洪志華周 云

淮山藥灌胃預(yù)處理對大鼠腎臟缺血再灌注損傷保護(hù)作用的實驗研究

洪志華1周 云2

目的 探討淮山藥灌胃預(yù)處理對大鼠腎臟缺血再灌注損傷的可能保護(hù)作用。方法 48只3～4周齡雄性SD大鼠隨機(jī)分為缺血再灌注淮山藥灌胃預(yù)處理組（淮山藥組，n=24）和缺血再灌注無菌生理鹽水灌胃對照組（生理鹽水組，n=24）。淮山藥組、生理鹽水組在缺血再灌注損傷前連續(xù)灌胃5天。分別于再灌注損傷后2、12、24、48h四個時間點隨機(jī)選淮山藥組、生理鹽水組各6只大鼠再次手術(shù)行下腔靜脈采血和收獲腎臟標(biāo)本。測定血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）以及血清丙二醛（MDA）含量。腎組織常規(guī)病理切片H-E染色光鏡下參照Paller評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分，TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果 再灌注后12、24、48h，同時間點淮山藥組與生理鹽水組比較，其血清Scr、BUN含量顯著下降 [BUN 12h：（15.30±2.60）mmol/L比（22.07±4.57）mmol/L，24h：（19.56±3.89）mmol/L比（34.75±6.32）mmol/L，48h：（14.72±2.99）mmol/L比（20.16±2.40）mmol/L；Scr 12h：（56.38±8.70）μmol/L比（98.72±12.37）μmol/L，24h：（81.53±10.17）μmol/L比（128.52±17.30）μmol/L；48h：（55.01±9.71）μmol/L比（80.72±11.13）μmol/L；P＜0.05，P＜0.01]。再灌注后2、12、24h，淮山藥組血清MDA含量較同時間點生理鹽水組顯著下降[2h：（4.74±0.50）nmol/L比（7.45±1.03）nmol/L，12h：（6.19±0.68）nmol/L比（10.52±1.57）nmol/L，24h：（5.16±0.58）nmol/L比（6.93±1.32）nmol/L；P＜0.05，P＜0.01]。腎組織學(xué)評分于再灌注后12、24、48h，同時間點淮山藥組較生理鹽水組有顯著減低 [12h：（7.50±0.55）分比（8.50±0.55）分，24h：（6.17±0.75）分比（7.50±1.05）分，48h：（4.17±0.75）分比（5.50±1.05）分；P＜0.05]。再灌注后2h就有凋亡細(xì)胞出現(xiàn)，12h時可見大量凋亡細(xì)胞脫落到腎小管腔中，此時間點淮山藥組凋亡細(xì)胞數(shù)較生理鹽水組明顯減少[（10.17±2.14）個/HPF比（13.67±2.94）個/HPF，P＜0.05]。結(jié)論 淮山藥灌胃預(yù)處理可以減輕缺血再灌注模型大鼠腎組織氧化損傷和減少腎小管上皮細(xì)胞凋亡的發(fā)生，降低血清Scr、BUN和MDA水平，有效保護(hù)腎功能。

大鼠；腎臟；缺血再灌注損傷；淮山藥；灌胃預(yù)處理

腎缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）是急性腎功能衰竭發(fā)生主要原因之一。其損傷機(jī)制復(fù)雜，涉及氧自由基氧化損傷作用、鈣超載、能量代謝障礙、細(xì)胞凋亡等多種因素，目前缺乏有效地防治手段。山藥是最常用的中藥之一，藥理作用有抗衰老；抗氧化、抗自由基活性等[1-2]。本實驗制備大鼠腎缺血再灌注損傷模型，通過對腎組織形態(tài)學(xué)、肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、丙二醛（MDA）和凋亡的測定，探討淮山藥對腎IRI的影響及其臨床防治意義。

1 材料與方法

1.1 藥物及動物 48只3～4周健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量90～110g，由蘇州大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（蘇）2002-0008。術(shù)前予自由采食飲水、恒溫恒濕等規(guī)范化飼養(yǎng)。

1.2 藥物及試劑 淮山藥（江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號05707107），MDA試劑盒（南京建成生物工程研究所），原位凋亡試劑盒（德國Boehringer公司）。

1.3 分 組 48只健康雄性SD大鼠，隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為缺血再灌注淮山藥灌胃預(yù)處理組（淮山藥組，n=24）和缺血再灌注無菌生理鹽水灌胃對照組（生理鹽水組，n=24）。

1.4 模型制備前處理 淮山藥組大鼠模型制備前予淮山藥灌胃，濃度0.5g/mL、劑量20mL/kg，連續(xù)5天；生理鹽水組大鼠模型制備前予生理鹽水灌胃，劑量為20mL/kg，連續(xù)5天。術(shù)前均在蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心飼養(yǎng)（環(huán)境溫度24～26℃，相對濕度50%～ 65%），可隨時采食和飲水。

