楊秀芳， 王鵬飛， 馬養(yǎng)民， 賈強強

(陜西科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院 教育部輕化工助劑化學(xué)與技術(shù)重點實驗室, 陜西 西安 710021)

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黑果枸杞內(nèi)生真菌RER4次生代謝產(chǎn)物活性研究

楊秀芳， 王鵬飛， 馬養(yǎng)民， 賈強強

(陜西科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院 教育部輕化工助劑化學(xué)與技術(shù)重點實驗室, 陜西 西安 710021)

采用96孔板倍半稀釋法對黑果枸杞內(nèi)生真菌RER4次生代謝產(chǎn)物中分離純化得到的11個化合物的抑菌活性進行研究，測定獲得了化合物對大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、尖孢鐮孢菌、小麥赤霉病菌、蘋果樹腐爛病菌、番茄灰霉病菌的最小抑菌濃度(MIC).結(jié)果表明,黑果枸杞內(nèi)生真菌RER4次生代謝產(chǎn)物中9個化合物對細菌和真菌有不同程度的抑制作用，其中尿黑酸內(nèi)酯、2,5-二羥基苯乙酸甲酯對測試菌均表現(xiàn)出良好的抑制作用，pyranonigrins A和asperpyrones A對細菌生長有較好的抑制作用，5-hydroxymethylfuran-3-carboxylic acid對革蘭氏陽性菌有較好的抑制作用，尿黑酸內(nèi)酯、2,5-二羥基苯乙酸甲酯、pyranonigrins A對部分細菌的MIC達到7.8μg/mL.并對分離得到的化合物尿黑酸內(nèi)酯、2,5-二羥基苯乙酸甲酯、pyranonigrins A、rubrofusarin B、asperpyrones A的抗氧化活性進行研究，采用DPPH法測定自由基清除率，結(jié)果表明尿黑酸內(nèi)酯和2,5-二羥基苯乙酸甲酯具有良好的抗氧化性，抗氧化能力由強到弱順序為尿黑酸內(nèi)酯>2,5-二羥基苯乙酸甲酯>pyranonigrins A>asperpyrones A>rubrofusarin B.從測試結(jié)果分析了化合物與抗氧化活性的構(gòu)效關(guān)系.

內(nèi)生真菌； 黑果枸杞； 代謝產(chǎn)物； 抑菌活性； 抗氧化性； 構(gòu)效關(guān)系

0 引言

植物內(nèi)生真菌是一種具有廣泛的分布性、多樣性的生物類群，可產(chǎn)種類繁多，結(jié)構(gòu)新穎的次生代謝產(chǎn)物[1].研究表明，內(nèi)生真菌在長期和宿主植物協(xié)同進化的過程中，能夠產(chǎn)生與宿主植物相同或者類似的代謝產(chǎn)物[2]，利用藥用植物內(nèi)生真菌發(fā)酵生產(chǎn)藥理成分既可以彌補資源短缺，又可以為尋找天然藥物資源提供新的途徑.

黑果枸杞(Lyciumruthenicum)為茄科枸杞屬植物[3]，是我國西北荒漠地區(qū)一種特有的野生植物資源，其漿果呈球形，成熟后為紫黑色，無毒，有甜味，是一種亟待開發(fā)的野生植物資源[4]，多生長于我國甘肅、西藏、青海、陜北等干旱鹽堿地區(qū)[5]，其味甘、性平、清心熱,用于治療心熱病、心臟病、月經(jīng)不調(diào)、停經(jīng)等病癥，屬于傳統(tǒng)藏藥[6-8].現(xiàn)代醫(yī)學(xué)GEJE也證明，黑果枸杞具有降低人體膽固醇、興奮中樞神經(jīng)、增強人體免疫力、防止各類癌癥的功效[9].目前黑果枸杞研究多為果實花青素[10]、多糖[11]、色素[12]和黃酮[13]的提取及其抗氧化活性研究[14,15]，其內(nèi)生真菌僅在本課題組開展研究.

