張瑩瑩,石 楠,2,杜萍萍,申培立,李志輝,于宏偉,盧海強,蘇旭東,張 偉,檀建新,*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院,河北省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術中心,河北保定 071001;2.河北大學生命科學學院,河北保定 071002)

一株產(chǎn)谷氨酰胺轉氨酶菌株的分離、鑒定及其tgl的克隆表達

張瑩瑩1,石 楠1,2,杜萍萍1,申培立1,李志輝1,于宏偉1,盧海強1,蘇旭東1,張 偉1,檀建新1,*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院,河北省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術中心,河北保定 071001;2.河北大學生命科學學院,河北保定 071002)

用稀釋平板法從土壤樣品中分離到166株細菌菌株,通過凝膠法初篩和Folk比色法復篩,得到一株產(chǎn)谷氨酰胺轉氨酶(transglutaminase,TGase)的菌株,通過形態(tài)學、生理生化特征和16S rDNA序列比對證明該菌株是枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis),命名為TGase1318?？寺×嗽摼闠Gase的編碼基因tgl,序列長738bp,編碼由245個氨基酸組成的蛋白質(zhì);TGase的氨基酸序列與NCBI公布的B.subtilis的TGase相似性達94%～100%。用B.subtilis表達載體pTZ和E.coli表達載體pET21b分別構建了含tgl的重組質(zhì)粒,轉化B.subtilisWB800和E.coliBL21,tgl基因表達產(chǎn)物在70℃下可催化BSA交聯(lián),表明tgl在B.subtilis和E.coli中獲得了表達且表現(xiàn)出TGase活性,這為其在食品工業(yè)上的開發(fā)利用打下基礎。

谷氨酰胺轉氨酶,枯草芽孢桿菌,克隆和表達,16S rDNA

谷氨酰胺轉胺酶(Transglutaminase,簡稱TGase,EC2. 3. 2. 13)是一種催化?；D移反應的酶。它以肽鏈中谷氨酰胺殘基的γ-羧酰胺基作為?；w,?；荏w可以是多肽鏈中賴氨酸殘基的ε-氨基、伯胺基或水。通過催化食品中的蛋白質(zhì)的交聯(lián)反應,從而改善其凝膠性、黏度、乳化性等物理性質(zhì),在食品加工過程中有廣泛應用[1]。谷氨酰胺轉胺酶存在于動物、植物和微生物中,相對于動、植物來源的TGase的分離、提取、純化工藝復雜、回收率低、成本過高等缺點,微生物源的TGase可通過發(fā)酵法制備,具有產(chǎn)量高、易回收、成本低、不受季節(jié)限制等優(yōu)點,更適合工業(yè)化生產(chǎn)和應用[2]。

利用生物技術將編碼TGase的基因克隆并在適當受體微生物中表達,是提高TGase產(chǎn)量的有效途徑。目前,微生物谷氨酰胺轉胺酶(Microbial transglutaminase,MTG)表達的研究主要集中在對放線菌的tgl基因的克隆與表達上[3-5]。Kikuchi[6]等人利用Corynebacterium glutamicum構建了分泌型表達質(zhì)粒,可以直接表達具有酶活性的TGase,通過優(yōu)化發(fā)酵條件,使產(chǎn)量達到142mg/mL。有關枯草芽孢桿菌TGase的報道不少,但主要集中于TGase在芽孢形成時促進孢衣蛋白之間的交聯(lián)作用[7-8],而對tgl基因克隆和表達則鮮有報道[9]。鑒于芽孢的抗熱性,其TGase可能有較高的最適溫度,較放線菌來源的TGase可能更適合高溫條件下的食品加工。如果能夠通過基因工程的手段獲得高效表達源于Bacillus的TGase的重組菌株,則其將會在食品工業(yè)中起到重要的作用。

本研究從土壤中分離并篩選出產(chǎn)TGase的菌株,克隆了其tgl基因,導入了枯草芽孢桿菌和大腸桿菌進行表達,為提高TGase表達量提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