1.5 模型制備 兩組大鼠術(shù)前12h禁食，不禁水（手術(shù)室溫度25～28℃，相對濕度55%～60%），1%戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔注射麻醉，常規(guī)消毒、鋪巾，正中腹部切口，游離雙側(cè)腎蒂血管。用無損傷動脈夾阻斷雙腎血流45min后恢復(fù)血流，關(guān)閉腹腔。術(shù)后亦均在蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心飼養(yǎng)，可隨時采食和飲水。

1.6 標(biāo)本采集 兩組分別于開放血流再灌注后2、12、24、48h四個時間點，每個時間點隨機(jī)選取兩組各6只大鼠，再次手術(shù)，原切口進(jìn)腹采血和收獲腎臟標(biāo)本待測。

1.7 檢測指標(biāo)和方法 血液標(biāo)本在全自動生化分析儀上測血清Scr和BUN；應(yīng)用MDA試劑盒，通過硫代巴比妥酸鹽法檢測血清MDA值；腎組織常規(guī)病理切片H-E染色光鏡下參照Paller[3]評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分；原位凋亡試劑盒TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡。

2 結(jié)果

2.1 淮山藥組、生理鹽水組血清BUN、Scr指標(biāo)比較

缺血再灌注損傷后大鼠血清BUN、Scr水平均有不同幅度的上升?；瓷剿幗M于12、24、48h血清BUN、Scr水平較同時間點生理鹽水組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。見表1～2。

表1 兩組血清尿素氮（BUN）比較（mmol/L，±s）

表1 兩組血清尿素氮（BUN）比較（mmol/L，±s）

注：與生理鹽水組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

生理鹽水組淮山藥組6 6 7.08±1.00 6.09±0.70 22.07±4.57 15.30±2.60* 34.75±6.32 19.56±3.89** 20.16±2.40 14.72±2.99*

表2 兩組血清肌酐（Scr）比較（μmol/L，±s）

表2 兩組血清肌酐（Scr）比較（μmol/L，±s）

注：與生理鹽水組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

生理鹽水組淮山藥組6 6 46.80±3.69 34.23±5.08 98.72±12.37 56.38±8.70** 128.52±17.30 81.53±10.17** 80.72±11.13 55.01±9.71*

2.2 淮山藥組、生理鹽水組血清MDA含量比較 缺血再灌注損傷后大鼠血清MDA水平均有不同幅度的上升?；瓷剿幗M于再灌注后2、12、24h，血清MDA的水平與同時間點的生理鹽水組比較明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），見表3。

表3 兩組血清丙二醛（MDA）比較（nmol/mL，±s）

表3 兩組血清丙二醛（MDA）比較（nmol/mL，±s）

注：與生理鹽水組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

只數(shù) 缺血再灌注時間組別生理鹽水組淮山藥組6 6 2h 7.45±1.03 4.74±0.50** 12h 10.52±1.57 6.19±0.68** 24h 6.93±1.32 5.16±0.58* 48h 5.89±1.21 5.05±0.70

2.3 腎組織形態(tài)學(xué)評分比較 缺血再灌注損傷后大鼠腎組織均可見不同程度的損害征象：腎小管擴(kuò)張、輪廓結(jié)構(gòu)欠清、細(xì)胞變扁、胞質(zhì)疏松著色淺、核濃縮空泡變性，腎小管內(nèi)有脫落細(xì)胞及管型形成，間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤及充血（圖1，封四）?；瓷剿幗M組織學(xué)評分于再灌注后12h、24h、48h較同時間點生理鹽水組明顯低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

表4 兩組腎組織形態(tài)學(xué)評分（分，±s）

表4 兩組腎組織形態(tài)學(xué)評分（分，±s）

注：與生理鹽水組比較，*P＜0.05

組別生理鹽水組淮山藥組只數(shù) 缺血再灌注時間6 6 2h 5.83±0.75 5.17±0.75 12h 8.50±0.55 7.50±0.55* 24h 7.50±1.05 6.17±0.75* 48h 5.50±1.05 4.17±0.75*

2.4 淮山藥組、生理鹽水組腎小管上皮細(xì)胞凋亡比較 細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特點是細(xì)胞體積變小，胞膜氣泡化，核固縮、核碎裂，細(xì)胞皺縮、胞質(zhì)凝聚，“凋亡小體”形成，再灌注后2h就有凋亡細(xì)胞出現(xiàn)，12h時可見大量凋亡細(xì)胞脫落到腎小管腔中（圖2，封四）。缺血再灌注后12h生理鹽水組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加。缺血再灌注后12h淮山藥組凋亡細(xì)胞數(shù)較生理鹽水組有明顯減少（P＜0.05），見表5。