鑒于藥用植物內(nèi)生真菌具有潛在的重要應(yīng)用價值，課題組在前期研究中從黑果枸杞分離出81株內(nèi)生真菌，其中有21株在高鹽堿條件下分離得到，通過篩選發(fā)現(xiàn)活性菌株占76.19 %，高活性菌株占33.33 %[16].RER4在21株耐鹽堿真菌中表現(xiàn)出高的抑菌活性，因此以RER4為目標菌株，對RER4菌株進行ITS序列測定，最終將RER4菌株鑒定為米曲霉(Aspergillusoryzae),Genbank登錄號為KF198066.為全面了解菌株RER4所產(chǎn)生的其它次生代謝產(chǎn)物的類型，本文在對其發(fā)酵菌體化學(xué)成分研究的基礎(chǔ)上，對其生物活性進行檢測，以期為進一步的開發(fā)利用黑果枸杞內(nèi)生真菌資源奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

超凈工作臺,(ZHJH-C11098)，上海智城分析儀器制造有限公司；手提式蒸汽壓力滅菌鍋(YX-2803)，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；恒溫培養(yǎng)箱(DH5000B), 天津泰斯特儀器有限公司；酶標儀(HF2000)，北京華安麥科生物技術(shù)有限公司；costar96孔酶標板(3590),美國Corning Costar公司；baygene移液槍,S200,北京百晶生物技術(shù)有限公司；試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.2 菌種和培養(yǎng)基

供試的黑果枸杞內(nèi)生真菌RER4為本實驗室自行分離得到.

測試菌：大腸桿菌(E.coli)，綠膿桿菌(P.aeruginosa)，金黃色葡萄球菌(S.aureus)，枯草芽孢桿菌(B.subtilis)，尖孢鐮孢菌(Fusariumoxysporium)，番茄灰霉病菌(Botrytiscirerea)，小麥赤霉病菌(Gibberellasaubinerii)，蘋果樹腐爛病菌(Cytosporamandshurica).

馬玲薯葡萄糖液體培養(yǎng)基：將馬玲薯洗凈去皮，切片煮沸0.5 h，以紗布過濾，加入葡萄糖20 g，溶化后加水至1 000 mL.

NA培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，瓊脂20 g，蛋白胨10 g，氯化鈉l 5 g，水1 000 mL，pH7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min.

1.3 菌株的培養(yǎng)

內(nèi)生真菌的培養(yǎng)：馬玲薯葡萄糖液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，28 ℃，120 rpm搖瓶培養(yǎng)6 d，將上述種子液按照培養(yǎng)基10%的量加入滅菌后的大米培養(yǎng)基中，室溫下靜置培養(yǎng)28 d；測試菌分別由培養(yǎng)基NA、馬玲薯葡萄糖液體培養(yǎng)，28 ℃培養(yǎng)48 h，備用.

1.4 提取與分離鑒定

將內(nèi)生真菌RER4發(fā)酵產(chǎn)物干燥、粉碎、浸泡后，經(jīng)除糖處理得到浸膏，通過硅膠柱洗脫，得到5個組分Fr.1-Fr.5.其中對Fr.2(65 g)和Fr.3(60 g)以石油醚/乙酸乙酯梯度洗脫，經(jīng)多次使用硅膠柱層析、凝膠柱層析、重結(jié)晶等手段，從Fr.2分離純化到化合物1～5，從Fr.3分離純化得到化合物6～11.通過核磁共振、高分辯質(zhì)譜對上述化合物的結(jié)構(gòu)進行鑒定，依次為麥角甾醇(1)、尿黑酸內(nèi)酯(2)、6-檸檬酸甲酯(3)、1,5-檸檬酸二甲酯(4)、5-hydroxymethylfuran-3-carboxylic acid(5)、2,5-二羥基苯乙酸甲酯(6)、pyranonigrins A(7)、campyrones A(8)、4-乙酰氨基丁酸(9)、rubrofusarin B(10)、asperpyrones A(11).

