葛正行，李 霄，周 洵，李 波，婁 強(qiáng)

(1.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，貴州 貴陽(yáng)550001;2.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院 研究生院，貴州 貴陽(yáng)550002)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種以持續(xù)氣流受限為特征的肺部疾病，氣道重建是COPD的關(guān)鍵，其本質(zhì)是小氣道的慢性炎癥及纖維化[1]，而成纖維細(xì)胞過(guò)度激活發(fā)揮了極大的作用。因此尋找調(diào)控氣道重建的關(guān)鍵基因并進(jìn)行干預(yù)是尋求慢阻肺新療法的突破點(diǎn)。本課題組前期證實(shí)，當(dāng)HSG 基因轉(zhuǎn)染到COPD大鼠氣道成纖維細(xì)胞能抑制其增殖[2]。但調(diào)控相關(guān)基因及細(xì)胞因子的網(wǎng)絡(luò)通路尚未完全闡明。Wnt/β-catenin通路是目前公認(rèn)的調(diào)節(jié)慢阻肺氣道重建的重要信號(hào)傳導(dǎo)通路之一[3]。本實(shí)驗(yàn)擬探索HSG 在COPD 氣道重建中與Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路的關(guān)系，及其調(diào)控氣道重建的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF級(jí)雄性SD大鼠[SCXK(渝2012-0005)重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司SPF級(jí)]，體質(zhì)量(120±20 g)，鼠齡6周。

1.1.2 試劑:脂多糖(LPS)(Sigma 公司);Gibco 胎牛血清(Life Technologies 公司);Trizol 試劑(Invitrogen 公司);RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific 公司);Universal SYBR Green Supermix 2×Utaq PCR Master(BIO-RAD 公司);Anti-Mitofusin 2 抗體、Anti-beta Catenin 抗體、Anti-GSK3β抗體、Anti-Lamin B1 抗體、Anti-GAPDH 抗體(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 COPD大鼠模型建立及鑒定:將大鼠分為對(duì)照組及COPD模型組。造模方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[4]。造模結(jié)束后隨機(jī)處死對(duì)照組大鼠10只及模型組大鼠20只，切取左肺組織用4%多聚甲醛固定，石蠟切片，HE染色。采用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，以WAt/Pbm 評(píng)價(jià)肺組織小氣道重構(gòu)增厚情況，測(cè)定方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[5]。

1.2.2 大鼠氣道成纖維細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定:按照文獻(xiàn)[6]分離大鼠小氣道進(jìn)行成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)，3～5代細(xì)胞用于后續(xù)研究。成纖維細(xì)胞的鑒定參見(jiàn)文獻(xiàn)[2]。

1.2.3 Real ime PCR檢測(cè)成纖維細(xì)胞HSG 和βcatenin表達(dá):Trizol 法提取細(xì)胞總RNA 并采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定純度及濃度。按RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件:37℃孵育15 min，85℃5 s 終止反應(yīng)。引物序列:HSG 正向引物:5'-CACATGGAG CGTTGTACCAG-3'，反向引物:5'-TTGAGCACCTCCT TAGCAGAC-3'(104 bp);β-catenin 正向引物:5'-CGAGGACTCAATACCATTCC-3'，反向引物:5'-AGC CGTTTCTTGTAGTCCTG-3'(251 bp);β-action 正向引物:5'-GGGA AATCGTGCGTGACATT-3'，反向引物:5'-GCGGCAGTGG CCATCTC-3'(76 bp)。PCR反應(yīng)體系按Universal SYBR Green Supermix 2×Utaq PCR Master 說(shuō)明書(shū)配制。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性30 s;95℃變性5 s，57℃退火/延伸30 s，45個(gè)循環(huán);60～95℃熔解曲線分析60 s。參照文獻(xiàn)[7]以10倍梯度稀釋cDNA 獲得6個(gè)質(zhì)量濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品，分別對(duì)目的基因和內(nèi)參基因制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增。目的基因Ct值代入目的基因的擴(kuò)增直線方程，計(jì)算出“起始模板濃度”，同理算出內(nèi)參基因的“起始模板濃度”。同一樣品的目的基因定量值除以內(nèi)參基因定量值即該樣品相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 Western blot 測(cè)定成纖維細(xì)胞HSG、β-catenin 和GSK-3β表達(dá):提取細(xì)胞總蛋白、核蛋白及磷酸化蛋白，并計(jì)算質(zhì)量濃度[6]。蛋白變性后用Nu-PAGE Bis-Tris Mini Gels 進(jìn)行電泳，100 V 恒壓電泳10 min，200 V 恒壓繼續(xù)進(jìn)行分離膠部分電泳。200 mA恒流120 min 進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，4℃封閉過(guò)夜。分別用一抗HSG(1 ∶2 000)、β-catenin(1 ∶5 000)、P-GSK-3β(1∶1 000)、Lamin B1(1∶1 000)和GAPDH(1∶5 000)室溫?fù)u床孵育6 h。TBST 洗膜后二抗室溫?fù)u床孵育2 h。ECL 發(fā)光、壓片、顯影和定影。應(yīng)用ImageJ 軟件測(cè)定蛋白條帶吸光度值。

