黃俊寶，曾曉春，* ，何永明，向妙蓮，付永琦，黃友明

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 作物生理生態(tài)與遺傳育種教育部重點實驗室/農(nóng)業(yè)部雙季稻生理生態(tài)與栽培重點開放實驗室，江西 南昌 330045;2.宜春學(xué)院 生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西 宜春 336000)

脂(肪)氧合酶(lipoxidase，簡稱 LOX，EC1.13.11.12)是一類含有非血紅素離子的雙加氧酶，催化含(Z，Z)-1，4戊二烯結(jié)構(gòu)單元的不飽和脂肪酸的加氧反應(yīng)，產(chǎn)生不飽和脂肪酸的過氧化物。植物L(fēng)OX基因是一個多基因家族，其基因表達貫穿于植物生活史的整個過程。LOX的一個重要功能是催化新型植物激素茉莉酸類(Jasmonic acid，JA)的生物合成，它是JA生物合成前體亞麻酸(Linolenic acid，LNA)氧化合成13-氫過氧化亞麻酸(13-HPOT)的限速酶［1］，且其活性直接影響植物體內(nèi)JA的水平［2-3］。眾多研究表明，LOX或其催化形成的JA與植物生殖關(guān)系密切:首先，JA參與日中性植物紫萍(Spirodela polyrrhiza)［4］和短日植物牽?；?Pharbitis nil或Ipomoea nil)［5］的光周期成花反應(yīng);其次，LOX 和 JA參與擬南芥(Arabidopsis thaliana)［6-11］、玉米［12］和水稻等植物花粉育性的建成。而關(guān)于LOX和JA與光周期的關(guān)系也有報道:光敏色素系統(tǒng)調(diào)控牽?；ǔ苫ǚ磻?yīng)的JA代謝［5］;玉米葉中克隆出的ZmLOX10，其mRNA的積累嚴格受到晝夜節(jié)律的調(diào)控［13］。姚鋒先等［14］報道外施茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate，Me-JA)能提高不育光溫條件下光敏核不育水稻N5088S的花粉染色率和自交結(jié)實率，而且在幼穗分化期N5088S葉片LOX活性在可育光溫條件下高于不育光溫條件。以上研究結(jié)果提示LOX和JA可能與光敏核不育水稻育性相關(guān)，但迄今鮮見光敏核不育水稻茉莉酸途徑的研究報道。本研究擬在苗期控制條件下，研究光敏核不育水稻LOX活性的光暗期變化，以闡明光敏核不育水稻LOX的光周期變化特點，為進一步闡明光敏核不育水稻茉莉酸途徑的特征奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以長光敏核不育水稻N5088S(育性轉(zhuǎn)變臨界日長為13.75～14 h)和短光敏核不育水稻D38S(育性轉(zhuǎn)變臨界日長為13.5 h)為材料，并以三系水稻不育系東B11A、G2A和常規(guī)水稻中早25、中嘉早17、鹽粳7號為對比材料。

1.2 試驗設(shè)計

水稻幼苗培育:水稻種子于25℃浸種40 h后，置于30℃培養(yǎng)箱中催芽48 h，挑選發(fā)芽良好一致的種子播種于直徑8 cm盛有水稻土的塑料杯中，置于光照培養(yǎng)箱(4 000 lx)中培養(yǎng)20 d。培養(yǎng)過程中，塑料杯土面保持水層。光照培養(yǎng)箱中的光周期設(shè)定:設(shè)不同光暗期的3個不同的24 h光周期:12L/12D(中日，MD)、14L/10D(長日，LD)、10L/14D(短日，SD)。培養(yǎng)溫度設(shè)定:設(shè)恒溫和變溫。恒溫:光期、暗期溫度均為30℃;變溫:光期溫度30℃，暗期溫度26℃。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 LOX活性的測定 取樣:幼苗培養(yǎng)20 d后，開始取樣。在光期和暗期分別以3h的間隔時間取樣3次。每次從光照培養(yǎng)箱中取出3～5杯，從中剪取葉片，每0.2 g葉片為一份樣品，樣品重復(fù)3次，樣品稱量后立即置于液氮中速凍保存?zhèn)溆?。暗期取樣在綠光燈下進行。

