馬越,歐亮龍,王興明

(1.洛陽(yáng)軸研科技股份有限公司，河南 洛陽(yáng)，471039; 2.洛陽(yáng)軸承研究所有限公司，河南 洛陽(yáng) 471039;3.西南科技大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院化學(xué)系，四川 綿陽(yáng) 621010)

茜素黃R與溶菌酶作用方式的光譜法研究

馬越1,歐亮龍2,王興明3

(1.洛陽(yáng)軸研科技股份有限公司，河南 洛陽(yáng)，471039; 2.洛陽(yáng)軸承研究所有限公司，河南 洛陽(yáng) 471039;3.西南科技大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院化學(xué)系，四川 綿陽(yáng) 621010)

在接近生理?xiàng)l件下，采用UV-Vis光譜、熒光光譜、熱力學(xué)等方法研究了有機(jī)小分子茜素黃R(AYR)與溶菌酶(Lys)的作用機(jī)理.研究表明，AYR與Lys作用摩爾比為AYR∶Lys=5∶1,摩爾吸光系數(shù)εAL=3.87×105L·mol-1·cm-1，說(shuō)明AYR對(duì)Lys具有熒光猝滅特性，作用模式為靜態(tài)猝滅，通過(guò)熱力學(xué)實(shí)驗(yàn)可知，兩者之間的作用方式主要是疏水作用和范德華力作用.

茜素黃R; 溶菌酶; 作用機(jī)制

茜素黃 R 是一種茜草類(lèi)有機(jī)小分子植物染料，研究發(fā)現(xiàn)這種小分子可作為生物探針來(lái)探究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)也可以通過(guò)研究?jī)烧咧g的相互作用來(lái)深入了解蛋白質(zhì)的生物功能[1].研究茜素黃R與溶菌酶蛋白質(zhì)之間的相互作用方式，在新型抗癌藥物的選擇、抗癌功能的緩釋改良以及抗病毒作用機(jī)理等方面有重要應(yīng)用和理論意義.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

溶菌酶(Lysozy me), 分析純, 上海伯奧生物科技有限公司; 茜素黃R (Alizarin Yellow R), 分析純, 成都科龍化工試劑廠; Tris生物緩沖溶液，自制; UV-2102-PCS型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì), 上海尤尼科有限公司; FL-4500型熒光光譜儀, 日本日立公; pHS-2C型酸度計(jì), 成都方舟科技開(kāi)發(fā)公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

當(dāng)小分子與蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用時(shí)，紫外吸收光譜會(huì)發(fā)生一定的變化，這是由于蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生了變化[2].本實(shí)驗(yàn)以光譜法獲得AYR與Lys作用的摩爾比，AYR-Lys復(fù)合物的摩爾吸光系數(shù)，結(jié)合過(guò)程的熱力學(xué)性質(zhì)變化等參數(shù)，并對(duì)AYR與Lys間的作用機(jī)制進(jìn)行了研究.

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外光譜法研究茜素黃R與溶菌酶的摩爾比

本文利用紫外光譜的摩爾比法，具體操作為：固定茜素黃R溶液的濃度，然后逐漸加入溶菌酶(Lys)溶液，掃描AYR-Lys體系的紫外可見(jiàn)光譜圖，如圖1所示.由圖1可知，隨著溶菌酶(Lys)溶液的加入，在206 nm左右處，茜素黃R(AYR)的吸收光譜的吸光度出現(xiàn)了規(guī)律性的增加并且可以看出存在有一定程度的紅移，而在280 nm左右處的比較弱的一個(gè)紫外吸收峰同樣也出現(xiàn)了吸光度增強(qiáng)的現(xiàn)象.這種現(xiàn)象的原因是由于Lys與AYR之間發(fā)生了相互作用[3-5]，對(duì)206 nm處的的吸光度作摩爾比圖1，得出nAYR∶nLys=5∶1.根據(jù)Beer定律A=εALbcAL其中εAL是AYR-Lys的摩爾吸光系數(shù)，cAL是AYR-Lys的濃度.由圖1計(jì)算得到εAL=3.87×105L·mol-1·cm-1.