1.2.5 ELISA 檢測(cè)成纖維細(xì)胞細(xì)胞因子TGF-β1 和MMP-9表達(dá):按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS16.0 軟件，計(jì)量資料符合正態(tài)分布以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組比較采用完全隨機(jī)t 檢驗(yàn);不符合正態(tài)分布采取M(P25，P75)表示，采用秩和檢驗(yàn)。運(yùn)用Pearson 積差相關(guān)系數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 HE染色

與對(duì)照組相比COPD模型組大鼠肺組織出現(xiàn)肺氣腫病理變化，肺泡出現(xiàn)擴(kuò)張，肺泡壁變薄，并逐步斷裂融合成肺大皰，肺泡數(shù)量顯著減少。氣道黏膜纖毛出現(xiàn)黏連、變性和壞死，甚至脫落。支氣管上皮杯狀細(xì)胞增生肥大，有大量的炎性細(xì)胞如中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)管腔(圖1)，小氣道管腔的狹窄同時(shí)伴小氣道壁纖維結(jié)締組織增生(圖2)。

圖1 肺部炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)Fig1 Lung inflammatory cell infiltration(HE×200)

圖2 小氣道纖維結(jié)締組織增生Fig2 Small airway fibrous connective proliferation(HE×200)

2.2 大鼠肺組織小氣道WAt/Pbm 測(cè)定結(jié)果

結(jié)果采用M(P25，P75)描述，COPD模型組為95.45(66.88，119.03)明顯高于對(duì)照組的58.09(50.76，78.47)(P＜0.05，n=60)。

2.3 成纖維細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定

純化后的成纖維細(xì)胞鏡下可見(jiàn)大部分呈梭形或紡錘狀，少部分呈多邊形。用細(xì)胞免疫組化法，經(jīng)波形蛋白化學(xué)染色后，鏡下觀察顯示胞質(zhì)呈棕色，波形蛋白鑒定呈陽(yáng)性(圖3)。

2.4 Real time PCR檢測(cè)成纖維細(xì)胞HSG 和βcatenin基因表達(dá)(表1)

圖3 純化后成纖維細(xì)胞與波形蛋白鑒定Fig3 The purified airway fibroblasts(A)(×100);vimentin positive identification(B)(×400)

表1 HSG 和β-catenin mRNA 相對(duì)表達(dá)量Table1 HSG and β-catenin mRNA relative abundance(±s，n=25)

表1 HSG 和β-catenin mRNA 相對(duì)表達(dá)量Table1 HSG and β-catenin mRNA relative abundance(±s，n=25)

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01 compared with the control group.

group HSG/β-actin β-catenin/β-actin control 0.37±0.02 0.12±0.02 COPD 0.23±0.02* 0.45±0.02＊＊

2.5 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)(圖4，表2)

圖4 蛋白免疫印跡檢測(cè)小氣道成纖維蛋白表達(dá)Fig4 Western blot assay for protein expression in small airway fibroblasts

表2 蛋白半定量分析Table2 Protein semiquantitative analysis(±s，n=3)

表2 蛋白半定量分析Table2 Protein semiquantitative analysis(±s，n=3)

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01 compared with the control group.

group HSG/GAPDH β-catenin/Lamin B1 P-GSK-3β/GAPDH control 0.81±0.04 0.45±0.12 0.13±0.01 COPD 0.38±0.11* 0.73±0.12* 0.45±0.04＊＊

2.6 ELISA 檢測(cè)TGF-β1、MMP-9表達(dá)變化(表3)

表3 酶聯(lián)免疫法蛋白定量分析Table3 Enzyme-linked immunoassay protein quantitative analysis(±s，n=25)

表3 酶聯(lián)免疫法蛋白定量分析Table3 Enzyme-linked immunoassay protein quantitative analysis(±s，n=25)

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01 compared with the control group.

group TGF-β1/(pg/mL) MMP-9/(ng/mL)control 36.76±3.53 2.44±0.27 COPD 44.94±2.95* 4.04±0.31＊＊

2.7 HSG、β-catenin mRNA表達(dá)與TGF-β1、MMP-9細(xì)胞因子分泌相關(guān)性分析

HSG mRNA與β-catenin mRNA呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)，與TGF-β1 呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)，與MMP-9呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。