土壤樣品 河北省保定地區(qū),取地表5～15cm之間的土壤,裝入無菌袋中4℃保存;E.coliBL21 購自寶生物工程(大連)有限公司;B.subtilisWB800,pET21b和pTZ表達載體 為本實驗室保存;重組質(zhì)粒pET21b-tgl,pTZ-tgl和TGase表達菌株BL21-pET1b-tgl,WB800-pTZ-tgl 為本研究構建;試劑CBZ-Gln-Gly、鹽酸羥胺、還原性谷胱甘肽、L-谷氨酸-γ-單羥肟酸 均購自Sigma公司,其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑;質(zhì)粒提取試劑盒,膠回收試劑盒,pMD19-T載體和限制性內(nèi)切酶等分子生物學試劑 購自寶生物工程(大連)有限公司;PCR試劑、100bp marker(2000、1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100bp)、1kb marker(10、8、6、5、4、3、2、1kb) 購自北京康為世紀生物科技有限公司。

紫外分光光度儀 上海光譜儀器有限公司;JY96-IIN超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技有限公司;DYY-8C電泳儀 北京六一儀器廠;BINDA 2020D凝膠成像系統(tǒng) 北京賓達英創(chuàng)科技有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基:胰蛋白胨10.0g/L、酵母粉5.0g/L、NaCl 10.0g/L、瓊脂粉15.0g/L、蒸餾水1000mL,pH8.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨20.0g/L,可溶性淀粉20.0g/L、酵母粉2.0g/L、MgSO42.0g/L、KH2PO42.0g/L、K2HPO42.0g/L、蒸餾水1000mL,pH7.0

1.3 實驗方法

1.3.1 產(chǎn)酶菌株的分離與篩選

1.3.1.1 細菌的分離、純化 利用稀釋涂布平板法[10]在LB平板上分離土壤樣品中的細菌,30℃下培養(yǎng)2～3d,根據(jù)菌落形狀、大小、顏色等特征進行初步歸類,每一類隨機挑取單菌落劃線純化,并保存于4℃冰箱中備用。

1.3.1.2 初篩 將分離的菌種分別于LB液體培養(yǎng)基中活化后,轉接至含5mL發(fā)酵培養(yǎng)基的試管中,于30℃、200r/min培養(yǎng)6d后利用凝膠法初篩產(chǎn)酶菌株[11]。

1.3.1.3 復篩 對初篩選出的菌株用比色法進行復篩,測定上清液的谷氨酰胺轉胺酶活力。谷氨酰胺轉胺酶活力測定按照Folk的比色法[12]。終止反應后,12000r/min離心,棄去沉淀,測上清夜在 525nm下的吸光度。一個MTG酶活單位(1U/mL)定義為37℃下1min催化1μmol底物CBZ-Gln-Gly生成其單羥肟酸產(chǎn)物所需的酶量。

1.3.2 菌株的鑒定

1.3.2.1 形態(tài)學觀察和生理生化實驗 菌株鑒定參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[13]和《伯杰細菌鑒定手冊》[14]進行。

1.3.2.2 16S rDNA序列系統(tǒng)進化樹 按文獻[15]提取菌株TGase1318基因組作為模板,用16S rDNA通用引物5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′/5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′擴增16S rDNA。反應體系為:2μL模板DNA,上下游引物各1μL,2×EsTaq MasterMix 10μL,H2O 6μL。PCR反應條件:94℃、預變性10min,94℃變性45s、55℃退火45s、72℃延伸90s,30個循環(huán),72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收、連接、轉化、質(zhì)粒提取驗證后由北京六合華大基因科技股份有限公司測序。將菌株TGase1318的16S rDNA序列經(jīng)GenBank的BLAST檢索進行系統(tǒng)發(fā)育分析,選取屬內(nèi)同源性較高的細菌的16S rDNA序列進行遺傳距離計算,采用MEGA軟件的Neighbor-Joining模型和BioEdit軟件分析遺傳距離并繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3Tgl的克隆、測序和序列比對

1.3.3.1Tgl的PCR擴增和克隆 依據(jù)NCBI上已公布B.subtilis的TGase基因的起始序列,用DNAMAN設計引物,上游引物Tgl-5:5′-GCGGTCGAC ATGATTATTGTATCAGGAC-3′(下劃線為Sal I酶切位點);Tgl-3:5′-TAAAGCTTTTAGCGGACG ATGCGGAAAAG-3′(下劃線為Hind Ⅲ 酶切位點)。擴增反應體系為60μL:基因組DNA 2μL,引物(10μmol/L)各3μL,2×EsTaq MasterMix 30μL,ddH2O 22μL。PCR反應條件:94℃、預變性10min,94℃變性40s,58℃退火40s,72℃延伸1min,25個循環(huán),72℃終延伸10min。將PCR產(chǎn)物克隆入p-MD-19T的SalI和Hind Ⅲ位點之間,測序。

