王 鍵，龍子江，任振興，陸松俠，高華武，田麗娜

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)，合肥230031）

注血量致大鼠急性硬膜下血腫模型穩(wěn)定性的探討

王 鍵，龍子江，任振興，陸松俠，高華武，田麗娜

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)，合肥230031）

目的探討不同體積的自體血液致大鼠硬膜下血腫模型穩(wěn)定性的影響。方法 將大鼠隨機分為假手術(shù)組和300 μL、500 μL、700 μL(即分別向硬膜下注射300 μL、500 μL、700 μL的自體血液）模型組。分別于術(shù)后第2、4、6、8、10、14天，每組各取6只，以腹主動脈取血，取腦組織，并采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA）方法測定各組大鼠血漿中NSE、S100B蛋白的含量。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，300 μL組血液的NSE在第2、4天時顯著增加(P＜0.01），在第6、8天時漸漸減少(P＜0.05），說明血腫開始消散，在第10、14天時恢復(fù)到接近假手術(shù)組(P＞0.05）；500 μL組和700 μL組的NSE含量在第2、6、8、10、14天時都顯著升高(P＜0.01），而在第4天時升高不明顯(P＞0.05）。300 μL組血液的S100B蛋白含量在第4天時較高(P＜0.01），在第2、6天時較低(P＜0.05），在第8、10、14天時含量接近假手術(shù)組(P＞0.05），說明血腫自行消散，損傷自行修復(fù)；500 μL組和700 μL組的S100B蛋白含量一直處于較高的狀態(tài)(P＜0.05）。結(jié)論 相對于300 μL組和700 μL組，500 μL組下的大鼠急性硬膜下血腫模型穩(wěn)定性更好，能夠更好的應(yīng)用于大鼠急性硬膜下血腫的實驗研究。

注血量；大鼠；急性硬膜下血腫模型；穩(wěn)定性；NSE；S100B蛋白

硬膜下血腫是由于多種原因?qū)е嘛B內(nèi)出血并聚集于硬膜下腔所形成的一種常見的神經(jīng)外科疾?。?，2］。由于其可呈多發(fā)性，并常伴腦實質(zhì)損傷或與別種血腫合并發(fā)生。臨床上，局灶性顱腦損傷中硬膜下血腫占10％ ～20％，是腦疝常見的病因之一。急性硬膜下血腫在病因，病情轉(zhuǎn)變等方面仍然存在許多問題亟待解決，但是因為缺少穩(wěn)定、標(biāo)準(zhǔn)的硬膜下血腫動物模型，致使目前對硬膜下血腫的機制研究多停留于收集和分析臨床樣本資料，由此可見實驗動物模型的建立，在硬膜下血腫研究中占有重要地位，其對明確損傷機制，評價治療效果，尋找新的治療方法，判斷預(yù)后等起著關(guān)鍵作用。通過對文獻(xiàn)的調(diào)研發(fā)現(xiàn)在造模過程中向硬膜下注入的自體血的量各不相同，有注入300 μL，500 μL以及700 μL不等，結(jié)合本實驗室前期的實驗研究發(fā)現(xiàn)在注入300 μL自體血液時，在第6天左右血腫已經(jīng)基本消散，不能很好的模擬臨床表現(xiàn)，同時為藥物研究帶來很多不明確性。神經(jīng)元特異性烯醇化酶neuron sPecific enolase(NSE）［3-5］、S100B［6］蛋白是兩種存在于神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的特異性蛋白，正常情況下，由于腦細(xì)胞和血腦屏障的完整性，NSE和S100B蛋白在外周血中表達(dá)濃度很低，當(dāng)顱腦損傷時，神經(jīng)元細(xì)胞和血腦屏障受到損傷，NSE、S100B蛋白將不同程度地釋放進(jìn)入外周血，其在血漿中濃度與腦損傷程度密切相關(guān)。因此，本實驗研究通過采用注射自體血的方法向大鼠硬膜下腔注射不同劑量的自體血液，對比各注血量模型大鼠在注血后第2、4、6、8、10、14天時的血腫消散情況，結(jié)合各時間點血漿中NSE和S100B蛋白含量的比較，來探討注血量對模型穩(wěn)定性的影響，以期獲得一種更精確、更貼近該病病理生理情況的動物實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

1 實驗材料

1.1 動物

健康SD大鼠216只，體重(200±20）g，雄性，由安徽省實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(皖）2011-002。實驗動物使用許可證號是：SYXK(皖）2011-007。

