張鳳英，喬立君，張金玉，薛美蘭，葛銀林

(1 青島大學醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，山東 青島 266021; 2 菏澤醫(yī)學專科學校)

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聯(lián)合下調Survivin和KSP表達對乳癌細胞MDA-MB-231凋亡影響

張鳳英1，2，喬立君1，張金玉1，薛美蘭1，葛銀林1

(1 青島大學醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，山東 青島 266021; 2 菏澤醫(yī)學?？茖W校)

目的 探討聯(lián)合下調Survivin和紡錘體驅動蛋白(KSP)基因表達對乳癌細胞增殖和凋亡影響。方法分別化學合成針對Survivin和KSP基因mRNA的小干擾RNA(siRNAs)，分別或聯(lián)合轉染乳癌細胞MDA-MB-231，以空白對照組作為陰性對照。采用MTT法檢測細胞增殖率，熒光定量PCR (qRT-PCR)檢測Survivin、KSP、Bax和Bcl-2的mRNA表達，蛋白印跡法檢測Survivin和KSP的蛋白表達，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。結果Survivin、KSP和Survivin+KSP轉染組轉染48 h的細胞增殖率分別為0.66±0.01、0.67±0.03、0.54±0.01，轉染72 h的細胞凋亡率分別為(11.61±0.89)%、(16.33±0.94)%、(45.73±1.11)%，與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(F=1 307.81、1 450.76，P<0.01)，其中以雙干擾組細胞增殖率最低、凋亡率最高。在各轉染組中，Survivin、KSP的mRNA和蛋白表達水平均顯著下降(F=48.68～490.20，P<0.01)，Bax mRNA的表達顯著增加(F=65.73，P<0.01)，Bcl-2 mRNA的表達顯著減少(F=27.41，P<0.01)。結論 利用siRNAs聯(lián)合下調Survivin和KSP基因表達，能有效抑制乳癌細胞的增殖、促進其凋亡，效果優(yōu)于下調單個基因的表達。

乳房腫瘤；凋亡抑制蛋白質類；驅動蛋白；RNA干擾

實驗室和臨床研究都證實，腫瘤細胞的生長繁殖與若干癌基因和抑癌基因的表達異常有關，其中重要的有Survivin和紡錘體驅動蛋白(KSP) 基因。Survivin基因是近年發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白(IAP)家族新成員，具有強大的調節(jié)細胞增殖以及抗凋亡的能力，高表達于各種惡性腫瘤組織及胚胎組織，如乳癌組織[1]，而在正常組織(胸腺、生殖器除外)細胞中水平較低或不表達。KSP是驅動蛋白5亞家族中的一員[2]，在細胞有絲分裂早期，對雙極紡錘體的形成、復制、染色體的分離和中心體的分裂等有絲分裂過程起著重要的作用[3]。除此之外，KSP還與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展緊密相關，在很多腫瘤細胞系中高表達(如乳癌[4])，已成為近年一個重要的腫瘤化療的新靶點[5]。理論上，抑制高表達的癌基因，就可抑制癌細胞的增殖或使其凋亡。小干擾RNA(siRNAs)技術具有特異性高、效果好、制備容易、操作簡便等優(yōu)點，已成為抑制基因表達的首選方法。本研究擬通過聯(lián)合轉染Survivin和KSP 的siRNAs，抑制這兩種基因在乳癌細胞中的表達，探討其對細胞生長能力、侵襲能力的影響，為乳癌的基因治療提供新策略?，F(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人乳癌細胞株MDA-MB-231購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所。

1.1.2 主要試劑 脂質體LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；Annexin V-FITC/PI染色試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；MTT試劑盒購自美國Sigma公司；兔抗人Survivin、KSP多克隆抗體購自美國Biolengend公司；β-actin一抗和二抗購自武漢博士德生物工程有限公司；特異性靶向Survivin、KSP基因及scramble的siRNAs由上海吉瑪公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人乳癌細胞株MDA-MB-231經(jīng)復蘇后，加入含有體積分數(shù)0.10胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)液，在37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2的恒溫密閉式培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。