1.5 抗菌活性測定

[17]的方法，將黑果枸杞內(nèi)生真菌RER4次生代謝產(chǎn)物分離純化后得到的11個化合物的抑菌活性進行測試.分別選取細菌金黃色葡萄球菌(S.aureus)，枯草芽孢桿菌(B.subtilis)，大腸桿菌(E.coli)，綠膿桿菌(P.aeruginosa)和真菌尖孢鐮孢菌(Fusariumoxysporium)，小麥赤霉病菌(Gibberellasaubinerii)，蘋果樹腐爛病菌(Cytosporamandshurica)，番茄灰霉病菌(Botrytiscirerea).將倍半稀釋后的不同濃度化合物添加到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中作為實驗組，以溶解化合物的試劑為空白組.再將活化后的指示菌配成105cfu/mL的菌懸液并接種，37 ℃培養(yǎng)24 h.觀察培養(yǎng)管底部是否有沉淀或渾濁，當(dāng)某一混合溶液透明澄清，則說明化合物在此濃度可以抑制該菌生長，該濃度即為樣品的最小抑菌濃度MIC.

1.6 抗氧化性測定

參照文獻[18]，對96孔板編號，按編號采用倍比稀釋法向各孔中分別注入100μL不同濃度的化合物的2 000μg/mL的甲醇溶液，再分別注入100μL 0.1 mg/mL DPPH甲醇溶液，混合，避光、室溫存放30 min，將酶標板在波長為517 nm下的酶標儀中測定吸光度，記錄每個孔中的吸光度值，重復(fù)實驗3次，以Vc為對照品，計算樣品對DPPH自由基清除率.

2 結(jié)果與討論

2.1 抑菌活性的測定

對分離純化得到的11個化合物的抑菌活性測試結(jié)果見表1.

表1 化合物抑菌活性測試結(jié)果

注：①CK1青霉素鈉，CK2硫酸鏈霉素，CK3酮康唑；②A大腸桿菌(E.coli)，B綠膿桿菌(P.aeruginosa)，C金黃色葡萄球菌(S.aureus)，D枯草芽孢桿菌(B.subtilis)，E尖孢鐮孢菌(F.oxysporium)，F(xiàn)小麥赤霉病菌(G.saubinerii)，G蘋果樹腐爛病菌(C.mandshurica)，H番茄灰霉病菌(B.cirerea).

抑菌活性測試結(jié)果表明：11個化合物中有9個化合物對4株細菌和4株真菌生長表現(xiàn)出不同程度的抑制作用.其中尿黑酸內(nèi)酯和2,5-二羥基苯乙酸甲酯對細菌和真菌均表現(xiàn)出較好的抑制作用，最小抑菌濃度達到7.8μg/mL；化合物pyranonigrins A和asperpyrones A對細菌生長有較好的抑制作用；化合物5-hydroxymethylfuran-3-carboxylic acid對革蘭氏陽性菌生長有較好的抑制作用，最小抑菌濃度為31.2μg/mL.

2.2 化合物的抗氧化活性

采用DPPH法對分離純化得到的含有酚羥基或者烯醇式結(jié)構(gòu)的化合物尿黑酸內(nèi)酯、2,5-二羥基苯乙酸甲酯、pyranonigrins A、rubrofusarin B、asperpyrones A的抗氧化活性測試，以試樣濃度和清除率為指標進行回歸分析，計算IC50，測試結(jié)果見表2所示.

表2 自由基清除率測試結(jié)果

從表2看出，6個化合物的抗氧化活性強弱順序為：尿黑酸內(nèi)酯>2,5-二羥基苯乙酸甲酯>pyranonigrins A>asperpyrones A>rubrofusarin B，其中尿黑酸內(nèi)酯、2,5-二羥基苯乙酸甲酯對DPPH的自由基清除率與Vc相當(dāng).結(jié)合化合物結(jié)構(gòu)(見表3所示)，分析化合物抗氧化性的構(gòu)效關(guān)系如下：

(1)尿黑酸內(nèi)酯、2,5-二羥基苯乙酸甲酯具有較強的抗氧化活性，是由于結(jié)構(gòu)中易氧化的酚羥基比例相對比較大；

(2)pyranonigrins A>asperpyrones A>rubrofusarin B，雖然三者都含有可形成氫鍵的酚羥基結(jié)構(gòu)，但pyranonigrins A相對較難形成氫鍵，因而抗氧化活性強于后兩者；而asperpyrones A強于rubrofusarin B的原因在于其結(jié)構(gòu)上含有一個可游離的酚羥基，其活性弱于pyranonigrins A的原因可能為其羥基處于的位置空間位阻較大，不易被氧化有一定關(guān)系.

