崔闊澍，陳 龍，于肖夏，鞠天華，于 卓，肖 特，聶利珍，姜 超

(1.內蒙古農業(yè)大學農學院，內蒙古 呼和浩特 010019；2.赤峰天澤生物科技有限公司，內蒙古 赤峰 025457)

四倍體彩色馬鈴薯分子遺傳連鎖圖譜構建研究

崔闊澍1，陳 龍1，于肖夏1，鞠天華2，于 卓1，肖 特1，聶利珍1，姜 超1

(1.內蒙古農業(yè)大學農學院，內蒙古 呼和浩特 010019；2.赤峰天澤生物科技有限公司，內蒙古 赤峰 025457)

以四倍體彩色馬鈴薯(‘黑美人’，‘MIN-021’)雜交F1代單株無性株系群體為材料，利用SSR分子標記技術及作圖軟件(TetraploidMap)進行了彩色馬鈴薯分子遺傳連鎖圖譜的構建研究.結果表明：從255對SSR引物中篩選出34對條帶清晰穩(wěn)定、多態(tài)性豐富的適宜引物，對‘黑美人’בMIN-021’雜種F1的210個單株無性系及其雙親的基因組DNA進行PCR擴增共得到201個多態(tài)性標記.用這201個SSR標記對雙親分別作圖，首次構建了四倍體彩色馬鈴薯的分子遺傳連鎖框架圖譜.母本圖譜含129個標記，12個連鎖群總長度為1 167 cM，標記間平均距離為9.04 cM；父本圖譜含131個標記，12個連鎖群總長度為1 187 cM，標記間平均距離為9.06 cM.

彩色馬鈴薯；四倍體；SSR標記；遺傳圖譜構建

彩色馬鈴薯是指塊莖薯肉為紫、紅等顏色的馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)，簡稱彩薯.[1]彩色馬鈴薯不僅含有普通黃肉、白肉馬鈴薯品種的營養(yǎng)成分，還富含抗氧化物質——植物花青素(anthocyanin)，具有抗氧化、抗病毒、護肝、抗癌等多種保健功能.[2]在國外，彩薯作為功能食品已被大眾所接受，彩薯育種、栽培等研究備受關注.隨著我國人民生活水平的提高，彩薯開始逐漸為人們所認識，近年來一些研究單位及企業(yè)開始引種彩薯，并開展了新品種的選育工作，彩薯產業(yè)將會越來越受到重視.[3]分子遺傳連鎖圖譜的建立是作物重要性狀QTLs定位分析及分子標記輔助育種的重要基礎.國外關于馬鈴薯遺傳連鎖圖譜的構建研究起步較早，自Bonierbale等(1988)采用RFLP分子標記首次構建了二倍體馬鈴薯分子遺傳連鎖圖譜以來[4]，已有不少學者開展了馬鈴薯的遺傳作圖研究，并構建了多張馬鈴薯圖譜[5]，其中最為著名的是荷蘭瓦赫寧根大學Han van Os等(2006)利用SSR，RFLP和AFLP標記構建的馬鈴薯“超密圖譜”[6].Meyer 等(1998)采用AFLP分子標記技術最先構建了四倍體馬鈴薯的遺傳連鎖圖譜，其母本圖譜含231個標記，父本圖譜含106個標記[7].我國馬鈴薯遺傳連鎖圖譜的構建研究起步較晚，迄今只有金黎平等(2007)構建了含170個AFLP標記的二倍體馬鈴薯遺傳連鎖圖譜[8]，以及單友蛟(2010)構建的含86個SSR標記的遺傳圖譜[9].

上述遺傳連鎖圖譜的構建均以普通黃肉和白肉的馬鈴薯為材料，而對彩色馬鈴薯遺傳連鎖圖譜的構建研究尚未見報道.近幾年來，為培育彩色馬鈴薯新品種，我們根據優(yōu)缺點互補、生態(tài)型差異大的親本選配原則，將美國引進的四倍體彩色馬鈴薯材料‘MIN-021’與國內育成的彩色馬鈴薯品種‘黑美人’相組配，人工去雄授粉雜交后成功獲得了雜種F1代群體.本試驗以該四倍體彩色馬鈴薯雜種F1代分離的210個單株無性株系為材料，利用SSR分子標記構建了彩色馬鈴薯的分子遺傳連鎖圖譜，旨為下一步開展彩色馬鈴薯高密度分子連鎖圖譜的構建、花青素色素含量等重要性狀的QTL定位及分子標記輔助育種提供依據.