LOX活性測定參照文獻［15-17］的方法。將底物溶液和待測酶粗提液置于30℃的條件下平衡15 min;取0.1 mL酶粗提液加入到2.4 mL的底物溶液中，迅速混勻;利用TU-1800紫外可見分光光度計在234 nm條件下測定反應(yīng)體系的OD值;LOX活性(鮮質(zhì)量測)以ΔOD234/(g·min)表示。

數(shù)據(jù)處理與分析:以Excel 2010進行數(shù)據(jù)整理、繪圖和分析。

1.3.2 LOX基因的RT-PCR分析 N5088S和D38S幼苗在12L/12D(光期07:00—19:00;暗期19:00—7:00)、30℃/26℃(L/D)光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 d時開始取樣，連續(xù)取樣2個光期和2個暗期，即48 h;光期從10:00開始取樣、暗期從22:00開始取樣，每隔3小時取樣1次;每次取樣時剪取生長發(fā)育進程基本一致水稻幼苗第1片完全葉，每次取樣約10片完全葉，光期取樣在自然光照條件下進行，暗期取樣在綠光燈下進行;樣品采用錫箔紙包裹、液氮速凍約1 h后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。每樣品?次重復(fù)。

表1 目標基因及其引物信息Tab.1 Target genes and their primers used for qRT-PCR analysis

應(yīng)用TransZolTMUp試劑(北京全式金)抽提樣品總RNA。按照TransZolTMUP RNA提取試劑操作說明書提取RNA，電泳檢測RNA提取效果，測定RNA濃度及純度。

采用北京全式金生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的TransScript?II All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR 合成 cDNA 第一鏈。20 μL 反轉(zhuǎn)錄體系中 RNA 量為 1.0 μg，5×TransScript?II All-in-One SuperMix for qPCR 4 μL，gDNA Remover 1 μL，補足 RNase-free Water至 20 μL，輕輕混勻后 50 ℃孵育 15 min，85℃加熱5 s失活TransScript?II RT/RI和gDNA Remover。得到的第一鏈cDNA使用內(nèi)參引物Actin進行qPCR試驗驗證cDNA質(zhì)量。

根據(jù)目標基因組全長序列，利用NCBI的引物在線設(shè)計軟件Primer-Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)設(shè)計目的基因引物，所檢測基因及其引物序列見表1。

qPCR使用北京全式金公司TransStart?Top Green qPCR SuperMix試劑盒。20 μL反應(yīng)體系含50 ng cDNA，10 μL TransStart Top Green qPCR SuperMix(2×)，0.4 μL 正、反向引物(10 μmol/L)，補足 ddH2O至20 μL。擴增反應(yīng)在Roche LightCycler?96系統(tǒng)上進行，反應(yīng)條件設(shè)置為:95℃預(yù)變性30 s;95℃變性5 s和60℃退火15 s，72℃延伸10 s，45個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后做溶解曲線，檢測引物特異性。每份樣品3次重復(fù)。

目標基因的表達水平采用2-ΔΔCt方法［18］進行相對定量。數(shù)據(jù)處理和繪圖采用Excel 2010軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 晝夜恒溫和不同光周期條件下光敏核不育系與常規(guī)稻幼苗葉片LOX活性的光暗期變化

在12L/12D恒溫條件下，光敏核不育系N5088S與D38S苗期葉片LOX活性整體水平明顯高于常規(guī)水稻中早25、鹽粳7號和中嘉早17及三系水稻不育系G2A和東B11A(圖1)。光敏核不育水稻葉片LOX活性呈現(xiàn)明顯的光期低暗期高的特征，但N5088S與D38S葉片LOX活性在整體水平和晝夜變化上均無顯著差異(圖1)。常規(guī)稻和三系水稻不育系的晝夜LOX活性無顯著差別，且各品種間LOX活性在整體水平和晝夜變化上也無顯著差異，故后續(xù)試驗僅用常規(guī)稻中早25做對照。

圖1 12L/12D恒溫條件下水稻苗期葉片中LOX活性的光暗期變化Fig.1 Diurnal fluctuation of LOX activity in rice seedling leaves at constant temperature and 12L/12D photoperiod

圖2 14L/10D恒溫條件下光敏核不育系與常規(guī)稻幼苗葉片中LOX活性的光暗期變化Fig.2 Diurnal fluctuation of LOX activity in PGMS and conventional rice seedling leaves at constant temperature and 14L/10D photoperiod

