胥 威 盧永平

非綜合征性唇腭裂與TGFA基因rs 3771523位點SNP相關性的研究

胥 威 盧永平

目的 探討核心家庭中轉化生長因子α(TGFA)rs 3771523位點單核苷酸多態(tài)性(SNP)與非綜合征性唇腭裂(NSCL/P)的關系。方法 166例NSCL/P患者, 患者父母271例, 核心家庭111個。采用芯片檢測基因型, 進行家庭為基礎的關聯檢驗(FBAT)。結果 父母基因型分布未偏離HW平衡(P＞0.05)；NSCL/P核心家庭中rs 3771523等位基因G和等位基因A存在過低傳遞和過度傳遞。結論 TGFA基因rs 3771523等位基因A與NSCL/P的發(fā)生密切相關。

非綜合征性唇腭裂；家庭為基礎的關聯檢驗；轉化生長因子α

唇腭裂是新生兒中最常見的一種先天性發(fā)育畸形, 通常分為綜合征性和非綜合征性。將不伴發(fā)其他系統(tǒng)器官畸形的唇腭裂稱為非綜合征性唇腭裂(nonsyndromic cleft lip and/or cleft palate, NSCL/P)［1］。大量的研究表明, NSCL/P是一種多基因遺傳病, 其易感基因位點具有異質性。目前, 患者父母對照研究是復雜性疾病易感基因研究的一種新的設計方法,該方法采用患者及其父母為研究對象, 有效的避免了由于病例組和對照組間遺傳背景的差異而造成的虛假關聯, 還可以進行交互作用的分析。本研究以核心家庭為研究對象, 運用家庭為基礎的關聯檢驗(family based association test, FBAT)分析了TGFA基因rs 3771523單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)和NSCL/P發(fā)生的關系?，F報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2009年1月～2012年7月收住于中國醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院的NSCL/P患者166例(病者組), 患者父母271例(父母組), 核心家庭(患者及雙親)111個。經簽訂書面知情同意書后, 采集患者及父母外周血5 ml。

1.2 DNA提取、PCR擴增、特異性引物延伸、芯片雜交及基因多態(tài)性檢測 用TIANamp血液DNA提取試劑盒(TIANGEN)提取基因組DNA。PCR擴增體系為20 μl, 含DNA模板2.5 ng、Ex Taq DNA聚合酶0.05 U、1×buffer、dNTP 0.125 mM及引物0.4 μM。反應條件為94℃預變性10 min后, 94℃變性30 s, 57℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 35個循環(huán), 最后72℃延伸3 min。PCR產物純化后, 進行特異性引物延伸。體系為15 μl, 含純化產物5 μl、VentR(exo-)DNA聚合酶0.02 U、 dATP 0.375 μl、dTTP 0.375 μl、dGTP 0.375 μl、Cy3標記的dCTP 0.375 μl、特異性延伸引物0.025 μM。延伸反應條件為94℃預變性3 min后, 94℃變性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸45 s, 35個循環(huán), 最后72℃延伸3 min。將混合雜交液的延伸產物同點有探針的芯片進行雜交, 雜交條件為60℃ 1 h。清洗后, 掃描儀掃描芯片探針信號, 讀取基因型。

1.3 統(tǒng)計學方法 運用家庭為基礎的關聯檢驗統(tǒng)計軟件進行FBAT分析；病者組與父母組基因型分別做Hardy-Weinberg(HW)平衡檢驗。

2 結果

2.1 基因檢測結果 患者及父母基因型和等位基因分布情況及Hardy-Weinberg(HW)平衡檢驗結果見表1。父母基因型分布未偏離HW平衡(P＞0.05)。

表1 基因型和等位基因分布情況及Hardy-Weinberg平衡檢驗結果

2.2 NSCL/P核心家庭FBAT檢驗結果 rs 3771523等位基因G和等位基因A分別存在過低傳遞(P=0.019613, Z=-2.333)和過度傳遞現象(P=0.019613, Z=2.333)。

3 討論

轉化生長因子α屬于表皮生長因子家族, 在胚胎發(fā)育中有著重要的作用, 它可以刺激上皮細胞增生、誘導其分化。而唇腭裂的發(fā)生正是由于中間上皮細胞不能正常增生和分化, 從而導致發(fā)育中的面突不能正常融合。目前, 已發(fā)現了TGFA基因的356個SNP和20個插入/缺失與NSCL/P發(fā)病相關［2］, 但rs 3771523的研究極少。Machida等［3,4］分析了Marker2A(G3822A, C3827T, T3851C, A3879G)多態(tài)在日本NSCL/P患者和正常人之間沒有統(tǒng)計學差異, 但單體型Marker 2A-6與NSCL/P發(fā)病密切相關(P=0.0086)。本研究采用以核心家庭為基礎的分析方法, 分析了TGFA基因rs 3771523位點SNP與NSCL/P的發(fā)生關系。結果顯示：NSCL/P核心家庭中rs 3771523等位基因G和等位基因A分別存在過低傳遞和過度傳遞現象, 說明TGFA基因rs 3771523等位基因A與NSCL/P的發(fā)生密切相關。

［1］ 馬堅, 黃永清, 馬敏, 等.中國西部人群IRF6基因V274I位點SNP與非綜合征型唇腭裂相關性的研究.實用口腔醫(yī)學雜志, 2008, 24(3):417-421.

［2］ Vieira AR.Association between the transforming growth factor alpha gene and nonsyndromic oral clefts:a HuGE review.Am J Epidemiol, 2006, 163(9):790-810.

［3］ Machida J, Sato F, Kaetsu A, et al.Candidate genes for nonsyndromic cleft lip and palate.J Craniomaxillofac Sury, 2000, 28(suppl):50s.

［4］ Machida J, Yoshiura K, Funkhauser CD, et al.Transforming growth factor alpha(TGFA):genomic structure, boundary sequences, and mutation analysis in nonsyndromic cleft lip/palate and cleft palate only.Genomics, 1999, 61(3):237-242.

Research of correlation between non-syndromic cleft lip and/or palate and TGFA gene rs 3771523 locus SNP

XU Wei, LU Yong-ping.
Liaoning Provincial Research Institute of Family Planning, Shenyang 110000, China

Objective To explore the relationship between transforming growth factor α (TGFA) rs 3771523 locus single nucleotide polymorphism (SNP) and non-syndromic cleft lip and/or palate (NSCL/P) in nuclear families.Methods There were 166 NSCL/P patients, 271 parents, and 111 nuclear families.The genotypes were detected by microarray, and family-based association tests (FBAT) were performed.Results The genotype distribution of the parents was not diverged from HW balance (P＞0.05).In the NSCL/P nuclear families, over-transmission and under-transmission were found in rs 3771523 allele G and A.Conclusion There is a close relationship between TGFA gene rs 3771523 allele A and NSCL/P.

Non-syndromic cleft lip and/or palate; Family-based association tests; Transforming growth factor α

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.05.018

2014-09-29］

110031 遼寧省計劃生育科學研究院