1.3.3.2 蛋白序列分析 利用NCBI BLAST、DNAMAN軟件分析TGase1318氨基酸序列。利用歐洲分子生物學開放軟件包EMBOSS(European Molecular Biology Open Software Suite),在線調(diào)用pepstats后,輸入TGase1318的TGase氨基酸序列,得到其一級結構和一些基本參數(shù)。用AntheProt軟件分析蛋白的等電點和蛋白二級結構,分別預測其α-螺旋、β-折疊、β-轉角、無規(guī)則卷曲的百分含量。利用Phyre2軟件對該菌株TGase進行蛋白的保守域和三級結構預測。

1.3.3.3 重組質(zhì)粒pTZ-tgl和pET-21b-tgl的構建 重組質(zhì)粒pTZ-tgl和pET21b-tgl的構建步驟如圖1所示,用SalI和HindⅢ 雙酶切1.3.3.1中的tglPCR產(chǎn)物和載體pTZ、pET21b,經(jīng)酶切膠回收后的tgl基因片段分別與載體pTZ和pET21b連接,轉化E.coliJM109。將驗證正確的重組質(zhì)粒命名為pTZ-tgl和pET21b-tgl。

圖1 表達載體pTZ-tgl和pET-21b-tgl的構建流程簡圖Fig.1 Flow chart of the construction of expression vectors pET-21b-tgl and pTZ-tgl

1.3.3.4 重組質(zhì)粒在E.coliBL21和B.subtilisWB800中的轉化 取重組質(zhì)粒pTZ-tgl加入已制備好的B.subtilisWB800的感受態(tài)細胞[16-17]中,至終濃度約1μg/mL,37℃靜置1h后200r/min振蕩培養(yǎng)3h,轉化液涂布在含有紅霉素(10μg/mL)LB平板上,培養(yǎng)過夜。挑取陽性轉化子驗證后命名為WB800-pTZ-tgl。

將重組質(zhì)粒pET-21b-tgl用熱擊法轉化E. coli BL21感受態(tài)細胞,涂布于含100μg/mL的氨芐青霉素LB平板上,經(jīng)37℃培養(yǎng),挑取陽性轉化子驗證后命名為BL21-pET21b-tgl。

1.3.4Tgl在E.coli和B.subtilis中的表達和BSA交聯(lián)反應 將WB800-pTZ-tgl和BL21-pET21b-tgl分別轉接至20mL含有紅霉素(10μg/mL)或氨芐青霉素(100μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中,37℃、200r/min震蕩培養(yǎng)到OD600為0.5時,分別加入終濃度為2%的D-Xylose和1mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG),誘導24h后收集菌體。

將誘導后的WB800-pTZ-tgl發(fā)酵液離心收集上清作為粗酶液,參照1.3.1.3方法測定谷氨酰胺轉氨酶的活性;同時將60μL粗酶液與30μL BSA(1mg/mL)[18]于70℃保溫不同時間,取30μL進行SDS-PAGE電泳分析。

將培養(yǎng)的BL21-pET21b-tgl用IPTG(1mmol/L)誘導后收集菌體,重懸于1mL Tris-HCl(20μmol/L,pH8.0)緩沖液中超聲破碎制備成粗酶液,取400μL粗酶液按1.3.1.3測定TGase的活性;取20μL粗酶液進行SDS-PAGE電泳來判定表達產(chǎn)物的大小和多少;同時取60μL粗酶液與30μL BSA(1mg/mL)在70℃保溫不同時間,取20μL進行SDS-PAGE電泳分析。以未經(jīng)IPTG誘導的BL21-pET21b-tgl菌裂解液作為對照。