從圖2和圖3可看出，當(dāng)光暗期溫度保持恒定時，LD和SD下，長光敏核不育系N5088S和短光敏核不育系D38S幼苗葉片LOX活性均呈現(xiàn)暗期高光期低的特征，而常規(guī)稻中早25幼苗葉片的LOX活性在光暗期無明顯差別;且暗期光敏核不育水稻LOX活性顯著高于常規(guī)稻。

2.2 晝夜變溫和不同光周期條件下光敏核不育系與常規(guī)稻幼苗葉片LOX活性的光暗期變化

由圖4、圖5和圖6可知，當(dāng)晝夜處于變溫條件時，LD、SD和MD 3個不同光周期條件下，長光敏核不育系N5088S和短光敏核不育系D38S幼苗葉片LOX活性均呈現(xiàn)暗期高光期低的特征，而常規(guī)稻中早25幼苗葉片LOX活性光暗期無明顯差別。暗期光敏核不育水稻LOX活性顯著高于常規(guī)稻。

圖3 10L/14D恒溫條件下光敏核不育系與常規(guī)稻幼苗葉片中LOX活性的光暗期變化Fig.3 Diurnal fluctuation of LOX activity in PGMS and conventional rice seedling leaves at constant temperature and 10L/14D photoperiod

圖4 14L/10D變溫條件下光敏核不育系與常規(guī)稻幼苗葉片中LOX活性的光暗期變化Fig.4 Diurnal fluctuation of LOX activity in PGMS and conventional rice seedling leaves at alternating temperature and 14L/10D photoperiod

圖5 10L/14D變溫條件下光敏核不育系與常規(guī)稻幼苗葉片中LOX活性的光暗期變化Fig.5 Diurnal fluctuation of LOX activity in PGMS and conventional rice seedling leaves at alternating temperature and 10L/14D photoperiod

圖6 12L/12D變溫條件下光敏核不育系與常規(guī)稻幼苗葉片中LOX活性的光暗期變化Fig.6 Diurnal fluctuation of LOX activity in PGMS and conventional rice seedling leaves at alternating temperature and 12L/12D photoperiod

圖7 樣品總RNA電泳Fig.7 Electrophoresis figure of total RNA

2.3 樣品總RNA質(zhì)量檢測結(jié)果

樣品總RNA的瓊脂糖凝膠電泳效果見圖7，從中可以看出RNA跑膠條帶完整。RNA濃度及純度測定結(jié)果顯示:N5088S的總 RNA A260/280 為 1.8～1.9，A260/A230為 1.79 ～ 1.90，RNA 的 濃 度 在 800 ～1 000 ng/μL;D38S的總 RNA A260/280為1.56～1.92，A260/A230 為 1.81～2.08，RNA的濃度在920～1 600 ng/μL，表明 RNA的提取質(zhì)量較好，其純度與質(zhì)量符合后續(xù)試驗的要求。

2.4 水稻苗期葉片LOX基因表達的光暗期變化

圖8 光敏核不育水稻幼苗葉片中OsLOX表達的光暗期變化Fig.8 Diurnal fluctuation of OsLOX expression levels in PGMS rice seedling leaves

在檢測的13個LOX基因中，除LOX6、LOX7、LOX10、LOX11和LOX12共5個基因未檢出外，共檢測到8個OsLOX基因(圖8)。檢測結(jié)果表明:OsLOX1、OsLOX5和OsLOX9基因表達的豐度在N5088S和D38S中均無明顯的光暗期變化規(guī)律(圖8-a、8-e和8-g)。OsLOX2基因表達豐度在N5088S中具有明顯的暗期高光期低的變化規(guī)律，其最高和最低表達豐度分別出現(xiàn)在暗期和光期，表達豐度從光期轉(zhuǎn)到暗期時升高，而從暗期轉(zhuǎn)到光期時下降;但在D38S中無明顯光暗期變化規(guī)律(圖8-b)。OsLOX3基因的表達豐度在N5088S中具有暗期高光期低的趨勢，其最高和最低表達豐度分別出現(xiàn)在暗期和光期;而在D38S中沒有明顯的光暗期變化特征(圖8-c)。OsLOX4基因表達的豐度在N5088S和D38S中均具有暗期高光期低的趨勢，其最高和最低表達豐度均分別出現(xiàn)在暗期和光期，表達豐度從光期轉(zhuǎn)到暗期時均升高，而從暗期轉(zhuǎn)到光期時均下降(圖8-d)。OsLOX8和OsLOX13基因表達的豐度在N5088S和D38S中均具有暗期高光期低的趨勢，N5088S中的最高和最低表達豐度分別出現(xiàn)在暗期和光期，表達豐度從光期轉(zhuǎn)到暗期時升高，而從暗期轉(zhuǎn)到光期時下降;D38S中的最高表達豐度出現(xiàn)在暗期，表達豐度從光期轉(zhuǎn)到暗期時升高，而從暗期轉(zhuǎn)到光期時下降(圖8-f，8-h)。N5088S幼苗葉片的 OsLOX2、OsLOX3、OsLOX4、Os-LOX8和OsLOX13等5個基因的表達與其LOX活性的光暗期變化趨勢一致，而D38S幼苗葉片的Os-LOX4、OsLOX8和OsLOX13等3個基因的表達與其LOX活性的光暗期變化趨勢一致。

