王甲甲，鐘佳伶，張娟，黃文芳

(四川省人民醫(yī)院，成都610072)

肝臟手術(shù)中缺血再灌注損傷的程度直接影響手術(shù)后肝臟功能及肝臟的存活力，且由于肝臟對缺血比較敏感，因此，有必要對如何減輕肝臟缺血再灌注損傷作深入地探討［1，2］。槲皮素是常見的類黃酮物質(zhì)之一，很多研究已證實(shí)槲皮素可以通過直接清除活性氧自由基、抑制LDL及DNA氧化損傷等途徑發(fā)揮抗氧化作用，但對其在缺血再灌注損傷中的應(yīng)用報(bào)道不多［3～5］。2013年 4～8月，本研究利用大鼠肝臟缺血再灌注模型來評(píng)價(jià)槲皮素對缺血再灌注損傷不同時(shí)限肝臟功能和形態(tài)學(xué)的影響，并對其作用機(jī)制作初步探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康雄性Wistar大鼠80只，體質(zhì)量 (250±20)g，被隨機(jī)分為4組:正常對照組5只、假手術(shù)組25只、缺血再灌注組25只和槲皮素組25只，后3組再按不同灌注時(shí)限(0、6、12、24、72 h)分為5個(gè)亞組，每個(gè)亞組5只。

1.2 動(dòng)物模型的建立 對照組:斷頸法處死后直接入腹切肝;假手術(shù)組:3%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，經(jīng)尾靜脈輸注50 mL/kg生理鹽水，開腹后僅游離肝蒂，不作阻斷;缺血再灌注組:麻醉及輸液同假手術(shù)組，解剖肝門，鉗夾肝蒂45 min后再復(fù)流;槲皮素預(yù)處理組:術(shù)前經(jīng)尾靜脈輸注50 mL/kg槲皮素注射液，麻醉及手術(shù)方法同缺血再灌注組。

1.3 標(biāo)本收集 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，分別收集大鼠的血液于無抗凝劑添加管中，待其凝固后于常溫離心機(jī)上2 000 r/min，離心5 min收集血清，并分裝保存于-20℃冰箱。摘取其肝臟，用剪刀剪成小塊分裝于2 mL凍存管中，置于-80℃冰箱保存或浸泡于10%的甲醛溶液中固定、石蠟包埋、常規(guī)切片備檢。

1.4 檢測方法 ①肝功能的檢測:新鮮大鼠血清于全自動(dòng)生化分析儀上檢測ALT、AST水平;②細(xì)胞因子水平的檢測:用競爭抑制ELISA法檢測血清中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 水平，IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α ELISA試劑盒均購自 R＆D公司，具體操作按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各樣品中細(xì)胞因子的含量;③肝組織病理學(xué)分析:HE染色法檢測各組肝組織的形態(tài)學(xué)變化情況;④肝臟細(xì)胞凋亡情況的檢測:采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的d-UTP缺口末端標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)法檢測肝臟細(xì)胞的凋亡情況。切片在400倍光鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)6個(gè)視野，計(jì)算每100個(gè)細(xì)胞中凋亡細(xì)胞所占比例，即凋亡指數(shù)(AI)。TUNEL試劑盒購自美國Roche公司。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)檢驗(yàn)如符合正態(tài)分布，以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組ALT、AST及血清細(xì)胞因子水平比較 缺血再灌注組血清中ALT、AST、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平與對照組或假手術(shù)組同時(shí)間點(diǎn)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)，且以12 h組差異最明顯;槲皮素組血清中 ALT、AST、IL-1β、IL-8、TNF-α 水平與缺血再灌注組同時(shí)間點(diǎn)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)。見表1。

表1 各組血清ALT、AST及細(xì)胞因子水平比較(±s)

表1 各組血清ALT、AST及細(xì)胞因子水平比較(±s)