1.2 藥品和試劑

大鼠神經(jīng)特異性烯醇化酶(NSE）96T：南京建成分裝進(jìn)口；大鼠S100B蛋白(S-100B）96T：南京建成分裝進(jìn)口。

1.3 儀器設(shè)備

RT-6000酶標(biāo)儀：雷杜；JW3021HR離心機：安徽嘉文；GL-88B漩渦混合器：其林貝爾儀器制造公司；0.5-10 μL移液器：EPPendorf；200 μL移液器：EPPendorf；1000 μL移液器：EPPendorf；Strong -204牙科鉆：Saeshin公司；50-300 μL排槍：EPPendorf；DNP-9052BS-III電熱恒溫箱：上海三發(fā)。

2 實驗方法

2.1 動物分組

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后隨機分為假手術(shù)組(36只）和300 μL、500 μL、700 μL(即分別向硬膜下注射300 μL、500 μL、700 μL的自體血液）模型組(各60只）。假手術(shù)組不注射自體血液，其余步驟同造模步驟。

2.2 模型建立

取SD大鼠，腹腔注射3.5％水合氯醛，麻醉后將大鼠頭部固定于腦立體定向儀上，常規(guī)備皮消毒，行頂部正中直切口，長約0.50 cm，偏右側(cè)剝離頭皮及肌層，顯露右側(cè)冠狀縫與矢狀縫；楔形高速鉆頭于右側(cè)冠狀縫，矢狀縫右側(cè)旁開3.00 mm處鉆一直徑0.90 mm骨窗，采集股靜脈血l mL以50 μL/s速度經(jīng)微量注射器注入硬膜下腔隙，分別于300 μL組注入300 μL血液，500 μL組為500 μL血液，700 μL組注入700 μL血液，進(jìn)針過程應(yīng)避免針尖刺穿蛛網(wǎng)膜，假手術(shù)組同樣進(jìn)行上述手術(shù)處理但不注射自體血液。造模過程中用加熱毯保持37℃為大鼠保持體溫，接呼吸機，防止因在注血過程中對大鼠腦部的刺激引起的呼吸暫停導(dǎo)致的死亡。

2.3 動物處死、取材

造模后分別于第2、4、6、8、10、14天處理各組大鼠，每次各組各取6只。用3.5％的水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，收集血液8 mL，4℃，3 000 r/min離心15 min，取上清液-20℃保存以待檢測。

2.4 檢測指標(biāo)

2.4.1 各劑量組模型死亡率比較：對造模過程中大鼠的成活與死亡情況進(jìn)行統(tǒng)計，錄入表格。

2.4.2 不同注血劑量各時間點的血腫大?。好看未笫蟾怪鲃用}取血后斷頭剝離顱骨暴露腦部，取下并拍照記錄血腫消散情況。

2.4.3 血漿中NSE、S100B蛋白含量的測定：血漿中NSE、S100B蛋白含量的測定，統(tǒng)一由安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥理實驗室檢測。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。死亡率比較采用卡方檢驗，各組NSE和S100B含量的比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 不同注血量組的成活率比較

對造模過程中大鼠的成活與死亡情況進(jìn)行統(tǒng)計，做出死亡分布表，見表1。計算成活率，做卡方檢驗，結(jié)果顯示總體具有差異(P＜0.05），見表2.

3.2 不同注血量組自體血液在造模過程中的消散情況

由實驗結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，300 μL劑量組在第6天已經(jīng)開始消散在第8天已完全消失，而500 μL和700 μL劑量組始終都有血腫出現(xiàn)，且 700 μL劑量組有較大量的血腫保留(圖1～4，見封三）。

3.3 不同注血量組自體血液對急性硬膜下模型大鼠血漿中NSE含量的影響

由檢測結(jié)果表明，假手術(shù)組大鼠血漿中NSE含量基本平衡在濃度為650 μg/L。與假手術(shù)組比較，各注血量組相應(yīng)時間點的NSE含量對比如下：300 μL組24 h后大鼠血漿中NSE含量顯著上升(P＜0.01），第4天達(dá)到峰值，差異有顯著性(P＜0.01），第6、8天時NSE含量有所下降，但差異仍有顯著性(P＜0.05），第10、14天時已經(jīng)下降到接近于假手術(shù)組水平；500 μL組和700 μL組24 h后大鼠血漿中NSE含量顯著上升(P＜0.01），第4天下降致最低(P＜0.05），第6、8天內(nèi)一直上升，差異有顯著性(P＜0.01），第10、14天開始平穩(wěn)，且差異仍具有顯著性(P＜0.01）。