表5 兩組TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)（個/HPF，±s）

表5 兩組TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)（個/HPF，±s）

注：與生理鹽水組比較，*P＜0.05

生理鹽水組淮山藥組6 6 13.67±2.94 10.17±2.14*

3 討 論

組織、器官缺血一段時間，當(dāng)血流重新恢復(fù)后細(xì)胞功能代謝障礙及其結(jié)構(gòu)損壞的程度較缺血時進(jìn)一步加重，稱之為缺血再灌注損傷。腎臟作為高灌注器官，對缺血缺氧比較敏感，非常容易發(fā)生缺血再灌注損傷。造成腎缺血再灌注損傷的相關(guān)因素很多，研究[4]表明，腎缺血再灌注損傷時氧自由基大量產(chǎn)生，自由基能使生物膜的多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化而生成脂質(zhì)過氧化物，脂質(zhì)過氧化物分解時產(chǎn)生MDA能使DNA、蛋白質(zhì)發(fā)生交連造成細(xì)胞損傷。血清MDA水平可間接反應(yīng)組織中自由基含量及脂質(zhì)過氧化程度，顯示氧自由基對于機(jī)體細(xì)胞受攻擊的程度[5]。許多實驗研究表明[6-10]，中藥可減少氧自由基的生成，降低過氧化脂質(zhì)，抑制細(xì)胞凋亡，因此具有減輕缺血再灌注引起的組織損傷。缺血再灌注后2、12、24h，淮山藥組大鼠血清MDA水平較同時間點生理鹽水組有明顯的降低（P＜0.05，P＜0.01）。顯示腎功能的血清BUN、Scr水平，在缺血再灌注淮后12、24、48h淮山藥組與同時間點生理鹽水組相比也有明顯的差異（P＜0.05，P＜0.01）。光鏡下組織學(xué)的評分顯示淮山藥組大鼠腎組織較同時間點生理鹽水組大鼠腎組織損傷程度輕（P＜0.05）。以上均表明淮山藥通過抗氧化、抗自由基活性等減輕了腎缺血再灌注損傷，有效保護(hù)腎功能。也有報道[11]山藥多糖通過上調(diào)腎組織缺氧誘導(dǎo)因子-1α表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)，改善缺血再灌注腎組織缺血缺氧，從而保護(hù)腎功能。這可能是山藥多糖防治腎缺血再灌注損傷的又一機(jī)制。

本實驗中我們通過對凋亡細(xì)胞的檢測，同樣發(fā)現(xiàn)腎臟發(fā)生缺血再灌注損傷后其腎組織中有大量的凋亡細(xì)胞出現(xiàn)，缺血再灌注損傷后12h，淮山藥組的凋亡細(xì)胞數(shù)較生理鹽水組明顯減少，說明淮山藥灌胃預(yù)處理可以減少腎缺血再灌注損傷后腎小管細(xì)胞凋亡的發(fā)生，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)淮山藥灌胃預(yù)處理可以預(yù)防和減輕腎組織氧化物損傷程度、減少細(xì)胞凋亡，從而有效地保護(hù)了腎功能。近年來，應(yīng)用中草藥促進(jìn)血管再生研究取得了一定成效。中草藥治療臟器缺血性疾病療效明顯，促血管再生可能是其作用主要機(jī)制之一?；瓷剿幨欠褚材軌蛲ㄟ^促進(jìn)腎臟血管再生，減少腎臟再灌注后期的無灌流現(xiàn)象，加速腎組織的修復(fù)，也有待進(jìn)一步研究。

［1］趙彥青，王愛鳳.山藥的藥理研究進(jìn)展［J］.中醫(yī)研究，2000，13（5）：49-51.

［2］李志強(qiáng)，曹文富.山藥及其主要活性成分藥理作用研究進(jìn)展［J］.中國老年學(xué)雜志，2013，33（8）：1975-1976.

［3］Paller MS，Hoidal JR，F(xiàn)erris TF.Oxygen free radicals in ischemic acute renal failure in the rat［J］.J Clin Invest，1984，74（4）：1156-1164.

［4］Donnahoo KK，Shames BD，Harken AH，etal.Review article：the role of tumornecrosis factor in renal ischemia reperfusion injury［J］.JUrol，1999，162（1）：196-203.

［5］Petrache I，Birukova A，Ramirez SI，et al.The role of the microtubules in tumor necrosis factor-alpha-induced endothelial cell permeability［J］.Am JRespir CellMol Biol， 2003，28（5）：574-581.

［6］尚立芝，崔明霞，王建人.川芎嗪預(yù)處理對大鼠腎臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用［J］.河南醫(yī)學(xué)研究，2006，15（3）：215-217.

