夏崇才，周芙瓊，顧 寧，高運(yùn)軍，楊炳火

(南京市中醫(yī)院，江蘇 南京 210001)

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HPLC法測定冠心Ⅴ號合劑中丹參酮ⅡA含量

夏崇才，周芙瓊，顧 寧，高運(yùn)軍，楊炳火*

(南京市中醫(yī)院，江蘇 南京 210001)

目的：建立測定冠心Ⅴ號合劑中丹參酮ⅡA含量的HPLC方法。方法：采用高效液相色譜法，以甲醇-水(80∶20)為流動(dòng)相，色譜柱為Kromasil C18柱(4.6mm×250mm，5μm)，柱溫為30℃，流速為1.0mL·min-1，檢測波長為270nm。結(jié)果：丹參酮ⅡA在0.012 5～0.360 0μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，平均回收率為98.06%。結(jié)論：本方法簡便可行、重復(fù)性好，可用于測定冠心Ⅴ號合劑中丹參酮ⅡA的含量。

高效液相色譜法；冠心Ⅴ號合劑；丹參酮ⅡA；含量測定

冠心Ⅴ號合劑由丹參、黨參、赤芍、麥冬等中藥組成，功能益氣、養(yǎng)陰生津、安神，用于治療心悸、心律失常等心血管疾病。

方中丹參是唇型科植物丹參(SalviamiltiorrhizaBge)的干燥根和根莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品。丹參味苦，性微寒，入心、肝經(jīng)，具有活血調(diào)經(jīng)、祛瘀止痛、涼血消癰、養(yǎng)血安神、清心除煩的功效，是最常用的活血化瘀中藥之一[1-3]。丹參酮(tanshinone，Tsn)是丹參中具有橙黃色和橙紅色特征的脂溶性二萜類化合物，按其結(jié)構(gòu)的不同可分為丹參酮I、丹參酮ⅡA、丹參酮ⅡB、隱丹參酮、羥基丹參酮、二氫丹參酮I、異丹參酮、異隱丹參酮、丹參酮甲酯等十多種成分，其中丹參酮ⅡA(Tsn IIA)是丹參中脂溶性成分的代表。

臨床上丹參常用于治療胸痹、冠心病心絞痛、妊娠高血壓綜合征，用于重癥急性胰腺炎(SAP)并發(fā)腎功能損害的保護(hù)以及肝硬化門脈血流的調(diào)節(jié)[4-5]。丹參所含脂溶性成分丹參酮ⅡA具有抗心律失常、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、保護(hù)心肌細(xì)胞、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗纖維化、抗炎、抗血小板聚集、抗氧化、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和凋亡、改善抗糖尿病微血管并發(fā)癥等作用[6-7]。

鑒于丹參酮ⅡA的作用，其含量的高低直接影響冠心Ⅴ號合劑的臨床療效。因此，為了控制其質(zhì)量，本文采用HPLC法對冠心Ⅴ號合劑中丹參酮ⅡA的含量進(jìn)行測定。該方法簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可有效控制冠心Ⅴ號合劑的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Shimadzu 10Avp高效液相色譜儀(日本島津公司)；SPD-10Avp型檢測器(日本島津公司)；Du640型紫外分光光度計(jì)(Beckman)；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；FA1104電子分析天平(上海良平儀器儀表有限公司)；TS-0.5/20型超聲波(清華大學(xué)風(fēng)光儀器廠)；1612-1離心機(jī)(上海醫(yī)療器械有限公司)。

1.2 試藥

冠心Ⅴ號合劑(自制，批號為：20130721、20130725、20130801)；丹參酮ⅡA對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號110766-2007417)；甲醇為色譜純，水為重蒸水，其它試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流速：1.0mL·min-1；檢測波長：270nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL；流動(dòng)相：甲醇-水(80∶20)。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取丹參酮ⅡA對照品適量，置10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，制成濃度為4.5μg·mL-1的對照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液制備 稱取冠心Ⅴ號合劑1g，精密稱定，研勻，置10mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，密塞，稱定重量，超聲15min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液，備用。

2.2.3 陰性樣品溶液制備 參照制劑工藝過程制備缺丹參的陰性樣品，照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備缺丹參的陰性樣品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

2.3.1 供試品溶液色譜分離 分別取對照品溶液及供試品溶液10μL，注入高效液相色譜儀測試，丹參酮ⅡA的保留時(shí)間為13.7min。理論塔板數(shù)以丹參酮ⅡA計(jì)為1 723，供試品溶液中主峰與其它峰的分離度為1.8(見圖1)。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取對照品溶液10μL進(jìn)樣5次，記錄色譜峰面積，丹參酮ⅡA的RSD為1.74 %，表明精密度良好。

2.4 線性范圍

配制5個(gè)不同濃度(1.125、2.25、4.5、9、18、36μg·mL-1)的丹參酮ⅡA對照品溶液，分別取10μL注入色譜儀測定，記錄色譜圖，測出丹參酮ⅡA峰面積。以丹參酮ⅡA濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線形回歸方程為：A =79 359C +14 141，r=0.999 9。結(jié)果表明丹參酮ⅡA在0.012 5～0.360 0μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批冠心Ⅴ號合劑溶液，精密稱定6份，按擬定的含量測定方法，記錄色譜圖，量出主峰的峰面積，計(jì)算其含量，RSD為1.16 %，表現(xiàn)重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液，室溫放置，分別于0、2、4、6、8、12h進(jìn)樣，測得丹參素峰面積RSD為0.71 %，結(jié)果表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