對同一時間點的各組之間對比結(jié)果如下：第2天時，300 μL、500 μL、700 μL組與假手術(shù)組相比有顯著性(P＜0.01），700 μL組與300 μL組相比差異有顯著性(P＜0.01）；第4天時，300 μL組與假手術(shù)組相比差異有顯著性(P＜0.01），700 μL組與假手術(shù)組相比差異也有顯著性(P＜0.05），500 μL和700 μL與300 μL組相比差異有顯著性(P＜0.01）；第6天時，300 μL、500 μL、700 μL組與假手術(shù)組相比差異有顯著性(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01）；第8天時，300 μL、500 μL、700 μL組與假手術(shù)組相比差異有顯著性(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01），500 μL組與300 μL組相比差異有顯著性(P＜0.05），700 μL組與500 μL組相比有顯著性(P＜0.05）；第10天時，500 μL、700 μL組與假手術(shù)組相比差異有顯著性(P＜0.01，P＜0.01），500 μL、700 μL組與300 μL組相比差異有顯著性(P＜0.01，P＜0.01）；第14天時，500 μL、700 μL組與假手術(shù)組相比差異有顯著性(P＜0.01，P＜0.01），500 μL、700 μL組與300 μL組相比差異有顯著性(P＜0.01，P＜0.01）。見圖5。

表1 急性硬膜下血腫造模中大鼠的死亡分布Tab.1 Distribution of death of the rats during acute subdural hematoma modeling

表2 不同劑量組造模成功后死亡率的比較Tab.2 ComParison of the mortality of rats after successful modeling by injection of different dose of autologous blood

3.4 不同注血量組自體血液對急性硬膜下模型大鼠血漿中S100B含量的影響

由檢測結(jié)果表明，假手術(shù)組大鼠血漿中S100B含量基本平衡在濃度為26 μg/L?，F(xiàn)以假手術(shù)組相應(yīng)時間點的S100B含量為對照，與各注血量組不同時間點的S100B含量進(jìn)行對比：300 μL組48 h后大鼠血漿中S100B含量顯著上升(P＜0.05），96 h達(dá)到峰值，差異有顯著性(P＜0.01），第6天時含量有所下降，但仍具有顯著性(P＜0.05）第14天已經(jīng)下降到接近假手術(shù)組水平；500 μL組48 h后大鼠血漿中S100B含量顯著上升(P＜0.05），96 h下降至第1個低谷，與假手術(shù)組相比仍有顯著性(P＜0.05），第6天上升，到第8天達(dá)到峰值，與假手術(shù)組相比具有顯著性(P＜0.01），第10天下降至第二個低谷與假手術(shù)組相比仍有顯著性(P＜0.05）。700 μL組48 h后大鼠血漿中S100B含量顯著上升(P＜0.05），96 h有所下降，差異具有顯著性(P＜0.01），第6天下降至低谷，與假手術(shù)組相比差異不明顯，在這之后其含量開始上升并在第10天達(dá)到峰值，差異有顯著性(P＜0.01），第14天又有所下降，但差異仍有顯著性(P＜0.01）。

對同一時間點的各組之間做對比結(jié)果如下：第2天時，300 μL、500 μL、700 μL組與假手術(shù)組相比差異有顯著性(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01），500 μL和700 μL組與300 μL組相比差異有顯著性(P＜0.05，P＜0.01）；第4天時，300 μL和500 μL組與假手術(shù)組相比差異有顯著性(P＜0.01，P＜ 0.05）；第6天時，300 μL和500 μL組與假手術(shù)組相比差異有顯著性(P＜0.01，P＜0.05），700 μL組與500 μL組相比差異有顯著性(P＜0.05）；第8天時，300 μL和500 μL組與假手術(shù)組相比差異有顯著性(P＜0.01，P＜0.05），500 μL組與300 μL相比有差異顯著性(P＜0.01），700 μL組由于500 μL組相比差異有顯著性(P＜0.01）；第10天時，500 μL和700 μL組與假手術(shù)組相比差異有顯著性(P＜0.05，P＜0.01），700 μL組與300 μL相比差異有顯著性(P＜0.01），700 μL組由于500 μL組相比差異有顯著性(P＜0.01）；第14天時，500 μL和700 μL組與假手術(shù)組相比差異有顯著性(P＜0.01），500 μL和700 μL組與300 μL相比差異有顯著性(P＜0.01）(圖6）。