［7］王洋，王善政，何偉.中藥水蛭對肺缺血再灌注后細(xì)胞的抗凋亡作用［J］.山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2001，25（2）：139-140.

［8］王東，朱繼業(yè)，冷希圣.參附注射液抗肝臟缺血/再灌注損傷的實驗研究［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2006，26（S1）：61-63.

［9］曹翠麗，馬常升，馬文領(lǐng).中藥水蛭對缺血/再灌注后腦細(xì)胞的抗凋亡作用［J］.河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2000，21（4）：193-195.

［10］李全輝，紀(jì)志鵬，葛運飛，等.三七總皂苷對大鼠肝缺血再灌注損傷的保護(hù)作用［J］.浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2014，24（8）：665-667.

［11］唐群，吳華，雷久士，等.山藥多糖對腎缺血再灌注損傷大鼠腎組織缺氧誘導(dǎo)因子-1α和血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的的影響［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2014，21（2）：56-62.

（收稿：2014-12-11 修回：2015-03-09）

Protective Effect of Pretreatment w ith Rhizome Dioscoreae Lavage on Renal Ischem ia-reperfusion Injury inRats

HONG Zhihua1,ZHOU Yun2. 1 Department of Pediatric Surgery,Jiaxing Maternity and Child Health Care Hospital,Jiaxing(314000),China;2 Department of Pediatric Surgery,Children's Hospital,Soochow University, Suzhou(215003),China

Objective To investigate the protective effect of pretreatment with Rhizome Dioscoreae on alleviating ischemia-reperfusion injury in rats.M ethods Fifty-four Spargue-Dawley rats were random ly divided into 3 groups: sham operation group（n=6）,ischemia-reperfusion group with pretreatment of Phizoma Dioscoreae via intragastric administration（Rhizoma dioscoreae group,n=24）,and ischemia-reperfusion group with aseptic normal saline lavege（aseptic saline group,n=24）.The rats in Rhizoma Dioscoreae group and aseptic saline group were pretreated with rhizoma Dioscoreae and placebo aseptic normal saline for 5d,respectively before being subjected to bilateral renal vascular occlusion for 45min.At 2,12,24 and 48h after reperfusion,every 6 rats in each group were random ly euthanized for blood sampling and kidney harvesting.The blood urea nitrogen（BUN）and serum creatinine（Scr）and serum malondialdehyde（MDA）were measured.Renal morphologic changes were scored with Paller's criterionon hematoxylin and eosin（HE）stained sections.Renal tubular cell apoptosis were detected with terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling procedure（TUNEL）.Results After 12,24,and 48h of reperfusion,the Scr and BUN value in Rhizoma Dioscoreae group were significantly lower than those in aseptic saline group（BUN 12h:15.3±2.60mmol/L vs 22.07±4.57mmol/L,24h:19.56±3.89mmol/L vs 34.75±6.32mmol/L,48h: 14.72±2.99mmol/L vs 20.16±2.40mmol/L;Scr 12h:56.38±8.72mmol/L vs 98.72±12.37mmol/L,24h:81.53± 10.17mmol/L vs 128.50±17.30mmol/L,48h:55.01±9.71mmol/L vs 80.72±11.13mmol/L;P＜0.05 or P＜0.01).At 2,12, and 24h,the serum content of MDA in Rhizoma Dioscoreae group were significantly lower than those in aseptic saline group（2h:4.74±0.50nmol/L vs 7.45±1.03nmol/L,12h:6.19±0.68nmol/L vs 10.52±1.5nmol/L,24h:5.16± 0.58nmol/L vs 6.93±1.32nmol/L;P＜0.05 or P＜0.01）.Renal apoptosis score at 12,24,and 48h of reperfusion in Rhizoma Dioscoreae group were less than that in aseptic saline group（12h:7.50±0.55 vs 8.50±0.55,24h:6.17±0.75 vs 7.00±1.05;48h:4.17±0.75 vs 5.50±1.05;P＜0.05）.The tubular cell apoptosis was detected in the kidney at 2h after ischemia-reperfusion injury and reached the highest level at 12h（Rhizoma Dioscoreae group 10.17±2.14/HPF vs aseptic saline group 13.67±2.94/HPF,P＜0.05）.Conclusion The pretreatment of Rhizoma Dioscoreae lavage in rats results in lessening the oxidative damage and apoptosis,lowering the level of Scr,BUN and MDA,thereby protecting kidney from ischemia-reperfusion injury.

rats;kidney;ischemia-reperfusion injury;Rhizoma Dioscoreae;lavage

1浙江省嘉興市婦幼保健院外科（嘉興 314000）；2江蘇省蘇州市兒童醫(yī)院小兒泌尿外科（蘇州 215003）

周云，E-mail：cloudyzy@jsmail.com.cn