λ/(nm)

圖1AYR對(duì)Lys紫外吸收光譜的影響

Fig.1InfluenceofLysonUV-VisabsorptionspectraofAYR(pH7.40)cAYR= 6.40×10-6mol/L;cLys= 4.80×10-5mol/Lλ/(nm)

圖2AYR對(duì)Lys熒光光譜的影響

Fig.2TheFlourescencespectracurveofAYRtoLys(pH7.40)cLys= 1.00×10-5mol/L;cAYR= 1.50×10-3mol/L

2.2 AYR和Lys的熒光猝滅機(jī)理及其猝滅常數(shù)

通過(guò)AYR加入到Lys溶液的熒光光譜圖2可知AYR能夠?qū)ys產(chǎn)生熒光猝滅，進(jìn)一步說(shuō)明兩者能夠發(fā)生作用.利用溫度對(duì)反應(yīng)平衡的影響，通過(guò)熒光發(fā)射強(qiáng)度與組份濃度的關(guān)系，作不同溫度下F0/F～cAYR的變化圖，根據(jù)Stern-Volmer方程[6](1).

F0/F=1+KSV[R]=1+Kq×τ0×[R]

(1)

其中F0代表Lys與AYR體系里沒(méi)有猝滅劑AYR時(shí)體系的熒光值，F(xiàn)是每加入一次猝滅劑AYR時(shí)的熒光值.[R]為加入體系里AYR的現(xiàn)時(shí)濃度.KSV即動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)，它表示蛋白質(zhì)分子與AYR分子相互擴(kuò)散與相互碰撞的過(guò)程達(dá)到平衡時(shí)的量與效的關(guān)系.Kq即動(dòng)態(tài)熒光猝滅速率，在此闡述的是Lys和AYR的擴(kuò)散與碰撞對(duì)蛋白質(zhì)的熒光時(shí)間衰減的速率影響.τ0是沒(méi)有猝滅劑存在的時(shí)候，體系熒光分子的平均壽命，本文中熒光分子的平均壽命取值為10-8s[7].靜態(tài)猝滅常數(shù)KLB則可以用Lineweaver-Burk[8]雙倒數(shù)公式(2)來(lái)表示，這其中F、F0、R與之前所描述的相同，只是在這里進(jìn)行了倒數(shù)處理.

(2)

當(dāng)溫度變化時(shí)(285.65K及310.15K)按照光度滴定法向Lys中逐漸加入AYR測(cè)量其熒光變化，數(shù)據(jù)通過(guò)公式(1)與(2)分別繪制Stern-Volmer和Lineweaver-Burk曲線圖3和4線性相關(guān)擬合后得到直線方程、相關(guān)系數(shù)等見(jiàn)表1.

根據(jù)圖3和圖4，再結(jié)合表1，計(jì)算得到室溫下KSV=1.6599×104L·mol-1，又因?yàn)镵SV=Kq·τ0，而且熒光物質(zhì)的τ0=10-8s，所以計(jì)算得到Kq=1.6599×1012L·mol-1·s-1.一般情況下，各種的熒光猝滅劑的最大擴(kuò)散猝所產(chǎn)生的滅常數(shù)等于2×1010L·mol-1·s-1[7]，通過(guò)比較可以看出AYR對(duì)Lys的熒光猝滅常數(shù)遠(yuǎn)大于擴(kuò)散所產(chǎn)生的Kq值，因此可以得出結(jié)論，即AYR對(duì)Lys的熒光猝滅是以形成AYR-Lys復(fù)合產(chǎn)物的方式進(jìn)行的，即靜態(tài)熒光猝滅.

圖3AYR與Lys作用的Stern-Volmer曲線(477nm)

Fig.3TheStern-VolmerplotsofAYRvsLys(477nm)cLys= 1.00×10-5mol/L;cAYR= 1.50×10-3mol/L

圖4 AYR與Lys作用的雙倒數(shù)曲線(477 nm)

Fig.4 The Double reciprocal plots of AYR vs Lys (477 nm)cLys= 1.00×10-5mol/L;cAYR= 1.50×10-3mol/L

表1 AYR與Lys相互作用的線性方程和相關(guān)系數(shù)

Table 1 Regression equations and interrelated coefficients of the AYR vs Lys

根據(jù)Lineweaver-Burk曲線得出的方程，可以計(jì)算得到AYR對(duì)Lys的熒光猝滅常數(shù)KLB=1.09×104L·mol-1.