1 材料與方法

1.1 供試材料及其來源

材料為四倍體(2n=4x=48)彩色馬鈴薯‘黑美人’בMIN-021’雜種F1代的210個單株無性株系及其親本.母本‘黑美人’是蘭州隴神航天育種研究所育成品種，其薯塊橢圓形，芽眼淺，紫皮紫肉，產量和花青素含量中等，適應性強；父本‘MIN-021’于2009年引自美國加州大學，其薯塊近圓形，芽眼淺，紅皮紅肉，產量和花青素含量較高.2011年夏季組配親本，通過人工授粉雜交獲得雜交種子；2012年春季利用雜交種子在溫室內育苗獲得F1代實生苗210株，深秋收獲單株塊莖形成F1分離群體無性系一代，觀察發(fā)現F1代群體單株薯塊的薯皮薯肉性狀及地上部植株形態(tài)性狀分離明顯，變異較大；2013年春季田間播種，出苗后按單株提取基因組DNA，用于彩色馬鈴薯分子遺傳圖譜的構建研究.

1.2 研究方法

1.2.1 DNA的提取與檢測

苗期取親本及其雜種F1代各無性系單株材料的幼嫩葉片，采用植物基因組試劑盒(北京天根公司生產)提取DNA，用1.6%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度，將DNA濃度稀釋至約50 ng/μL后，置于-20℃冰箱中冷凍保存?zhèn)溆?

1.2.2 SSR-PCR反應體系及程序

SSR分析參照Feingold等提出的方法[10]，并在張自強等[11]建立的馬鈴薯SSR-PCR反應體系和反應程序的基礎上進行了優(yōu)化.SSR-PCR反應體系為：含Mg2+的10×Buffer 2.0 μL，0.225 mmol/L的dNTPs 1.6 μL，0.5 μmol/L的上、下游引物各1.0 μL，50 ng/μL的模板DNA 1.5 μL，5 U的Taq酶0.15 μL，ddH2O補足至20 μL.反應程序為：95℃預變性3 min；94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min.

1.2.3 PCR擴增產物檢測

用7%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測擴增產物，上樣量為5 μL，電泳恒定功率為70 W，電泳時間為1.2 h.膠板用蒸餾水漂洗1次，在染色液中銀染16 min，取出蒸餾水中速漂10 s，放入顯影溶液中直至條帶清晰后用蒸餾水漂洗2 min，風干后進行掃描.[12]

1.2.4 SSR引物來源

從NCBI基因庫中獲得馬鈴薯基因組序列，用Primer 5.0網頁版及DNAMAN軟件自主設計馬鈴薯EST-SSR引物堿基序列54對，編號設定為C系列.并利用NCBI網站公布的201馬鈴薯SSR特異性引物堿基序列，委托上海生工有限公司合成255對SSR引物.

1.2.5 SSR多態(tài)性位點統(tǒng)計

采用0/1賦值法，即在等位位點上出現條帶記為1，無條帶記為0，條帶缺失或不清記為9，按條帶從大到小的順序記錄，建立0，1型二元數據矩陣，統(tǒng)計多態(tài)性位點.多態(tài)性位點百分率P=(K/N)×100%，式中K為多態(tài)位點數目，N為所測位點總數.[13]

1.2.6 SSR標記偏分離統(tǒng)計

根據孟德爾遺傳分離規(guī)律和卡方檢驗原理，當P<0.05時視為偏分離標記.[14]

1.2.7 SSR分子遺傳圖譜構建

采用TetraploidMap軟件構建彩色馬鈴薯分子遺傳連鎖圖譜[15].

2 結果與分析

2.1 SSR引物篩選及多態(tài)性分析

用雙親及其8個表型差異明顯的F1代單株基因組DNA為模板進行PCR擴增，從255對SSR引物中選出條帶清晰、重復性好、多態(tài)性豐富的適宜引物34對，其中C系列引物8對，S系列引物28對.利用這34對引物對F1代分離群體210個單株無性系及其雙親的DNA進行擴增，得到235個清晰、穩(wěn)定的SSR位點，平均每個引物擴增出6.91個位點，其中多態(tài)性位點201個，多態(tài)性位點百分率為85.53%，表明供試材料的SSR多態(tài)性豐富(見表1、圖1).

表1 SSR引物及供試材料的PCR擴增結果

M：Maker；1：♀黑美人；2：♂MIN-021；3～93：F1單株無性株系

圖1 引物C3對親本及F1分離群體部分單株無性株系的SSR擴增結果

2.2 群體中SSR標記的分離分析

由表2可知，F1分離群體中來自雙親的SSR標記的比例接近1∶1，表明后代均衡分離且雙親在后代遺傳中占有同等重要的地位.經卡方檢驗，母本有27個標記、父本有28個標記呈現不同程度的偏分離，其平均偏分離比例分別為20.93%和21.37%(P<0.05)，符合作物一般分子標記遺傳作圖時偏分離比例小于30%的要求.[16]

表2 SSR分子標記的偏分離分析

129個標記中有69個標記來自母本黑美人，131個標記中有71個標記來自父本MIN-021，另有60個標記為雙親共有標記.

