薛佳佳,于之清,趙瑩,李文,馬金友,余燕

（河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003）

甘油三酯（triacylglyceride,TG）是高等真核生物脂肪的主要儲(chǔ)存形式,其水解過程是機(jī)體主要的能量來源.脂滴（lipid droplets,LD）是一個(gè)以中性脂為核的細(xì)胞器,動(dòng)物能量攝入不足時(shí),以LD形式儲(chǔ)存的TG在脂肪酶的作用下分解為甘油和游離脂肪酸（free fatty acid,FFA）,進(jìn)而氧化分解為機(jī)體供能.較早被發(fā)現(xiàn)的脂肪酶是激素敏感酯酶（hormone sensitive lipase,HSL）,因其對(duì)激素高度敏感而得名.起初,人們一直以為HSL是催化甘油三酯發(fā)生脂解反應(yīng)的唯一關(guān)鍵酶和限速酶[1].但隨著HSL基因敲除小鼠的出現(xiàn),這一結(jié)論受到質(zhì)疑.2004年,三個(gè)獨(dú)立的科研小組同時(shí)證明了甘油三酯脂肪酶（adipose triglyceride lipase,ATGL）這種non-HSL是催化機(jī)體TG反應(yīng)第一步中起著關(guān)鍵作用的酶[2-4].現(xiàn)在認(rèn)為,正常情況下ATGL和HSL以一個(gè)連續(xù)的方式調(diào)節(jié)脂肪代謝,即：ATGL水解TG為DG和FFA,HSL再水解DG為單酰甘油和游離脂肪酸,單酰甘油再?gòu)奶枪羌苌献罱K裂解出脂肪酸和甘油,脂肪酸經(jīng)β-氧化進(jìn)入三羧酸循環(huán)釋放能量.在哺乳動(dòng)物中,ATGL主要分布在脂肪組織,但在心臟、肝臟、肺臟、肌肉等器官組織中也有少量分布[3,5-6].禽類有關(guān)ATGL的研究主要集中在脂肪組織上[7-8],而對(duì)其他組織的研究相對(duì)較少.本文通過qRT-PCR技術(shù),對(duì)18日齡雞胚的15種組織進(jìn)行研究,旨在為進(jìn)一步研究該基因在禽類不同組織中的功能提供基礎(chǔ)資料.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與取材 挑取蛋質(zhì)重在65～70 g的Ross肉雞受精蛋（河南大用雞場(chǎng)）10枚,放入智能自動(dòng)孵化器（山東德州孵化設(shè)備廠）中孵化.孵化條件：37.5±0.2℃,相對(duì)濕度（55±2）%.在孵化的第18胚齡（E18）,隨機(jī)選取6只雞胚,按每100 g體質(zhì)量100 mg烏拉坦麻醉后,心臟取血處死,分別采集脾臟、腿肌、胸肌、十二指腸、回腸、空腸、肝臟、卵黃囊、腺胃、皮下脂肪、肺、心臟、下丘腦、腎、法氏囊共15種組織,用預(yù)冷的的0.01 mol/LPBS（pH 7.4）沖洗,液氮冷凍后轉(zhuǎn)移至超低溫冰箱內(nèi)保存,用于mRNA表達(dá)分析.

1.1.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI GenBank雞ATGL（NM_001113291）和 β-actin（NM_205518）的基因序列,使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物GatglF：GTGAAGAAAGCCAAGAAGAAGCTG,GatglR：ACAAGCTGACGCT GGTACTCC；GactF：TCCACCGCAAATGCTTCTAAAC,GactR：CTGCTGACACCTTCACCATTCC,由上海生物工程技術(shù)有限公司合成,擴(kuò)增片段大小分別為194 bp和169 bp,其中β-actin為內(nèi)參.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 雞胚ATGL總RNA提取及cDNA合成 液氮中進(jìn)行組織研磨,使用TRIzol reagent、氯仿、異丙醇、DEPC水、無水乙醇提取E18各組織樣品總RNA,用Rnase free water充分溶解,儀器檢測(cè)濃度,-80℃保存?zhèn)溆?取1μg總RNA,進(jìn)行去除基因組DNA反應(yīng)后,根據(jù)Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明以RT Primer Mix為引物合成cDNA.

1.2.2 各組織ATGL cDNA PCR擴(kuò)增 以各組織cDNA為模板進(jìn)行半定量PCR擴(kuò)增反應(yīng).反應(yīng)體系：Taraka Premix Ex Taq（loading dye mix）12.5 μL,引物 1 μL（F+R）,cDNA 2 μL,dH2O 9.5 μL,總共 25 μL.以管家基因β-actin做參照,半定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系同上.擴(kuò)增條件為：98℃、30 s,98℃、10 s,55℃、30 s,72℃、70 s,30個(gè)循環(huán),72℃延伸5 min,4℃終止反應(yīng).擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳分離,在BIO-RAD Quantity One Basic凝膠成像系統(tǒng)拍照.