注:與對照組或假手術(shù)組同時(shí)間點(diǎn)比較，*P＜0.05;與缺血再灌注組同時(shí)間點(diǎn)比較，#P＜0.05。

組別 n ALT(U/L) AST(U/L) IL-1β(μg/mL) IL-6(μg/mL) IL-8(μg/mL) TNF-α(μg/mL)對照組 5 36.42± 5.21 45.27±4.33 31.75± 6.28 51.42± 5.74 62.51±8.25 24.87± 4.11假手術(shù)組0 h 5 35.49± 4.16 44.26± 4.02 32.25± 4.05 52.35± 6.01 64.33± 5.77 25.91± 3.60 6 h 5 36.35± 3.85 43.65± 4.75 33.05± 5.73 49.25± 6.94 65.15± 5.16 24.47± 5.64 12 h 5 36.23± 6.72 44.86± 6.24 34.28± 5.41 49.41± 7.01 67.21± 7.47 26.42± 4.05 24 h 5 36.57± 3.86 47.25± 6.22 32.42± 5.82 50.25± 7.97 66.85± 6.48 25.26± 4.22 72 h 5 37.61± 4.70 46.49± 5.15 36.25± 6.65 51.35± 4.73 65.85± 5.49 23.92± 6.08缺血再灌注組0 h 5 92.54± 9.42* 116.27±9.05* 54.68± 5.63* 104.59± 6.35* 121.07± 5.77* 43.33± 8.17*6 h 5 103.21±10.44* 119.35±11.35* 104.05±10.77* 116.36± 9.85* 126.91± 7.09* 94.76± 8.03*12 h 5 125.92±11.88* 135.47±15.46* 122.28± 9.47* 135.52± 9.56* 142.35±11.68* 135.65±12.29*24 h 5 110.35±12.51* 121.21±14.57* 109.66± 9.05* 119.69±11.47* 119.81±12.56* 127.51±12.99*72 h 5 105.18± 9.56* 118.35±10.09* 102.38± 5.42* 116.59±10.27* 118.45±11.06* 109.44±12.49*槲皮素組0 h 5 52.49± 6.47# 64.45±7.21# 40.40±5.23# 95.44± 6.77 71.50±8.74# 36.45± 8.91#6 h 5 59.47± 6.01# 67.71±8.42# 71.41±8.06# 109.24± 7.66 84.37±9.06# 62.38± 5.96#12 h 5 63.32± 8.49# 71.65± 8.75# 86.50± 8.42# 127.58± 9.62 99.46± 8.05# 91.26±13.05#24 h 5 57.35± 6.35# 68.39±7.11# 82.25±6.75# 112.44± 8.05 89.25±6.99# 86.72± 9.75#72 h 5 51.45± 8.28# 67.75± 4.92# 76.48± 8.06# 109.86± 8.75 85.49±10.59# 82.36±11.50#

2.2 肝臟形態(tài)學(xué)變化 對照組及假手術(shù)組肝細(xì)胞光鏡下觀察形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，未見明顯細(xì)胞水腫。缺血再灌注組肝臟外觀肉眼無明顯改變，光鏡下肝細(xì)胞明顯氣球樣變，肝竇受壓，無明顯肝索結(jié)構(gòu)，匯管區(qū)有大量的淋巴細(xì)胞浸潤，且伴有部分灶狀壞死;再灌注后12 h，壞死程度最嚴(yán)重，細(xì)胞形態(tài)變化最明顯。槲皮素組與缺血再灌注組同時(shí)間點(diǎn)相比，肝細(xì)胞僅輕度水腫、疏松化，肝竇部分受壓，但未見肝細(xì)胞壞死。

2.3 TUNEL染色結(jié)果 TUNEL染色肝臟凋亡細(xì)胞的胞核呈黃褐色，非凋亡細(xì)胞的胞核呈藍(lán)紫色。各組肝臟TUNEL染色的AI值分別如下:對照組為(2.05±0.75)%;假手術(shù)組0、6、12、24、72 h 分別為(3.15 ±1.05)%、(4.35±1.15)%、(3.65±0.55)%、(3.65±0.65)%、(3.55±0.55)%，各時(shí)間點(diǎn)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 均 ＞0.05);缺血再灌注組 0、6、12、24、72 h分別為(17.15±2.45)%、(26.25±3.75)%、(23.75±4.65)%、(19.15±3.05)%、(18.45±2.25)%，6 h時(shí)最高，組內(nèi)與其他時(shí)間點(diǎn)相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均＜0.05);槲皮素組0、6、12、24、72 h 分別為(10.85 ±2.05)%、(12.45±1.95)%、(11.25±0.85)%、(11.35±0.95)%、(10.75±1.45)%，與缺血再灌注組同時(shí)間點(diǎn)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)。