2.3 遺傳圖譜的構建及其基本特征分析

用TetraploidMap for Windows作圖軟件按SSR標記的親本來源進行連鎖分析，分別得到母本(黑美人)和父本(MIN-021)的遺傳連鎖圖，母本的129個SSR標記(含27個偏分離標記)和父本的131個SSR標記(含28個偏分離標記)均全部分布在各自的12個連鎖群上(見圖2、圖3、表3、表4).

母本的連鎖圖總長度為1 167 cM，標記間平均間距9.04 cM，12個連鎖群長度范圍在27～224 cM之間，各連鎖群平均間距變幅為6.75～21.60 cM.其中，最長的連鎖群LGMa1覆蓋基因組224 cM，有29個標記；最短的連鎖群LGMa4覆蓋基因組27 cM，僅有4個標記.

父本圖譜的總長度為有1 187 cM，標記間平均間距為9.06 cM，各連鎖群長度變幅為27～215 cM，平均圖距變幅為 5.53～18.00 cM.連鎖群LGFe1覆蓋基因組215 cM，有23個標記，為最長連鎖群；連鎖群 LGFe5為27 cM，有4個標記，為最短的連鎖群.

由表3、表4還可以看出，雙親遺傳連鎖圖譜的平均間距均<10 cM，各標記在圖譜中分布較均勻，只有個別密集區(qū)，表明圖譜的總體質量較好，可用于彩色馬鈴薯花青素含量等重要性狀的QTL定位研究.

圖2 ♀‘黑美人’的SSR分子遺傳連鎖圖譜

圖3 ♂‘MIN-021’的SSR分子遺傳連鎖圖譜

表3 ♀‘黑美人’分子遺傳圖譜的基本特征

表4 ♂‘MIN-021’分子遺傳圖譜的基本特征

3 討論

3.1 作圖群體的選擇

構建作物遺傳連鎖圖譜的群體通常有兩類：第一類是單株分離的暫時性群體，如雜種F2代及其自交家系F3代、F4代等；第二類為株系分離的永久性群體，如RILs，BILs，DH等[17].栽培馬鈴薯是同源四倍體(2n=4x=48)，基因型高度雜合，其兩個不同親本雜交后的雜種F1代漿果中每粒種子都是不同的基因型，且馬鈴薯以無性繁殖為主，每粒種子形成的植株其無性后代的基因型是穩(wěn)定的，一般使用F1代群體進行馬鈴薯分子連鎖圖譜的構建，群體的數量多在90～200個之間.[18]本試驗以‘黑美人’與‘MIN-021’兩個四倍體彩色馬鈴薯雜種F1代的210個單株無性株系為材料，田間觀察發(fā)現該群體的株高、花色、葉片、薯形、薯皮、薯肉等表型性狀分離明顯，適合彩色馬鈴薯遺傳圖譜的構建研究.

3.2 標記的偏分離

等位基因的偏分離是生物進化的重要原因之一[19].目前已在玉米、番茄、苜蓿等多種作物中報道了遺傳標記的偏分離現象[20-22].偏分離現象可能是由配子體選擇、遺傳漂變、物種的細胞學屬性或一些生物學原因引起的，它可能會改變重組估計結果.[23]分子標記在連鎖圖中偏分離的比例一般在30%以內，但也有遠高出這一比例的，這與所用標記類型、不同作物及群體有關.[8，16]Hackett[24]和Zhang等[25]的研究均表明偏分離標記并不影響分子遺傳連鎖圖的構建準確性.本研究中，雙親遺傳連鎖圖譜的偏分離標記比例均小于30%，其中母本圖譜上有27個SSR標記呈現偏分離(占20.93%)，父本圖譜上有28個標記呈現偏分離(占21.37%)，在對SSR標記進行連鎖遺傳分析時，每個偏分離標記均進入到雙親各自的遺傳連鎖群上，表明偏分離標記可以用于彩色馬鈴薯的遺傳作圖.另外，母本和父本各連鎖群的偏分離標記數目不同，有的連鎖群上偏分離標記數目較多，有的連鎖群上較少或沒有(見表3、表4)，這可能是由于偏分離區(qū)域與一些孢子體致死或配子體致死基因相關，尚有待進一步的深入研究.