1.2.3 ATGL轉(zhuǎn)錄表達(dá)的實(shí)時(shí)定量PCR 實(shí)時(shí)定量PCR（qTR-PCR）按照SYBR premix Ex TaqⅡ（Takara,RR820A,Dalian,China）試劑盒指導(dǎo)說明配制,反應(yīng)在 ABI 7300（Applied Biosystems,Marsiling,Singapore）儀器上完成.反應(yīng)體系如下：總體積 20 μL,其中 2×SYBR mix 10.0 μL,正反引物各 0.5 μL（20 μM）,dye II 0.4 μL,cDNA 2 μL（標(biāo)準(zhǔn)曲線確定為 1∶10 稀釋）,補(bǔ)充滅菌雙蒸水至總體積為 20 μL；每個(gè)樣品 3 個(gè)重復(fù).反應(yīng)程序如下：95℃、30 s,95℃、5 s,58℃、20 s,72℃、34 s,40個(gè)循環(huán)；在第二階段第三步收集熒光數(shù)據(jù)（72℃、34 s）.同時(shí),運(yùn)用熔解曲線分析確認(rèn)引物擴(kuò)增的特異性.試驗(yàn)重復(fù)3次.反應(yīng)結(jié)束后,根據(jù)ABI 7300儀器數(shù)據(jù)包運(yùn)用2-△△CT法對(duì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析.

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)應(yīng)用 SAS軟件（version 8.01；SAS Institute,Cary,NC）進(jìn)行多重比較（post hoc test）統(tǒng)計(jì)分析,P＜0.05為差異顯著.

2 結(jié)果與分析

2.1 雞胚各組織總RNA的提取和引物特異性檢測(cè)

提取到的總RNA經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳,可見28S、18S和較弱的5S三條rRNA條帶,提示RNA完整,微量分光光度計(jì)檢測(cè),A260/A280均在1.8～2.0范圍內(nèi).反轉(zhuǎn)錄后,以cDNA為模板擴(kuò)增,可見189 bp和169 bp兩條帶（見圖1）,未出現(xiàn)非特異性條帶,說明引物特異性高.

圖1 ATGL在E18胚齡雞胚各組織中引物特異性電泳圖Fig.1 Electrophoretic map of ATGL primer specificity in different tissues of chicken embryos on E18

2.2 雞胚各組織ATGL m RNA的qRT-PCR檢測(cè)

熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明（見圖2）,ATGL mRNA的表達(dá)水平在皮下脂肪中最高,為11.38,顯著高于其他組織（P＜0.05）,其次是卵黃囊（5.117）,在腿肌、十二指腸、空腸、回腸、肝臟、腺胃、肺、心臟、丘腦、腎臟、法氏囊等組織中表達(dá)量較低（分別為 1.000、0.553、0.445、0.234、0.222、1.379、5.117、0.970、0.797、2.893、0.761、0.475、0.788）,而在脾臟中沒有檢測(cè)到 ATGL mRNA 的表達(dá).

圖2 E18雞胚ATGL組織分布Fig.2 Tissue distribution of ATGL in chicken embryos of E18

3 討論

本文對(duì)E18雞胚15個(gè)組織ATGL的分布進(jìn)行了研究,結(jié)果表明,E18雞胚皮下脂肪中ATGL mRNA表達(dá)水平顯著高于其他組織,這與Lee等[7]對(duì)21日齡雞ATGL組織分布的研究結(jié)果相同.同時(shí),我們發(fā)現(xiàn)卵黃囊中ATGL mRNA也顯著高于其他組織,這可能是由于E18雞胚的營(yíng)養(yǎng)主要來源于卵黃囊.然而,在胚胎階段卵黃囊中的脂肪動(dòng)員并不需要ATGL參與[9-10],具體原因還有待于進(jìn)一步研究.此外,ATGL mRNA在雞胚心臟等組織中也有少量表達(dá),而且表達(dá)量也有差異,這與Lee等[7]的研究結(jié)果也是一致的,說明ATGL的表達(dá)不但存在于脂肪細(xì)胞,在有脂滴的細(xì)胞或組織具有表達(dá),表達(dá)量的多少可能和該組織或細(xì)胞中脂肪細(xì)胞或脂滴含量多少有關(guān).本試驗(yàn)在脾臟組織中未檢測(cè)到ATGL mRNA的表達(dá),這可能與該組織中ATGL含量極低有關(guān).研究結(jié)果表明ATGL在雞胚的多種組織中都有分布,尤其在脂肪含量高的組織中表達(dá)量相對(duì)較高,其在各組織中表達(dá)的差異性也說明ATGL的分布具有組織特異性.

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