3 討論

肝臟缺血再灌注損傷的病理生理機(jī)制非常復(fù)雜，目前尚未完全闡明。大多數(shù)研究認(rèn)為缺血再灌注損傷與氧自由基生成過多、鈣超載、炎癥反應(yīng)、能量代謝障礙、細(xì)胞凋亡等有關(guān)［6～9］。槲皮素及其衍生物是植物界分布廣泛，具有多種生物學(xué)功能的黃酮類化合物，其生物學(xué)作用包括抗氧化及清除自由基、抗腫瘤、抗炎、抗纖維化作用等［10～12］。目前，關(guān)于槲皮素與缺血再灌注損傷之間的研究并不多，且機(jī)制不明。本研究旨在探討槲皮素對大鼠肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，也為解決肝臟缺血再灌注損傷提供新的思路，為臨床合理利用槲皮素提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

在本研究中，我們首先成功地建立了大鼠肝臟缺血再灌注損傷模型，并對大鼠缺血再灌注損傷及槲皮素處理后0、6、12、24、72 h 5 個(gè)時(shí)間點(diǎn)大鼠血清中ALT、AST的水平進(jìn)行檢測。ALT、AST是非特異性的細(xì)胞內(nèi)酶，ALT主要存在于肝細(xì)胞質(zhì)中，AST在心肌細(xì)胞內(nèi)含量最高。正常情況下二者血清中含量很低，當(dāng)肝細(xì)胞膜通透性增高時(shí)釋放入血，這兩者常用來反映肝細(xì)胞損傷的程度［13，14］。本研究結(jié)果顯示，肝臟發(fā)生缺血再灌注損傷后12 h血清中ALT、AST的水平達(dá)到峰值，之后即有所下降。與缺血再灌注組同時(shí)間點(diǎn)相比，槲皮素組血清中ALT、AST的水平顯著下降。光鏡下通過對大鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)的觀察發(fā)現(xiàn)，對照組和假手術(shù)組無明顯的形態(tài)學(xué)變化;在缺血再灌注組，肝臟細(xì)胞有大量的壞死，尤以12 h時(shí)間點(diǎn)最為嚴(yán)重;而在槲皮素組的相同時(shí)間點(diǎn)，肝臟細(xì)胞的壞死程度明顯減輕。這些研究結(jié)果從功能學(xué)和形態(tài)學(xué)方面初步表明槲皮素對大鼠肝臟缺血再灌注損傷有保護(hù)作用。

目前，關(guān)于缺血再灌注損傷與氧自由基生成過多方面的報(bào)道很多［15，16］，而關(guān)于缺血再灌注損傷與炎癥因子、細(xì)胞凋亡方面的報(bào)道較少，該研究即著重從這兩方面對槲皮素保護(hù)大鼠肝臟缺血再灌注損傷的作用機(jī)制進(jìn)行闡述。TNF-α是具有多種生物學(xué)效應(yīng)的重要促炎因子之一，其釋放較早，且可激活細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)白介素和其他次級(jí)炎癥介質(zhì)的合成與釋放［17］。為了進(jìn)一步探討槲皮素保護(hù)肝臟作用是否與炎癥因子 IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 有關(guān)，我們對其相關(guān)性作了研究。研究發(fā)現(xiàn)，對照組和假手術(shù)組這4種炎癥因子水平較低，且跟缺血再灌注時(shí)間無明確相關(guān)關(guān)系;槲皮素可能是通過下調(diào)IL-1β、IL-8、TNF-α分泌水平發(fā)揮其保護(hù)肝臟作用。

以往人們普遍認(rèn)為，肝臟缺血再灌注損傷時(shí)細(xì)胞以壞死的方式發(fā)生死亡。如今更多的觀點(diǎn)認(rèn)為，細(xì)胞凋亡在此過程中起重要作用，凋亡已成為當(dāng)前研究肝臟缺血再灌注損傷發(fā)病機(jī)制的熱點(diǎn)之一［18］。我們對缺血再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)肝臟的AI進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)對照組與假手術(shù)組AI與時(shí)限沒有明顯相關(guān)性。在缺血再灌注組，再灌注后6 h的AI最高，且槲皮素能夠有效地減輕肝臟細(xì)胞的凋亡程度。這些結(jié)果提示槲皮素保護(hù)肝臟缺血再灌注損傷的作用可能與抗細(xì)胞凋亡有關(guān)。

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