對比結(jié)構(gòu)，結(jié)合試驗結(jié)果可得出結(jié)論：

(1)尿黑酸內(nèi)酯和2,5-二羥基苯乙酸甲酯屬于尿黑酸衍生物，從而推測具有尿黑酸結(jié)構(gòu)的化合物具有較強的抗氧化性.

(2)化合物抗氧化活性強弱取決于結(jié)構(gòu)上是否含有易被氧化的基團，該基團所連接位置的共軛鏈長短及空間位阻對其抗氧化活性具有較大影響.

3 結(jié)論

通過抑菌活性和抗氧化活性測試結(jié)果表明，尿黑酸衍生物具有廣譜的抑菌作用，內(nèi)生真菌RER4有望成為新的抗氧化和抗菌藥物的來源.也表明了植物內(nèi)生真菌具有豐富多樣的次生代謝產(chǎn)物，是開發(fā)新型藥物的重要來源.

表3 不同化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)及IC50值

續(xù)表3

化學(xué)結(jié)構(gòu)化合物IC50(μg/mL)PyranonigrinsA46.97RubrofusarinB401.77AsperpyronesA391.12

參考文獻

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Antimicrobial activity of the secondary metabolites of endophytic fungi RER4 fromLyciumruthenicum

YANG Xiu-fang， WANG Peng-fei, MA Yang-min, JIA Qiang-qiang

(College of Chemistry and Chemical Engineering, Key Laboratory of Auxiliary Chemistry & Technology for Chemical Industry, Ministry of Education, Shaanxi University of Science &Technology, Xi′an 710021， China)

The Minmum Inhibiting Concentration (MIC) of 11 compounds isolated from theLyciumruthenicumRER4 fungal secondary metabolites. were measured by microdilution method on 96-well plates againstE.coli,P.aeruginosa,S.aureus,B.subtilis，F(xiàn).oxysporium，G.saubinerii，C.mandshurica，B.cirerea.The results showed that 9 compounds exhibited different inhibition to bacterial and fungal growth.5-hydroxybenzofuran-2(3H)-one and methyl 2-(2,5-dihydroxyphenyl)acetate shown better inhibition to both bacteria and fungi,pyranonigrins A and asperpyrones A exhibited better bacterial growth inhibition,5-hydroxymethylfuran-3-carboxylic acid shown a special interesting to Gram-negative bacteria.5-hydroxybenzofuran-2(3H)-one,methyl 2-(2,5-dihydroxyphenyl and pyranonigrins Al had notable inhibiting microorganism activity to bacteria with the MIC7.8μg/mL.The antioxidant effects of compounds 5-hydroxybenzofuran-2(3H)-one,methyl 2-(2,5-dihydroxyphenyl)acetate,pyranonigrins A,rubrofusarin B,asperpyrones A were tested.The DPPH radical-scavenging capacity was measured against various concentrations with ascorbic acid as contrasts.The result of antioxidant activity test showed that the antioxidant activity of 5-hydroxybenzofuran-2(3H)-one and methyl 2-(2, 5-dihydroxyphenyl)acetate was equal to vitamin C for DPPH.Form strong to weak ordering 5-hydroxybenzofuran-2(3H)-one>methyl 2-(2, 5-dihydroxyphenyl)acetate>pyranonigrins A>asperpyrones A>rubrofusarin B.

endophytic fungi;Lyciumruthenicum; metabolites; antimicrobial activity; antioxidant activity; QSAR

2015-01-02

教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點專項基金科研項目(20116125110001)

楊秀芳(1963-)，女，陜西銅川人，教授，研究方向：天然產(chǎn)物的研究與開發(fā)

1000-5811(2015)03-0125-05

R932

A