圖5 各組大鼠血漿中NSE的含量Fig.5 The contents of NSE in Plasma of rats

圖6 各組大鼠血漿中S100B的含量Fig.6 The contents of S100B in Plasma of rats

4 討論

NSE占顱內(nèi)全部可溶性蛋白的1.5％。其含量從高到低依次為腦、脊髓、周圍神經(jīng)節(jié)，而后者的NSE水平遠(yuǎn)低于顱內(nèi)，相差10～100倍。免疫組化法觀察到腦損傷前NSE僅存在于神經(jīng)元細(xì)胞漿內(nèi)，損傷后NSE從損傷的神經(jīng)元內(nèi)“漏出”，跨過受損的血腦屏障進(jìn)入體循環(huán)，因而可在外周血中檢測到NSE濃度明顯升高。S100B蛋白對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膠質(zhì)細(xì)胞和雪旺氏細(xì)胞具有高度特異性，S100B在其他組織中含量很低，其腦內(nèi)主要分布于星形膠質(zhì)細(xì)胞、雪旺細(xì)胞、某些神經(jīng)元細(xì)胞等，S100B蛋白分子正常情況不能通過血腦屏障，但顱腦損傷后，腦組織的損傷導(dǎo)致腦細(xì)胞和血腦屏障的破壞，使血S100B蛋白迅速升高，如有繼發(fā)性損傷，血腦屏障進(jìn)一步破壞，膠質(zhì)細(xì)胞破壞引起 S100B蛋白外溢，其含量變化與臨床癥狀、體征及影像學(xué)改變密切相關(guān)，為判斷腦損傷嚴(yán)重程度的良好指標(biāo)。

通過本實驗研究表明，假手術(shù)組大鼠血漿中的NSE含量水平基本平衡，維持在650 μg/L，300 μL組大鼠造模成功后血漿NSE含量顯著上升并于4 d到達(dá)高峰與假手術(shù)組的第一個時間點比較差異具有顯著性，第6天時已經(jīng)下降到接近與假手術(shù)組水平，這與大腦血腫觀察到的結(jié)果相符，第10、14天時在大腦中已經(jīng)觀察不到血腫存在，表明血腫已經(jīng)自行消散，這對于藥物干預(yù)來研究其對硬膜下血腫消散的影響已經(jīng)失去了意義；500 μL和700 μL組在大鼠造模成功后血漿NSE含量顯著上升，在第4天下降至低谷，隨后一直上升，說明血腫在第4天機體的應(yīng)激反應(yīng)使得血腫發(fā)生轉(zhuǎn)歸，隨后繼續(xù)上升可能是由于血腫導(dǎo)致的持續(xù)性繼發(fā)性損傷所造成，嚴(yán)重影響神經(jīng)元細(xì)胞和BBB的完整性，這與臨床的發(fā)病情況相吻合。

對比各時間點各組的NSE含量發(fā)現(xiàn)，在造模成功后第2天各組的NSE含量均顯著高于假手術(shù)組，500 μL組和700 μL組也顯著高于300 μL組，700 μL組與500 μL組相比無顯著性差異，第4天時300 μL組的含量高于假手術(shù)組，具有顯著性差異，而500 μL組和700 μL組均顯著低于假手術(shù)組，這可能與機體的失代償有關(guān)，第6天時各組對比假手術(shù)組均有顯著性差異，第8天時，各組對比假手術(shù)組仍然具有顯著性，但是300 μL組含量已經(jīng)大大降低，500 μL組的含量顯著高于300 μL組和700 μL組，第10天時300 μL組的NSE含量已經(jīng)基本與假手術(shù)組相當(dāng)，無統(tǒng)計學(xué)差異，而500 μL組和700 μL的含量相當(dāng)，均顯著高于300 μL組，第14天時500 μL和700 μL組的含量仍相當(dāng)，均顯著高于300 μL組，說明從第8天開始300 μL組血腫所造成的影響已經(jīng)基本消失，而500 μL組和700 μL組繼發(fā)性的損傷還在持續(xù)。

對模型大鼠血漿中S100B含量的分析表明：假手術(shù)組大鼠血漿中的S100B含量水平基本平衡，維持在26 μg/L，300 μL組大鼠造模成功后血漿S100B含量顯著上升并于第4天時到達(dá)高峰與假手術(shù)組的第一個時間點比較具有顯著性差異，第6天時已經(jīng)下降到與假手術(shù)組水平相近，這與大腦血腫觀察到的結(jié)果相符，第10、14天時在大腦中已經(jīng)觀察不到血腫存在，表明血腫已經(jīng)自行消散，這對于藥物干預(yù)來研究其對硬膜下血腫消散的影響已經(jīng)失去了意義；500 μL和700 μL組大鼠，造模成功后血漿S100B含量顯著上升，500 μL組在第4天下降至第1個低谷，隨后一直上升至第10天出現(xiàn)第2個低谷，亦說明血腫在第4天機體的應(yīng)激反應(yīng)使得血腫發(fā)生轉(zhuǎn)歸，隨后繼續(xù)上升可能是由于血腫導(dǎo)致的持續(xù)性繼發(fā)性損傷所造成，嚴(yán)重影響神經(jīng)元細(xì)胞和BBB的完整性，這與臨床的發(fā)病情況相吻合。而700 μL組的S100B含量在第6天達(dá)到低谷后一直上升。