2.3 AYR與Lys的結(jié)合常數(shù)和相互作用的熱力學(xué)函數(shù)

Ross[9]等人通過(guò)對(duì)大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，總結(jié)出了判斷生物大分子與一些有機(jī)小分子結(jié)合時(shí)的作用力類(lèi)型和生物大分子自身作用力類(lèi)型的熱力學(xué)規(guī)律，由圖4中直線的斜率和截距計(jì)算得到285.65K和310.15K時(shí)AYR與Lys的結(jié)合常數(shù)，KLB, 285.65K=1.09×104L·mol-1和KLB, 310.15K=9.71×103L·mol-1，由于溫度變化范圍不大，而且焓變對(duì)溫度變化所造成的誤差很小，可以忽略不計(jì)，所以本章實(shí)驗(yàn)中做了近似處理，認(rèn)為反應(yīng)的ΔrHm是一個(gè)固定的值，所以可以根據(jù)熱力學(xué)公式(3)-(5)計(jì)算表觀焓變?chǔ)Hm，表觀熵變?chǔ)Sm和表觀吉布斯自由能ΔrGm.結(jié)果見(jiàn)表2

(3)

(4)

(5)

表2AYR和Lys結(jié)合常數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)

Table 2 The binding constants and the thermodynamic parameters of AYR and Lys

從表2可以看出，AYR與Lys在相互作用時(shí)，吉布斯自由能和焓變都為負(fù)值，說(shuō)明作用過(guò)程是一個(gè)放熱的自發(fā)進(jìn)行的過(guò)程，又由于熵值是正的，這是由于疏水作用，所以AYR與Lys的作用方式是疏水作用.

2.4AYR與Lys-CBBG-250體系的相互作用

CBBG-250(G-250)即考馬斯亮藍(lán)，它是一種堿性條件下呈藍(lán)色的染料，分子中包含有磺酸基，被用作測(cè)定蛋白質(zhì)的含量，其功能在于，能和蛋白質(zhì)通過(guò)范德華力相互結(jié)合形成一種藍(lán)色的復(fù)合物[10].

這種復(fù)合物的顏色深淺與蛋白質(zhì)的含量成定量的關(guān)系.當(dāng)在Lys-CBBG-250體系中加入AYR，AYR就會(huì)在和蛋白質(zhì)發(fā)生作用時(shí)與CBBG-250發(fā)生競(jìng)爭(zhēng).從這種競(jìng)爭(zhēng)可以了解到AYR與Lys的相互作用方式.

具體實(shí)驗(yàn)方法是，固定Lys-CBBG-250的摩爾比，然后向含不同量CBBG-250的Lys中加入AYR，掃描熒光光譜，結(jié)果如圖5.

對(duì)圖中數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸結(jié)果見(jiàn)圖6，線性方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表3從數(shù)據(jù)可以看出AYR對(duì)Lys-CBBG-250體系具有熒光猝滅作用，這可能是由于AYR與CBBG-250發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)，將CBBG-250替換出來(lái)，形成熒光強(qiáng)度更低的AYR-Lys復(fù)合物，從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象，說(shuō)明AYR與Lys之間存在范德華力.

表3AYR與Lys-CBBG-250相互作用的線性方程和相關(guān)系數(shù)

Table3RegressionequationsandinterrelatedcoefficientsoftheAYRandLys-CBBG-250

cC/cLRegressionequationsRR20∶1F0-F=3．80+16．40×105cAYR0．998330．996660．5∶1F0-F=22．23+28．44×105cAYR0．992210．984481∶1F0-F=32．28+33．06×105cAYR0．991600．983271．5∶1F0-F=32．75+38．68×105cAYR0．991610．98329

3 結(jié) 論

[1]胡亞敏, 蔣琪英, 張歡, 等.堿性介質(zhì)中茜素黃R與牛血清蛋白相互作用研究[J].西南科技大學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 22(3)：14-19.

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[責(zé)任編輯：徐明忠]

Study on the interaction between alizarin yellow R and lysozyme by spectrometry

MA Yue1,OU Lianglong2，WANG Xingming3

(1.Luoyang Bearing Science&Technology Co.,Ltd., Luoyang 471039, China;2.Luoyang Bearing Research Institute, Luoyang 471039, China; 3.Department of Chemistry, School of Materials Science and Engineering, Southwest University of Science and Technology, Mianyang 621010, China)

The mechanism of interaction between alizarin yellow R and lysozyme has been investigated by UV spectroscopy, fluorescence spectroscopy, thermodynamics, etc.The results indicate that the molar ratio of AYR and Lys is 5∶1, the molar absorption coefficient is εAL=3.87×105L·mol-1·cm-1.The action type of AYR and Lys is static quenching.The thermodynamic experiment shows that the main effect of is hydrophobic effect and van der Waals force.

alizarin yellow R; lysozyme; mechanism

2015-05-30

馬越 (1988-)，女，安徽合肥人，洛陽(yáng)軸研科技股份有限公司助理工程師，碩士，主要從事分析化學(xué)的研究.

O

A

1672-3600(2015)12-0041-05