)家蠶的致病力（2～3齡）

根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，我們進(jìn)一步做菌株篩選試驗(yàn)。選取初篩致病力較高的菌株CA-12和對(duì)照菌株BJ，分別配成濃度為1×102、1×103、1×104、1×105、1×106個(gè)／mL的孢子懸浮液，將2齡起蠶浸漬2 s后正常飼養(yǎng)，計(jì)算LC50，結(jié)果顯示CA-12菌株的LC50為8.48×105個(gè)／mL，對(duì)照菌株BJ的LC50為1.32× 105個(gè)／mL，說(shuō)明對(duì)照球孢白僵菌的家蠶致病力較強(qiáng)（表4）。

表4 高致病性球孢白僵菌LC50測(cè)定

3 討論

白僵菌通過(guò)ITS法能夠準(zhǔn)確快速地鑒定出多數(shù)菌株的種名，但對(duì)于個(gè)別核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中的相同序列較多時(shí)，需結(jié)合序列比對(duì)分析或結(jié)合形19:34 2017/5/17態(tài)學(xué)、生化等表型方法進(jìn)行鑒定。本研究通過(guò)ITS序列分析對(duì)不同來(lái)源的菌株進(jìn)行鑒定，53個(gè)菌株中有47個(gè)為球孢白僵菌屬，3個(gè)為蠟蚧屬（家蠶蠟蚧頭孢霉）［22-23］，3個(gè)為擬青霉屬（家蠶灰僵菌），表明感染家蠶表現(xiàn)出白僵病癥狀的病原種類呈多樣性，球孢白僵菌是主要病原菌。另外，發(fā)現(xiàn)淳安地區(qū)球孢白僵菌間的ITS的差異位點(diǎn)較多，推測(cè)是由于白僵菌在自然群體中存在較高的遺傳多樣性或物種變異所導(dǎo)致，與該地區(qū)屬于山林地區(qū)，野外昆蟲(chóng)數(shù)量較多有關(guān)。7個(gè)分離菌株（CA-1、CA-12、CA-15、CA-6、TX-1、TX-12、TX-13）在相同的培養(yǎng)條件下，菌落形態(tài)、分生孢子形態(tài)等生物學(xué)性狀均存在一定的差異，即使來(lái)自同一蠶區(qū)淳安縣的白僵菌菌株CA-1、CA-12、CA-15之間，生物學(xué)性狀也存在差別，說(shuō)明相同蠶區(qū)的家蠶白僵病病原存在差異，與家蠶白僵病病原的復(fù)雜性一說(shuō)相吻合［24］。

家蠶的致病力是反映菌株性狀的重要指標(biāo)之一。通過(guò)家蠶致病力試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同種類、不同來(lái)源的7個(gè)分離菌株對(duì)家蠶的致病力存在差異，家蠶致病力依次為CA-12（球孢白僵菌屬，76.67%）＞CA-15（球孢白僵菌屬，53.33%）＞TX-1（蠟蚧屬，28.33%）＞CA-1（球孢白僵菌屬，16.67%）＞CA-6（擬青霉屬，10.00%）＞TX-12（蠟蚧屬，0）＝TX-13（蠟蚧屬，0），球孢白僵菌對(duì)家蠶的致病力最強(qiáng)，病勢(shì)也最急，其他菌株對(duì)家蠶的致病力有高有低［25］。同時(shí)，在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)同樣來(lái)源于桐鄉(xiāng)地區(qū)的蠟蚧屬菌株TX-1（L.attenuatum）、TX-12（L.saksenae）和TX-13（L.aphanocladii）對(duì)家蠶的致病力存在較大的差異。根據(jù)文獻(xiàn)［22］可知，蠟蚧菌的半致死濃度LC50為2.55×106個(gè)／mL，本試驗(yàn)配制的蠟蚧屬菌株孢子濃度為1×107個(gè)／mL，所配溶液濃度高于半致死濃度，而只發(fā)現(xiàn)TX-1菌株對(duì)家蠶有致病性，TX-12和TX-13菌株回感沒(méi)有使家蠶發(fā)病，推測(cè)蠟蚧菌不同的“種”對(duì)家蠶的致病性有差異。

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S884.3＋1

A

1007-0982（2015）03-0032-06

2015-04-21；接受日期:2015-06-15

杭州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)20091832B09）。

苘娜娜（1983—），女，山東威海，碩士研究生，農(nóng)藝師。E?mail：49449341＠qq.com

魯興萌，男，教授，博士生導(dǎo)師。Tel：0571-88982305，E?mail：xmlu＠zju.edu.cn