2 結果與分析

2.1 菌株TGase1318的分離和鑒定

2.1.1 產(chǎn)TGase的芽孢桿菌的分離 經(jīng)稀釋平板法從土樣中分離到166株細菌,用酪蛋白凝膠反應初篩得到55株細菌。將這些菌株經(jīng)搖瓶培養(yǎng)用比色法測定TGase的活性,篩選到一株酶活為0.11±0.04U/mL的菌株,與其他菌株相比,其活性最高,命名為TGase1318,以此為出發(fā)菌株作進一步鑒定和異源表達分析。

2.1.2 菌株TGase1318的16S rDNA擴增和系統(tǒng)發(fā)育樹的構建 以產(chǎn)酶菌株TGase1318的基因組DNA為模板擴增16S rDNA得到長度約為1.5kb的DNA片段,1%瓊脂糖凝膠電泳結果見圖2。將16S rDNA擴增片段測序,證明該片段長1487bp。將該序列與多個NCBI公布的芽孢桿菌屬的菌株16S rDNA序列進行比對,用MEGA軟件構建了基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2),由圖可知其16S rDNA序列與枯草芽孢桿菌(B. subtilis)的同源性高達99%以上,證明菌株TGase1318為B.subtilis。

圖2 菌株TGase1318的16S rDNA的 PCR產(chǎn)物及其系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 16S rDNA PCR product of the strain TGase1318 and its phylogenetic tree注：M：1kb Marker；1：16S rDNA PCR 產(chǎn)物。

2.1.3 菌株TGase1318的形態(tài)及生理生化特征 將菌株TGase1318在LB平板上培養(yǎng),菌落呈圓形,烏白色,表面干燥,粗糙不透明,邊緣不規(guī)則(圖3)。挑取單個菌落鏡檢,該菌株為革蘭氏陽性、直桿狀細菌,在營養(yǎng)條件貧乏或生長條件不利的情況下形成芽孢(圖3,箭頭所指為芽孢)。將菌株TGase進行生理生化鑒定,結果見表1。從菌落特征、個體形態(tài)和生理生化鑒定結果可知,該菌株為枯草芽孢桿菌,與16S rDNA結果一致,因此確定菌株TGase1318為B.subtilis。

2.2 菌株TGase1318tgl基因的克隆和表達

2.2.1tgl基因的克隆 通過己知B.subtilis的tgl序列設計引物,以TGase1318基因組DNA為模板進行PCR擴增,經(jīng)過擴增后得到DNA條帶大小約740bp,PCR產(chǎn)物回收后用pMD-19克隆(圖4)。將tgl測序證明該基因編碼區(qū)全長738bp,與GenBank中已公布的B.subtilis的tgl基因序列比對,同源性在93%～99%之間,該基因已在GenBank中注冊(Accession number:1742195)。

表1 TGase1318的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of the strain TGase1318

注:+:陽性;-:陰性。

圖3 TGase1318在LB平板上的菌落形態(tài)、菌體及芽孢形態(tài)Fig.3 The morphology of cell, spore and colony of the strain TGase1318 on LB plate The arrow point to the spore of TGase1318 strain

圖4 菌株TGase1318的tgl基因的克隆Fig.4 cloning of tgl gene from TGase1318 strain注：1：tgl基因PCR產(chǎn)物； 2：經(jīng)Sal I/Hind III酶切后的 pMD-19T-tgl；M1：100bp Marker；M2:1kb Marker。

2.2.2tgl編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列及特性分析 由tgl基因序列推導出其編碼的TGase由245個氨基酸殘基組成,包括了20種常見的氨基酸,其中亮氨酸、異亮氨酸和丙氨酸含量最高,分別占11.43%、8.98%、7.76%。從氨基酸性質(zhì)看,該蛋白含57.55%的非極性氨基酸和42.45%的極性氨基酸,其中極性氨基酸中堿性氨基酸占13.47%,酸性氨基酸占11.43%。該蛋白分子量為28.29ku,預測的等電點為pI 6.71,為弱酸性蛋白。