1.2.2 細胞轉染及分組 將MDA-MB-231細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，待細胞密度為4×108/L、細胞融合度達60%～70%時進行轉染。轉染時分組如下：空白對照組(A組)，陰性對照組(B組，轉染scramble siRNAs)，Survivin轉染組(C組)，KSP轉染組(D組)，Survivin+KSP轉染組(E組，轉染Survivin和KSP的siRNAs各半)。轉染siRNAs的終濃度均為100 nmol/L。將配制的siRNAs-LipofectamineTM2000混和液加入含有細胞的培養(yǎng)孔中，使每孔總體積為2 mL，置于37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h后，更換新鮮的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，觀察siRNAs抑制效果。

1.2.3 MTT檢測細胞增殖 將MDA-MB-231細胞接種于96孔板中，細胞密度為1.5×107/L；置于37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁后，各組加入終濃度為100 nmol/L的相應siRNAs；分別在轉染24、48、72 h后，每孔加入新鮮配制的10 g/L MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；棄上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，震蕩10 min；用酶聯(lián)免疫檢測儀于波長490 nm處測定每孔吸光度(A)值，以不含細胞的培養(yǎng)液作空白對照，最后結果取3個平行孔的均值。實驗重復3次。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況 轉染后72 h收集106個細胞，用預冷PBS洗滌，1 000 r/min離心3 min，反復3次。棄上清液，收集細胞，混勻沉淀，快速加入體積分數(shù)0.75的冷乙醇中，4 ℃固定24 h，采用Annexin V-FITC/PI試劑盒雙染法檢測各組細胞凋亡率。實驗結果以流式四象限散點圖表示，每個樣品重復檢測3次。

1.2.5 熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測相關指標mRNA表達 轉染48 h后，用Trizol試劑提取各組的總RNA，用反轉錄試劑盒進行cDNA鏈的合成。PCR反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72℃ 30 s，72 ℃ 10 min，共40個循環(huán)。以A組mRNA的表達量為標準，計算其他組mRNA的相對表達量，結果以2-△△CT表示。qRT-PCR所用引物名稱及其序列見表1。

表1 qRT-PCR所用引物名稱及其序列

1.2.6 蛋白印跡法檢測Survivin和KSP蛋白表達轉染72 h后，收集細胞提取總蛋白，用BCA法進行濃度測量，取50 μg蛋白置100 g/L SDS-PAGE凝膠上進行電泳，電泳結束后轉移蛋白至PVDF膜上，以50 g/L脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入1∶200稀釋的兔抗人Survivin、KSP一抗，室溫作用3 h，TBST洗膜，加入1∶2 000稀釋的羊抗兔IgG/HRP，室溫溫育1 h，TBST洗膜，DAB顯色。以β-actin為內參，用quantity one軟件分析各條帶灰度值，計算Survivin和KSP蛋白的相對表達量。

2 結 果

2.1 轉染siRNAs對MDA-MB-231細胞增殖影響

與A組相比，各siRNAs組各時間點的細胞增殖率均有所下降，以E組下降最明顯，差異均有統(tǒng)計學意義(F=1 307.81～3 674.31,P<0.01)。E組轉染48 h的細胞增殖率較轉染24 h顯著下降(F=7.203，P<0.01)，但轉染48 h與轉染72 h的細胞增殖率差異無顯著性(P>0.05)。見表2。

2.2 轉染48 h后各組細胞形態(tài)學觀察

A、B組細胞形態(tài)良好，呈梭狀，兩組差異不明顯；C、D組凋亡細胞增多，細胞變圓，且兩組細胞凋亡數(shù)目無明顯差異；E組細胞凋亡最顯著，圓形細胞增多。見圖1。

2.3 轉染siRNAs對MDA-MB-231細胞凋亡影響

轉染后72 h，C、D、E組細胞的凋亡率分別為(11.61±0.89)%、(16.33±0.94)%和(45.73±1.11)%，各組細胞凋亡率高于A組(5.29±0.09)%和B組(5.17±0.032)%，且以E組的細胞凋亡率最高，差異均有統(tǒng)計學意義(F=1 450.76，P<0.01)；A組與B組細胞凋亡率差異無顯著性(P>0.05)。