對比各時間點各組的S100B含量發(fā)現(xiàn)，在造模成功后第2天時，各組的S100B含量均顯著高于假手術(shù)組，500 μL組和700 μL組也顯著高于300 μL組，700 μL組與500 μL組相比無顯著性差異，第4天時300 μL組的含量高于假手術(shù)組具有顯著性，第6天時各組對比假手術(shù)組均有顯著性差異，造模成功后第8天時，各組對比假手術(shù)組仍然具有顯著性，但是300 μL組含量已經(jīng)大大降低，500 μL組的含量顯著高于300 μL組和700 μL組，第10天時300 μL組的S100B含量已經(jīng)基本與假手術(shù)組相當(dāng)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而500 μL組和700 μL的含量相當(dāng)，均顯著高于300 μL組，但700 μL組要高于500 μL組且具有顯著性差異，第14天時500 μL和700 μL組的含量仍相當(dāng)，均顯著高于300 μL組，說明從第8天開始300 μL組血腫所造成的影響也已經(jīng)基本消失，而500 μL組和700 μL組繼發(fā)性的損傷仍然在持續(xù)。

通過對比NSE和S100B含量在造模成功后各組與假手術(shù)組相應(yīng)時間點的比較以及各時間點組間的比較，我們發(fā)現(xiàn)500 μL組和700 μL組更接近臨床的病理情況，由于700 μL組的死亡率明顯高于500 μL組，而500 μL組與300 μL的死亡率無顯著差異，綜上所述，此次研究確定500 μL的自體血致大鼠急性硬膜下血腫模型的穩(wěn)定性較好，為最佳造模劑量。

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Stability of acute subdural hematoma in rats developed by subdural injection of different volumes of autologous blood

WANG Jian，LONG Zi-jiang，REN Zhen-xing，LU Song-xia，GAO Hua-wu，TIAN Li-na
(Anhui University of Chinese Medicine，Hefei 230031，China）

Objective To exPlore the stability of rat models of subdural hematoma PrePared by subdural injection of different volumes of autologous blood.Methods The rats were randomly divided into sham grouP(36），300 μL blood grouP，500 μL blood grouP，and 700 μL blood grouP(each grouP 60 rats）.The rats of model grouPs

subdural injection of 300 μL，500 μL，or 700 μL autologous blood，resPectively.At the PostoPerative 2nd，4th，6th，8th，10th，14th days，blood samPles were taken from the abnormal aorta，and the brains were taken out for gross examination and taking PhotograPhs，six rats were used for each time.Enzyme linked immunosorbent assay(ELISA）was Performed to determine the content of serum NSE and S100B Proteins in the rats in each grouP.Results ComPared with the sham oPeration grouP，the serum NSE in the 300 μL grouP was significantly increased at the 2nd and 4th days(P＜0.01），and then gradually reduced at the 6th and 8th days(P＜0.05），indicating that the hematoma began to disaPPear，and at the 10th and 14th days returned to a similar level of the sham oPeration grouP(P＞0.05）.In the 500 μL and 700 μL blood grouPs，the NSE contents at 2nd，6th，8th，10thand 14th days were significantly increased(P＜0.01），but not significantly increased at the 4th day(P＞0.05）.The content of S100B Protein in the 300 μL blood grouP wassignificantly higher at the fourth day(P＜0.01），lower at the 2nd and 6th days(P＜0.05），and at 8th，10th and 14th days was similar to that in the sham oPeration grouP(P＞0.05 for all），indicating that the hematoma disaPPeared gradually，and the damages rePaired.The S100B Protein content of the 500 μL and 700 μL blood grouPs was constantly kePt at a higher level(P＜0.05）.Conclusions ComPared with the 300 μL ad 700 μL blood grouPs，the rat model of subdural hematoma develoPed by subdural injection of 500 μL autologous blood is the best，and can be used for studies of rat subdural hematoma.

Subdural injection；Rat；blood；Acute subdural hematoma；Stability；NSE；S100B Protein

R-33 < class="emphasis_bold">【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

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1671-7856（2015）09-0045-06

10.3969.j.issn.1671.7856.2015.009.008

王鍵(1956-）男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中醫(yī)治則治法、中醫(yī)藥防治心腦血管疾病與新安醫(yī)學(xué)研究。

2015-08-07

簡報