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巴馬小型豬T2DM模型胰島素抵抗及瘦素、抵抗素水平的變化

2015-05-23 02:20:24于健鄒迪莎葉瑤周燕胡璟楊帆黃漓莉劉曉玲莫如芬
山東醫(yī)藥 2015年5期
關(guān)鍵詞:抵抗素瘦素高糖

于健,鄒迪莎,葉瑤,周燕,胡璟,楊帆,黃漓莉,劉曉玲,莫如芬

(1桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,廣西桂林541001;2桂林醫(yī)學(xué)院研究生院)

目前,2型糖尿病(T2DM)的確切發(fā)病機制仍未明確。研究發(fā)現(xiàn),脂肪細(xì)胞因子瘦素、抵抗素等與T2DM、肥胖與高胰島素血癥、胰島素抵抗(IR)密切相關(guān)[1~3]。2013年5月 ~2014年5月,我們通過構(gòu)建巴馬小型豬T2DM模型,觀察其血清瘦素、抵抗素水平變化,旨在探討巴馬小型豬T2DM模型IR及與血清瘦素、抵抗素水平的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物:健康雄性廣西巴馬小型豬10只,2~3個月齡,體質(zhì)量10~20 kg。均給予常規(guī)飲水,每日投食3次,飼養(yǎng)條件為室溫18~25℃,每日光照約12 h,相對濕度50% ~80%,有持續(xù)空氣交換。小型豬適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機分為對照組、模型組各5只。對照組普通飼料喂養(yǎng);模型組高脂高糖飼料喂養(yǎng)(高脂高糖飼料配方為:蔗糖37%、豬油10%、膽固醇2%、普通飼料51%)。喂養(yǎng)期為10個月,實驗過程中對動物的處理方法符合中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部頒發(fā)的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》。實驗藥品:瘦素、抵抗素試劑盒購自美國Phoenix Pharmaceutical公司;胰島素放射免疫分析試劑盒購自北京北方生物技術(shù)研究所;胰島素單克隆抗體購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司;豬油、蔗糖、普通飼料均購自桂林市漓源糧油飼料有限責(zé)任公司;蛋黃粉購自南通康德生物制品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 T2DM模型的構(gòu)建 根據(jù)動物體質(zhì)量稱取適量鏈脲佐菌素(STZ)溶于0.1 mol/L檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.2~4.5)中,濃度為10 g/L,禁食空腹注射STZ溶液。實驗至11個月初給予模型組小型豬腹腔注射STZ 100 mg/kg,1周后,重復(fù)上述劑量1次。對照組小型豬腹腔注射等劑量檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖液。成模標(biāo)準(zhǔn)參照1999年世界衛(wèi)生組織糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn):具有糖尿病典型癥狀(多尿、多飲、多食及消瘦),且空腹血糖(FPG)≥7.0 mmol/L或隨機血糖≥11.1 mmol/L。如無糖尿病癥狀,則需空腹和餐后血糖同時達(dá)到上述標(biāo)準(zhǔn)時,才可診斷糖尿病。

1.2.2 FPG、胰島素(FINS)、瘦素、抵抗素水平檢測

禁食過夜的小型豬前腔靜脈抽血,F(xiàn)PG采用葡萄糖氧化酶法檢測;瘦素、抵抗素采用酶聯(lián)免疫分析法檢測;胰島素放射免疫分析試劑盒檢測FINS水平。胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=FPG×FINS/22.5。

1.2.3 胰腺組織HE染色及胰島β細(xì)胞免疫組化染色 實驗結(jié)束時(12個月末),將對禁食過夜的小型豬肌肉注射速眠新(0.2~0.25 mL/kg),聯(lián)合10%水合氯醛(2 mL/kg)腹腔注射麻醉,股動脈放血處死,取胰腺組織,常規(guī)固定、脫水、石蠟包埋、切片,HE染色,光鏡下觀察。并取胰腺組織石蠟切片,胰島素單克隆抗體作免疫組化染色(按試劑盒操作步驟進(jìn)行)。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件,計量資料以±s表示,數(shù)據(jù)行正態(tài)分布檢驗;組間計量資料比較采用t檢驗,瘦素、抵抗素水平變化及與HOMA-IR的關(guān)系采用Pearson相關(guān)分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般情況比較 對照組精神狀況良好,毛發(fā)光澤,生長良好。模型組均成模,成模小型豬毛發(fā)粗糙、無光澤,精神萎靡,并出現(xiàn)多尿、多飲、多食及體質(zhì)量下降等糖尿病癥狀。高脂高糖飼料喂養(yǎng)10個月后,模型組體質(zhì)量[(86.32±5.86)kg]較對照組[(41.54±4.54)kg]升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=15.672,P <0.01)。

2.2 高脂高糖飲食對小型豬FPG、FINS及HOMAIR的影響 高脂高糖飼料喂養(yǎng)10個月后,模型組FBG、FINS及 HOMA-IR較對照組均升高(P<0.01)。見圖1。

圖1 高脂高糖飲食對小型豬FPG、FINS及HOMA-IR的影響

2.3 STZ對小型豬FPG、FINS的影響 實驗11個月初模型組腹腔注射不同劑量STZ;實驗結(jié)束時(12月末)與對照組比較,模型組FPG水平升高,F(xiàn)INS水平降低(P均<0.01),且模型組FPG穩(wěn)定維持在9.8~15.6 mmol/L水平。見圖2。