圖1 各溶液HPLC圖譜

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的供試品6份，精密稱定，分別精密加入一定量的對照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法處理，并按上述色譜條件對丹參酮ⅡA含量進(jìn)行測定，計(jì)算回收率，其平均回收率為98.06 %，RSD為3.49 %。

2.8 樣品含量測定

精密稱取冠心Ⅴ號合劑1g，照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行含量測定，按外標(biāo)法計(jì)算3批冠心Ⅴ號合劑中各成分的含量，每批樣品配制3份溶液，每份進(jìn)樣2次，結(jié)果見表1。

表1 冠心Ⅴ號合劑樣品測定結(jié)果 (n=3)

3 討論

3.1 提取溶劑選擇

丹參酮ⅡA是方中君藥丹參藥材的指標(biāo)性成分，其具有抗血小板聚集、抗急性缺氧等作用，能穩(wěn)定紅細(xì)胞膜、抑制血小板功能和抗血栓形成等[8-11]。而丹參酮ⅡA屬于脂溶性物質(zhì)，故選擇測定其含量，對控制冠心Ⅴ號合劑的質(zhì)量具有重要意義。參照《中國藥典》(2010年版)，對甲醇、乙醇等提取溶劑進(jìn)行考察，結(jié)果顯示，以甲醇為提取溶劑時(shí)，有效成分丹參酮ⅡA提取率較高。

3.2 提取方法選擇

本實(shí)驗(yàn)同時(shí)分別采用超聲提取、回流提取、索氏提取3種方法進(jìn)行丹參酮ⅡA的提取，結(jié)果顯示，采用超聲提取15min提取率最高，且超聲提取方法操作簡便、省時(shí)。而回流和索氏提取溫度太高、超聲時(shí)間過長，破壞了有效成分，導(dǎo)致提取率降低。故最終確定以甲醇為提取溶劑，采用超聲提取15min。

3.3 流動(dòng)相選擇

，選擇甲醇-水為流動(dòng)相，并對甲醇-水的比例進(jìn)行考察，結(jié)果顯示，當(dāng)以甲醇∶水(80∶20)為流動(dòng)相時(shí)，基線平穩(wěn)，丹參酮ⅡA峰形較好，分離度大于1.5，理論塔板數(shù)大于1 500，出峰時(shí)間約為13.7min。故確定以甲醇∶水(80∶20)作為本實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相。

3.4 檢測波長選擇

取丹參酮ⅡA對照品溶液，在200～400nm范圍內(nèi)掃描，并參考《中國藥典》(2010年版)。結(jié)果顯示丹參酮ⅡA在270nm處有最大吸收，因此確定檢測波長為270nm。

丹參酮ⅡA遇光不穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)中丹參酮ⅡA對照品溶液的配制采用棕色容量瓶，供試品溶液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，并注意低溫避光保存。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法測定冠心Ⅴ號合劑中丹參酮ⅡA的含量。最佳色譜條件為：色譜柱為Kromasil C18柱(4.6 mm×250mm，5μm)，流動(dòng)相為甲醇-水(80∶20)，柱溫為30℃，流速為1.0mL·min-1，檢測波長為270nm。丹參酮ⅡA在0.012 5～0.360 0μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率為98.06%，RSD為3.49%。本實(shí)驗(yàn)所建立的方法簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好、回收率高，可用于有效控制冠心Ⅴ號合劑的質(zhì)量。

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(責(zé)任編輯：魏 曉)

Determination of Tanshinone ⅡA in Guanxin Ⅴ Mixture by HPLC

Xia Chongcai，Zhou Fuqiong，Gu Ning，Gao Yunjun，Yang Binghuo*

(Nanjing Hospital of TCM, Nanjing 210001, China)

Objective:To establish an HPLC method for the determination of tanshinone ⅡA in Guanxin Ⅴ Mixture by HPLC. Methods:：HPLC analytical method was established. The analysis was carried out on a column of Kromasil C18(4.6mm×250mm，5μm) with a mobile phase of methanol-water (80∶20) at the flow rate of 1.0 mL·min-1. The column temperature was 30℃. The detection wavelength was 270nm. Results:The linearity range of Tanshinone ⅡA was 0.012 5～0.360 0μg. The average recovery rate was 98.6% and RSD was 3.49%. Conclusion:This method is simple, rapid and accurate, and can be used to determine tanshinone ⅡA in Guanxin Ⅴ Mixture.

HPLC; Guanxin Ⅴ Mixture; Tanshinone ⅡA; Determination

2014-08-19

南京市衛(wèi)生局科技發(fā)展項(xiàng)目(201108005)

夏崇才(1966-)，男，江蘇省南京市中醫(yī)院副主任中藥師，研究方向?yàn)橹兴幹苿┘百|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

楊炳火(1966-)，男，江蘇省南京市中醫(yī)院副主任中藥師，研究方向?yàn)橹兴幹苿┘百|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

R284.2

A

1673-2197(2015)01-0030-03

10.11954/ytctyy.201501015