3.3 作圖軟件選擇與連鎖圖譜構建

目前常用的遺傳作圖軟件是JoinMap.本研究采用的作圖軟件為國際上同源四倍體專用作圖軟件TetraploidMap for Windows，TetraploidMap軟件是Hackett等(2003)根據同源四倍體遺傳規(guī)律開發(fā)的專用作圖軟件，已應用于四倍體苜蓿和四倍體馬鈴薯等遺傳連鎖圖的構建[15].與JoinMap軟件相比，該軟件構建的分子連鎖圖譜不僅適合四倍體馬鈴薯的遺傳分離規(guī)律，增加了標記量，也提高了作圖的精確度；JoinMap軟件的作圖親本遵循純合或雜合二倍體分離規(guī)律，軟件僅提供CP模式來計算重組率和遺傳距離，且默認染色體假定出現交換干涉現象，從而導致其繪制的連鎖圖長度比TetraploidMap 軟件偏小；[26]TetraploidMap軟件首先根據分離群體的標記多態(tài)性、分離比等因素檢測父、母本基因型，判斷雙親基因型后通過極大似然估計(MLE)進行兩點雙邊檢驗，通過聚類分析確定標記排列最適順序，顯著提高了雙親作圖的精確度.[27]另外，計算圖距時JoinMap軟件僅提供單一的兩點測驗；而TetraploidMap軟件不僅用兩點測驗進行聚類，還提升了作圖的準確度，雖然計算機運行時間略長，但Stimulated annealing(模擬退火算法)計算出的圖距更加精確.[28]Bradshaw等利用AFLP和SSR兩種分子標記研究構建了具有代表性的四倍體非彩色馬鈴薯的分子遺傳連鎖圖譜，其父本‘Stirling’連鎖群總長度1 234 cM，母本‘12106ab’連鎖群總長度1 203 cM.[29]本試驗利用SSR標記首次構建了四倍體彩色馬鈴薯的分子遺傳連鎖圖譜，其中母本連鎖群總長度為1 167 cM，父本連鎖群總長度為1 187 cM，覆蓋基因組長度與Bradshaw的研究相近，但本圖譜僅用了SSR一種分子標記，標記數相對較少，標記間仍存在較大空隙，目前我們正在篩選AFLP遺傳標記擬對該圖譜進行進一步加密.

4 結論

試驗篩選出條帶清晰、重復性好、多態(tài)性豐富的彩色馬鈴薯適宜引物34對.用這些SSR引物對‘黑美人’בMIN-021’雜種F1代的210個單株無性株系及其雙親的基因組DNA進行了PCR擴增，得到201個多態(tài)性標記.采用TetraploidMap 軟件對雙親分別作圖，首次構建了四倍體彩色馬鈴薯的分子遺傳連鎖框架圖譜，其中母本圖譜含129個標記，12個連鎖群總長度1 167 cM，標記間平均間距9.04 cM；父本圖譜含131個標記，12個連鎖群總長度1 187 cM，標記間平均間距9.06 cM.

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(責任編輯：方 林)

Construction of SSR genetic linkage map for tetraploid colored potato

CUI Kuo-shu1，CHEN Long1，YU Xiao-xia1，JU Tian-hua2，YU Zhuo1，XIAO Te1，NIE Li-zhen1，JIANG Chao1

(1.Agronomy College，Inner Mongolia Agricultural University，Huhhot 010019，China；2.Chifeng Tianze Bio-Technique Co. Ltd，Chifeng 025457，China)

Using the hybrid F1population from a cross between ‘Hei meiren’ and ‘MIN-021’ as materials，constructed a genetic linkage map of colored potato by SSR molecular marker technology and tetraploid mapping software TetraploidMap. The results showed that a total of 34 suitable SSR primer pairs with clear，stable and high polymorphic bands were screened from 255 tested SSR primers. Then these suitable SSR primers were used to amply genome DNA of 210 hybrid F1individuals from a cross ‘Hei meiren’בMIN-021’ and their parents，and a total of 201 polymorphic markers were amplified. Using the 201 SSR markers，two genetic linkage maps for parents ‘Hei meiren’ and ‘MIN-021’ were constructed，respectively. The maternal map contained 129 SSR markers，which distributed on 12 linkage groups，and had a map length of 1 167 cM，with an average marker distance of 9.04 cM；the paternal map included 131 SSR markers，which distributed on 12 linkage groups，and had a map length of 1 187 cM，with an average marker distance of 9.06 cM.

colored potato；tetraploid；SSR marker；construction of genetic linkage map

1000-1832(2015)04-0116-07

10.16163/j.cnki.22-1123/n.2015.04.025

2014-11-26

國家科技支撐計劃資助項目(2012BAD02B05)；內蒙古自然科學基金重大項目(2013ZD03).

崔闊澍(1987—)，女，博士研究生；通訊作者：于卓(1958—)，男，博士，教授，博士研究生導師，主要從事馬鈴薯及飼用作物遺傳育種研究.

Q 943.2 [學科代碼] 180·5155

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