根據(jù)氨基酸序列,基于GOR法預測的蛋白質(zhì)二級結構見圖5,其中α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)則卷曲分別占44%、14%、21%和21%,利用Phyre2軟件預測的TGase三級結構見圖6,它有四個α-螺旋、兩個β-折疊,蛋白的保守區(qū)預測在蛋白質(zhì)的中后段,位于第110～197個氨基酸殘基區(qū)域。將氨基酸序列與NCBI公布的TGase進行BLAST比對,表明該蛋白與現(xiàn)有B.subtilis的TGase同源性高達94%～100%,說明B.subtilis的TGase具有極強的保守性;與其他芽孢桿菌屬的TGase相比,同源性多在54%～75%之間,如與B.vallismortis、B.amyloliquefaciens、B.pumilus同源性分別為91%、72%和54%。

圖5 tgl編碼蛋白TGase的二級結構預測圖Fig.5 The secondary structure prediction of TGase encoded by tgl gene注：1：β-折疊；2：β-轉角；3：α-螺旋；4：無規(guī)則卷曲。

圖6 tgl編碼蛋白TGase的三級結構預測圖Fig.6 The tertiary structure prediction of TGase1318 encoded by tgl gene

2.2.3 含tgl基因的表達載體pTZ-tgl和pET21b-tgl的構建 克隆的tgl基因和分泌型穿梭表達載體pTZ、表達載體pET21b分別經(jīng)SalI和Hind Ⅲ雙酶切,回收后的tgl和載體連接后分別構建重組質(zhì)粒pTZ-tgl和pET21b-tgl(圖1),酶切分析結果證明兩個重組質(zhì)粒含有tgl基因(738bp)和pTZ(約8300bp)(或pET21b,約5440bp)載體,表明重組質(zhì)粒構建成功(圖7)。

圖7 含tgl基因表達載體的構建Fig.7 Construction of expression vectors (pET21b-tgl and pTZ-tgl) containing tgl gene注：M1：100bp Marker；M2：1kb Marker 1：經(jīng)Sal I/Hind II酶切后的pET21b-tgl； 2：經(jīng)Sal I/Hind III 酶切后的pTZ-tgl。

2.3 表達載體pTZ-tgl和pET21b-tgl在B.subtilisWB800和E. coli BL21中的誘導表達

將含分泌型表達載體pTZ-tgl的陽性菌株WB800-pTZ-tgl在含有紅霉素(10μg/mL)的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600為0.5時,加入木糖誘導24h后離心收集上清,測定谷氨酰胺轉氨酶的活性。結果表明TGase酶活較低僅為0.16±0.04U/mL,與出發(fā)菌株相似,但是粗酶液與BSA反應不同時間后進行SDS-PAGE電泳分析,可以看出表達的TGase能使BSA交聯(lián),并隨時間延長交聯(lián)程度增大(圖8),說明該菌株表達且將TGase分泌到了培養(yǎng)基中。但是SDS-PAGE電泳分析發(fā)酵液,未發(fā)現(xiàn)明顯的TGase條帶,表明表達量較低。

圖8 TGase對BSA的交聯(lián)作用Fig.8 The crosslink of BSA catalyzed by TGase注：1～4：BL21-pET21b-tgl與BSA混合溫育0，1，3 and 6h； 5～9：WB800-pTZ-tgl與BSA混合溫育0，1，3，6 and 12h。

有鑒于此,我們進而將tgl基因在大腸桿菌中進行了表達,將含pET21b-tgl的陽性菌株BL21-pET21b-tgl在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD6000.5左右,加IPTG誘導,24h后收集菌體并破碎,測定酶活為0.45±0.06U/mL,表明TGase在大腸桿菌中表達后活性得到很大提高。周建[19]、劉凱[20]等人將枯草芽孢桿菌轉入大腸桿菌中誘導表達TGase后用Folk比色法法難以測得TGase活性,本實驗通過比色法在WB800-pTZ-tgl發(fā)酵液中測到了較低的活性,而大腸桿菌表達后活性顯著增大,說明所構建的重組菌株TGase得到高效表達。將樣品進行SDS-PAGE電泳,結果表明,與對照相比,誘導后BL21-pET21b-tgl在28ku處有一明顯表達條帶(圖9),與TGase推測出的分子量相符,也與相關報道一致[21],證明tgl在BL21中得到了很好的表達。將樣品與BSA反應不同時間后進行SDS-PAGE電泳,結果表明隨著反應時間延長,BSA發(fā)生交聯(lián),分子量增大,不但在濃縮膠和分離膠之間形成明顯的大分子量蛋白質(zhì)交聯(lián)體,而且在點樣孔中也發(fā)現(xiàn)了明顯的蛋白沉積,且遠多余WB800-pTZ-tgl發(fā)酵液與BSA反應的樣品,表明tgl在大腸桿菌中較芽孢桿菌中表達效果更好,且活性明顯。與周建[19]等人用重組TGase蛋白催化BSA交聯(lián)的現(xiàn)像一致,并且本實驗證明TGase在70℃下具有高活性,與相關文章表述的該酶具有的高溫活性相符[21-22]。