2.4 轉染siRNAs對相關指標mRNA和蛋白表達的影響

A、B組細胞Survivin、KSP、Bax和Bcl-2基因mRNA的表達比較差異無顯著意義(P>0.05)；與A組相比較，C、E組Survivin mRNA和蛋白的表達水平均明顯降低(F=299.70、490.20，P<0.01)，D、E組KSP mRNA和蛋白的表達水平也明顯降低(F=76.64、48.68，P<0.01)，C、D、E組Bax mRNA的表達水平明顯升高(F=65.73，P<0.01)，C、D、E組Bcl-2 mRNA的表達則顯著減少(F=27.41，P<0.01)。以上各指標檢測結果均以E組變化最為明顯。見表3。

表2 各組細胞增殖率的比較

A：空白對照組；B：陰性對照組；C：Survivin轉染組；D：KSP轉染組；E：Survivin+KSP轉染組。100倍。

表3 各組相關指標mRNA和蛋白表達的比較

3 討 論

近半個世紀以來，隨著工業(yè)化的發(fā)展，乳癌發(fā)病率和死亡率一直呈明顯的上升趨勢，但目前還沒有完全有效的藥物治療乳癌。越來越多的研究表明，siRNAs技術能有效抑制癌細胞的增殖。因此，尋找有效的siRNAs靶位點可能會成為最熱門的癌癥治療手段之一。

Survivin是目前發(fā)現(xiàn)的惟一與細胞凋亡和細胞周期調控均相關的IAP家族成員。Survivin在細胞周期的G2/M期特異性表達，在細胞有絲分裂期間，它通過特異性結合到紡錘體的微管蛋白上來實現(xiàn)對細胞分裂的調控[6]。因此，Survivin對維持快速增殖細胞的存活、腫瘤細胞的惡性增殖及其分化具有重要功能[7]。一些研究指出，Survivin主要通過抑制半胱氨酸蛋白酶Caspase-3及Caspase-9的活性，阻斷各種刺激因素誘導的細胞凋亡過程[8-10]，抑制血管內皮細胞的凋亡，參與腫瘤血管生成[11]。下調Survivin后可以上調Bax和BAD的表達水平，下調Bcl-2的表達，促進細胞凋亡[12-13]。本文研究結果顯示，轉染靶向Survivin的siRNAs，可有效下調Survivin mRNA和蛋白的表達水平。隨著Survivin表達的下調，Bcl-2的表達水平顯著下調，Bax的表達水平上調，細胞凋亡程度明顯增高。本文的研究結果與相關文獻報道一致[14]，說明我們所設計合成的Survivin siRNAs可有效促進腫瘤細胞凋亡。

KSP具有驅動蛋白家族保守的ATP酶結構域和動力結構域，在有絲分裂前中期，對雙極紡錘體的形成分離過程有重要的作用[15]。有研究顯示，針對KSP的siRNAs能夠導致單星狀紡錘體的產生，促使有絲分裂阻滯在M期，并誘導腫瘤細胞凋亡[16]。也有研究表明，KSP高表達于人體惡性增殖的組織細胞中，其表達水平與細胞增殖指數(shù)、有絲分裂比例及腫瘤的生長速度有相關性[17]。KSP蛋白參與細胞的有絲分裂，人體正常分裂增殖的組織細胞中也存在KSP的表達，但其表達水平明顯低于惡性組織；在人體正常分化成熟的組織細胞中，如神經(jīng)細胞中未檢測到KSP的表達[18]。因此，抑制KSP能夠抑制細胞的有絲分裂，使細胞停止增殖。本研究使用siRNAs抑制KSP表達后，細胞凋亡率顯著增加，這表明下調KSP表達可有效抑制細胞增殖，促進細胞凋亡。TAO等[19]的研究表明，抑制KSP可以激活Bax、caspase3等凋亡基因，從而促進腫瘤細胞凋亡。有研究結果顯示，下調KSP表達可以提高Bax/Bcl-2的比值[20]。本研究結果與之相符。