2.4 兩組胰腺組織HE染色結(jié)果比較 模型組鏡下可見胰島整體形態(tài)萎縮,邊緣不規(guī)整,細(xì)胞排列紊亂,胰島及胰島內(nèi)細(xì)胞數(shù)目均減少,部分細(xì)胞核形狀不規(guī)則,胞質(zhì)內(nèi)呈空泡變性。對照組胰島呈圓形或橢圓形,邊緣規(guī)整,與腺體緊密結(jié)合在一起,胰島及胰島內(nèi)細(xì)胞數(shù)目多,胞核清晰且胞質(zhì)豐富,整個胰腺組織結(jié)構(gòu)基本正常。

2.5 兩組胰島β細(xì)胞免疫組化染色結(jié)果比較 模型組每視野下(×200)可見散在數(shù)個胰島細(xì)胞團,細(xì)胞排列紊亂,高倍鏡(×400)下胰島β細(xì)胞團整體形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞,胞質(zhì)內(nèi)棕黃色顆粒明顯減少。對照組每視野下(×200)可見多個胰島細(xì)胞團,細(xì)胞排列整齊,高倍鏡(×400)下胰島β細(xì)胞團整體形態(tài)完整,占胰島細(xì)胞絕大部分,胞質(zhì)內(nèi)棕黃色顆粒著色深且含量豐富。

圖2 STZ注射不同時間點兩組FPG及FINS水平比較

2.6 T2DM小型豬瘦素、抵抗素水平變化及與HOMA-IR相關(guān)性分析 實驗結(jié)束時,模型組血清瘦素水平[(24.78±6.80)μg/L]較對照組[(13.68±6.04)μg/L]升高(t=2.729,P=0.026)。模型組血清抵抗素水平[(53.52±9.16)μg/L]較對照組[(38.95 ±10.39)μg/L]升高(t=0.351,P=0.047)。HOMA-IR與血清瘦素水平呈正相關(guān)(r=0.893,P=0.042),與血清抵抗素水平呈正相關(guān)(r=0.933,P=0.020)。

3 討論

本實驗首先采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)小型豬,結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組出現(xiàn)明顯肥胖,胰島素水平逐漸升高,并產(chǎn)生IR,表現(xiàn)T2DM的病理特征,與Torres-Rovira等[4]研究結(jié)果一致。為進(jìn)一步誘導(dǎo)典型T2DM模型,實驗11個月初腹腔注射STZ,結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組在高糖高脂飲食基礎(chǔ)上聯(lián)合STZ注射可以成功構(gòu)建T2DM模型,成模小型豬均表現(xiàn)出典型“三多一少”糖尿病癥狀,且FPG水平顯著上升,F(xiàn)INS水平下降。胰腺病理切片及免疫組化均提示,成模組胰島β細(xì)胞破壞嚴(yán)重,數(shù)目明顯減少。結(jié)果提示應(yīng)用高脂高糖喂養(yǎng)聯(lián)合STZ注射可以成功構(gòu)建小型豬T2DM模型,與既往研究結(jié)果一致[5]。

瘦素是由肥胖基因編碼、脂肪組織分泌的蛋白質(zhì)類激素。瘦素通過降低食欲、提高能量代謝效率、增加能量消耗、減少脂肪儲存而減輕體質(zhì)量;瘦素與脂肪代謝相關(guān)的疾病,如肥胖、T2DM、高脂血癥、高血壓、心腦血管病等密切相關(guān),是聯(lián)系免疫系統(tǒng)和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的重要橋梁。抵抗素也是一種由脂肪細(xì)胞分泌的多肽類激素,被認(rèn)為是T2DM、肥胖、IR、糖尿病血管并發(fā)癥及其血脂異常的重要聯(lián)系因素。抵抗素引起IR的機制尚不明確,可能通過降低骨骼肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、胰島β細(xì)胞胰島素敏感性,抑制肝臟糖代謝及增加FFA水平等誘導(dǎo)IR[6]。本研究結(jié)果表明,與對照組比較,模型組小型豬存在明顯IR,血清瘦素、抵抗素水平升高,且HOMA-IR與瘦素、抵抗素呈正相關(guān),與其他研究一致[7]。

綜上所述,采用高脂高糖飼料聯(lián)合STZ可以成功誘導(dǎo)巴馬小型豬T2DM動物模型,模型組小型豬血清瘦素及抵抗素水平升高,且HOMA-IR與瘦素、抵抗素呈正相關(guān)。

[1]劉才華.2型糖尿病病人血清TNF-α、瘦素及抵抗素水平與心腦血管并發(fā)癥相關(guān)性[J].青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2014,50(2):136-138.

[2]石柯,張暢,段朝軍,等.高脂性肥胖小鼠脂肪細(xì)胞大小與其血清胰島素、瘦素水平相關(guān)性研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2013,23(28):11-14.

[3]楊冰,顏海青,夏振雄.肥胖兒童血清抵抗素與胰島素抵抗的相關(guān)性[J].檢驗醫(yī)學(xué)與臨床,2014,11(12):1694-1695.

[4]Torres-Rovira L,Astiz S,Caro A,et al.Diet-induced swine model with obesity/leptin resistance for the study of metabolic syndrome and type 2 diabetes[J].Scientific World J,2012,5(2):1-8.

[5]肖國華,張素君,余堅,等.高糖高脂聯(lián)合低劑量STZ誘導(dǎo)版納微型豬2型糖尿病模型的建立[J].中南醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志,2012,40(4):351-356.

[6]張艷紅,楊偉,馮明.抵抗素與胰島素抵抗、肥胖及2型糖尿病的關(guān)系[J].中國全科醫(yī)學(xué),2010,13(36):4158-4160.

[7]黃映光,孫若飛,王昆華,等.糖尿病動物建模前后脂肪細(xì)胞因子水平變化[J].昆明理工大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2013,38(1):77-79.

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