圖9 tgl基因在E. coli BL21中的表達Fig.9 Expression of tgl in E. coli BL21注：M：低分子量蛋白Marker；1：未經(jīng)IPTG 誘導的 BL21-pET21b-tgl；2：經(jīng)TPTG誘導的BL21-pET21b-tgl。

3 結論與討論

通過凝膠法初篩及Folk比色法復篩,從土樣中分離得到的166株細菌中篩選到一株產(chǎn)谷氨酰胺轉氨酶的芽孢桿菌,命名為TGase1318。通過16S rDNA序列比對、生理生化實驗和形態(tài)學特征分析,鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌(B. subtilis)。

用PCR法克隆了該菌株的tgl基因,該基因長738bp,編碼的TGase由245個氨基酸組成,分子量為28.29ku,pI 6.71,與來自B.subtilis其他菌株的TGase相比有94%～100%的同源性。

構建了重組質(zhì)粒pTZ-tgl和pET-21b-tgl,并分別在B.subtilisWB800和E.coliBL21中成功地表達了TGase,WB800-pTZ-tgl發(fā)酵液和BL21-pET21b-tgl菌液都能在70℃下催化BSA發(fā)生交聯(lián)反應,大腸桿菌中活性達到0.45±0.06U/mL。

本研究對源于枯草芽孢桿菌的tgl基因成功地進行了異源表達,表達的TGase活性高于已有報道[19-20],并且在70℃下仍表現(xiàn)出明顯的對BSA的交聯(lián)作用,這一特性對高溫下的食品加工有潛在的利用價值。但tgl在枯草芽孢桿菌中表達量較低,還有待進一步改善。

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Isolation and identification of a transglutaminase producing strain and itstglcloning and expression

ZHANG Ying-ying1,SHI Nan1,2,DU Ping-ping1,SHEN Pei-li1,LI Zhi-hui1,YU Hong-wei1,LU Hai-qiang1,SU Xu-dong1,ZHANG Wei1,TAN Jian-xin1,*

(1.College of Food Science and Technology,Engineering Research Center of Hebei Province for Agricultural Products Processing,Agricultural University of Hebei,Baoding 071001,China;2.College of Life Science,Hebei University,Baoding 071002,China)

By using the dilution plate method,166 bacterial strains isolated from soil samples and one strain,TGase1318,which could produce transglutaminase,was obtained after screening with gel formation method and Folk’s colorimetry method. The strain was identified asBacillussubtilisaccording to the morphology,physiological and biochemical characters as well as 16S rDNA sequence homological analysis. Thetglgene,which was a 738 bp long nucleotide,was cloned from the strain and encoded a 245 residue long TGase. Homological analysis of TGase peptide sequence revealed that it shared 94%～100% conservation with TGase of otherB.subtilisstrains released by NCBI. The expression recombinant plasmids pTZ-tgl and pET21b-tgl were constructed and transformed intoB.subtilisWB800 andE.coliBL21,respectively. The results of BSA crosslink at 70℃ indicated thetglgene was expressed in bothB.subtilisandE.coliwith TGase activity. This study laid a foundation for the application of TGase fromB.subtilisTGase1318 to food industry.

transglutaminase;Bacillussubtilis;cloning and expression;16S rDNA

2014-08-25

張瑩瑩(1989-),女,碩士研究生,研究方向:環(huán)境微生物學。

*通訊作者:檀建新(1968-),男,博士,教授,研究方向:微生物資源開發(fā)與利用。

多谷物主食冷凍面團的關鍵技術研究(13227105D);植物多酚類功能性物質(zhì)對A(形成的影響(冀人社字[2010]195號)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)11-0141-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.020