在大多數(shù)實體惡性腫瘤組織中，包括乳癌、神經(jīng)母細胞瘤和肺癌，Survivin和KSP的表達均上調，與腫瘤的惡性行為相關[21]。因此，越來越多的研究將Survivin和KSP作為癌癥治療的靶位點。目前，KSP siRNAs和血管內皮生長因子siRNAs聯(lián)合干擾已經(jīng)用于人體研究，效果顯著[21]。然而，目前還未見同時靶向Survivin和KSP的siRNAs對乳癌細胞增殖、凋亡、侵襲影響的研究報道。因此，本研究應用化學合成的siRNAs，轉染MDA-MB-231細胞，同時特異性抑制Survivin和KSP基因的表達。本文的研究結果顯示，雙干擾組細胞凋亡率明顯高于單干擾組。同樣，Survivin和KSP的表達在雙干擾組降低最顯著。

綜上所述，利用siRNAs同時下調Survivin和KSP基因的表達，抑制乳癌細胞的生長效果顯著高于單獨下調任何一種基因的表達；Survivin和KSP可以作為腫瘤治療的兩個重要靶標；聯(lián)合下調Survivin和KSP可作為乳癌治療的參考。本文結果為多基因共沉默抑制腫瘤細胞的生長提供了實驗依據(jù)，也為利用siRNAs進行腫瘤基因治療提供了有意義的嘗試。

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(本文編輯 馬偉平)

EFFECTS OF COMBINED DOWN REGULATION OF EXPRESSIONS OF SURVIVIN AND KSP ON APOPTOSIS OF BREAST CAN-CER CELL MDA-MB-231

ZHANGFengying,QIAOLijun,ZHANGJinyu,XUEMeilan,GEYinlin

(Department of Biochemistry, Qingdao University Medical College, Qingdao 266021, China)

ObjectiveTo investigate the effects of combined down regulation of expressions of Survivin and kinesin spindle protein (KSP) on proliferation and apoptosis of human breast cancer cells (MDA-MB-231).MethodsSmall interfering RNAs (siRNAs) targeting Survivin and KSP mRNA were chemically synthesized and jointly or separately transfected to breast cancer cells (MDA-MB-231). A blank control group was served as negative control. Employing MTT method to measure the cell proliferation rate, qRT-PCR to detect the expressions of Survivin, KSP, Bax and Bcl-2 mRNA, Western blotting to detect the expressions of Survivin and KSP proteins, and flow cytometry to detect the cell apoptosis.ResultsAfter 48 hours of transfection, the cell proliferation rates in Survivin, KSP and Survivin+KSP groups were 0.66±0.01, 0.67±0.03, and 0.54±0.01, respectively, and the apoptotic rates were (11.61±0.89)%, (16.33±0.94)%, and (45.73±1.11)%, respectively, the differences were statistically significant as compared with the blank control group (F=1 307.81,1 450.76;P<0.01), of which, the lowest rate of cell proliferation and the highest rate of apoptosis were noted in double-interference group. In each transfection group, the mRNA and protein expressions of Survivin and KSP were significantly declined (F=48.68-490.20,P<0.01), the expression of Bax mRNA increased (F=65.73,P<0.01), and the mRNA expression of Bcl-2 reduced (F=27.41,P<0.01).ConclusionApplyingsiRNAs to jointly down regulation of both Survivin and KSP expressions can more effectively inhibit the proliferation and promote apoptosis of breast cancer cells than down-regulating the expression of individual gene.

breast neoplasms; inhibitor of apoptosis proteins; kinesin; RNA interference

2015-01-22;

2015-06-06

青島市科技局科研基金資助項目(07-2-1-7-nsh)

張鳳英(1973-)，女，碩士研究生，講師。

葛銀林(1957-)，男，博士，教授，博士生導師。

R737.9

A

1008-0341(2015)04-0402-05