3 小結(jié)與討論

3.1 PGMS水稻與三系不育和常規(guī)稻間的LOX活性的光暗期變化差異

本研究結(jié)果首次揭示，光敏核不育水稻幼苗葉片LOX活性具有顯著的暗期高光期低的變化特征。此外，光暗期恒溫或變溫，并不影響水稻幼苗葉片LOX活性的光暗期變化特征，說明PGMS水稻LOX酶活性的光暗期變化不是由溫度引起的，而是受光調(diào)控的。PGMS水稻LOX活性受光調(diào)控的這一結(jié)果與文獻中光調(diào)控JA水平的報道［19-23］一致，而暗期LOX活性高于光期的結(jié)果與光敏色素Pfr能抑制LOX合成的結(jié)果相符［19］。本研究中，LOX活性的光暗期變化僅發(fā)生于PGMS水稻中，而在常規(guī)稻和三系不育系中，LOX活性在光暗期無明顯差異;長光敏核不育水稻N5088S和短光敏核不育水稻D38S的LOX活性光暗期變化規(guī)律一致。這一結(jié)果提示LOX或茉莉酸途徑可能與PGMS水稻的光敏感特性有關(guān)。

3.2PGMS水稻LOX基因表達的特點

本研究在PGMS水稻幼苗葉片中檢測到8個OsLOX基因，其中OsLOX2、OsLOX3、OsLOX4、OsLOX8和OsLOX13的表達豐度在N5088S中呈現(xiàn)暗期高光期低的趨勢;而在D38S中，OsLOX4、OsLOX8和Os-LOX13的表達豐度呈現(xiàn)暗期高光期低的趨勢。這一結(jié)果與本研究LOX活性的測定結(jié)果相吻合，也與光敏色素Pfr能抑制LOX合成的結(jié)果［19］相一致。Nemchenko［13］曾報道玉米LOX基因ZmLOX10的表達受光周期的調(diào)控，但其表達水平卻是晝高夜低，不過ZmLOX10編碼的LOX的底物是亞油酸，它并不為JA的合成提供前體物。說明LOX家族中的不同基因在不同的植物或不同品種中存在不同的表達調(diào)控方式。考慮到LOX是JA途徑中的關(guān)鍵酶，并且LOX活性與JA積累呈極顯著正相關(guān)［2-3］，筆者推測PGMS水稻葉片中內(nèi)源JA水平具有晝夜變化特征。

3.3 PGMS水稻LOX活性的光暗期變化是否與育性轉(zhuǎn)換相關(guān)還有待進一步研究

本研究雖未直接涉及PGMS水稻的育性，而僅研究其幼苗葉片的LOX活性和其基因表達特性，但也為進一步研究JA途徑與PGMS水稻的育性提供了基礎(chǔ)。已知LOX或JA途徑參與擬南芥［6-11，24-25］、玉米［12］和水稻［26-28］等植物的雄性育性表達，而且外施MeJA能使不育光溫條件下PGMS水稻N5088S的育性部分恢復(fù)，并且可育光溫條件下N5088S葉片LOX活性高于不育光溫條件［14］。在育性轉(zhuǎn)換敏感期，PGMS水稻LOX活性或其基因表達是否也和幼苗期葉片一樣存在光暗期的變化呢?是否在長光敏核不育系N5088S與短光敏核不育系D38S［29］中表現(xiàn)同樣的光暗變化趨勢呢?這些問題值得進一步的研究。

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