3 討論

氣道重建是COPD 發(fā)病的關(guān)鍵，在氣道重建過(guò)程中成纖維細(xì)胞增殖，不斷分泌基質(zhì)膠原，后者進(jìn)行性集聚并逐漸取代正常的氣道組織結(jié)構(gòu)，嚴(yán)重影響肺通氣和換氣功能，最終導(dǎo)致肺功能持續(xù)性損害。本實(shí)驗(yàn)表明COPD組氣道內(nèi)有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，管腔狹窄伴小氣道壁纖維結(jié)締組織增生。代表小氣道增厚的指標(biāo)WAt/Pbm 在模型組也明顯升高。研究氣道成纖維細(xì)胞增殖的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)揭示COPD 發(fā)病機(jī)制及改善治療效果具有重要意義。

眾多細(xì)胞因子及蛋白酶與氣道重建緊密相關(guān)，尤以TGF-β1 和MMP-9 最具代表性。TGF-β1 廣泛分布于氣道內(nèi)，是最重要的致纖維化因子。作為經(jīng)典WNT通路靶基因MMP-9是降解膠原的主要酶類，它由肺結(jié)構(gòu)細(xì)胞及炎癥細(xì)胞共同產(chǎn)生，能降解蛋白多糖、促進(jìn)氣道纖維化參與氣道重建[8]。本結(jié)果也表明，COPD模型組成纖維細(xì)胞因子TGF-β1、MMP-9表達(dá)均顯著高于對(duì)照組。

本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)COPD模型組HSG mRNA 和蛋白表達(dá)均顯著低于對(duì)照組。Wnt/β-catenin通路是目前公認(rèn)的調(diào)節(jié)慢阻肺氣道重建的重要信號(hào)傳導(dǎo)通路，其組份異常與肺纖維化、特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓、慢阻肺的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。筆者發(fā)現(xiàn)在COPD模型組成纖維細(xì)胞中隨著HSG mRNA 下調(diào)，Wnt 通路上關(guān)鍵基因β-catenin mRNA表達(dá)上調(diào)。COPD組成纖維細(xì)胞中細(xì)胞核β-catenin蛋白表達(dá)高于對(duì)照組，通路上另外一個(gè)關(guān)鍵的磷酸化蛋白P-GSK-3β 也在COPD組中表達(dá)升高。提示正是由于HSG 基因在COPD 成纖維細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致穩(wěn)態(tài)被打破，Wnt/β-catenin通路被異常激活，通路上失去活性的P-GSK-3β 逐漸增多，無(wú)法磷酸化β-catenin，使得β-catenin逃離“降解復(fù)合體”，進(jìn)而大量蓄積于細(xì)胞漿內(nèi)，達(dá)到一定濃度最終向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移。核內(nèi)的β-catenin 與TCF/LEF 轉(zhuǎn)錄復(fù)合體結(jié)合，最終激活下游靶基因如TGF-β1 和MMP-9 等的轉(zhuǎn)錄，從而引發(fā)下游一系列異常生物學(xué)事件。本結(jié)果提示HSG mRNA 與β-catenin mRNA 及TGF-β1、MMP-9表達(dá)量均存在線性負(fù)相關(guān)。

綜上所述，HSG 抑制氣道成纖維細(xì)胞的增殖而參與氣道重建，其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin通路，下調(diào)TGF-β1 和MMP-9 蛋白實(shí)現(xiàn)的。促進(jìn)HSG表達(dá)或抑制Wnt/β-catenin 激活可能成為干預(yù)氣道重建的突破點(diǎn)。

[1]Mitzner W.Emphysema-a disease of small airways or lung parenchyma[J].N Engl J Med，2011，365:1637-1639.

[2]葛正行，李波，周洵，等.rHSG 基因調(diào)控COPD大鼠氣道成纖維細(xì)胞增殖凋亡[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2013，33:1235-1241.

[3]申永春，萬(wàn)春，文富強(qiáng).Wnt/β-catenin信號(hào)通路在氣道炎癥性疾病中的研究進(jìn)展[J].臨床肺科雜志，2013，18:317-318.

[4]宋一平，崔德健.慢性阻塞性肺疾病大鼠模型氣道重塑及生長(zhǎng)因子的研究[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2001，24:283-287.

[5]Wang Y，Xue C，Dong F，et al.Hydroxysafflor Yellow A Attenuates Small Airway Remodeling in a Rat Model of Chronic Obstructive Pulmonary Disease[J].Biol Pharmac Bull，2014，37:1591-1598.

[6]葛正行，周洵，高瑞，等.rHSG 對(duì)COPD大鼠小氣道阻力及成纖維細(xì)胞TGF-β1表達(dá)的影響[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2014，34:1482-1485.

[7]徐麗華，劉春雷，常玉梅，等.雙標(biāo)準(zhǔn)曲線相對(duì)定量PCR 試驗(yàn)原理與方法[J].生物技術(shù)通報(bào)，2011，1:70-75.

[8]Araujo BB，Dolhnikoff M，Silva LFF，et al.Extracellular matrix components and regulators in the airway smooth muscle in asthma[J].Eur Respir J，2008，32:61-69.