阮玲云 翁彩紅 陳世友 陳文星 賴春芬 艾柳英 胡開輝 孫淑靜

摘 ?要 ?以pET-28a-RFP質(zhì)粒為模板，PCR擴增紅色熒光蛋白（red fluorescent protein，RFP）基因，并克隆到真核表達載體pTE11上，置于RP27啟動子調(diào)控之下，成功構建表達載體pTE11-RFP。采用PEG介導轉(zhuǎn)化法，將pTE11-RFP轉(zhuǎn)入銀耳芽孢中。提取轉(zhuǎn)化子基因組DNA，RFP基因特異性引物擴增獲得與目的基因大小一致的特異條帶;日光下肉眼觀察轉(zhuǎn)化子略顯紅色，熒光顯微鏡觀察有明顯的紅色熒光。以上結果證明RFP基因已成功轉(zhuǎn)入銀耳芽孢并進行表達，RP27啟動子可以調(diào)控外源基因RFP在銀耳芽孢中的正確表達，為進一步研究外源基因在銀耳芽孢生物反應器中的高效表達奠定了一定的基礎。

關鍵詞 ?銀耳芽孢;紅色熒光蛋白基因;表達載體

中圖分類號 ?S567.34 ? ? ? ? ?文獻標識碼 ?A

Construction of Plasmid Vector and Expression

Identification of RFP Gene in Tremella fuciformis

RUAN Lingyun， WENG Caihong， CHEN Shiyou， CHEN Wenxing，

LAI Chunfen，AI Liuying，HU Kaihui， SUN Shujing*

College of Life Sciences， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract The RFP （red fluorescent protein）gene was obtained by polymerase chain reaction（PCR）in which plasmid pET-28a-RFP was used as a template， and cloned into pTE11 vector under the control of RP27 promoter. The recombinant plasmid pTE11-RFP was successfully constructed as confirmed by enzymatic digestion and DNA sequencing. The PEG mediated transformation method was performed to transfer plasmid DNA of pTE11-RFP into yeast-like conidia of Tremella fuciformis. The expected amplified bands appeared when the chromosomal DNA of the transformants was used as the templates for the PCR with the RFP-specific primers. The colonies showed pink in tube and distinct red fluorescence could be observed from the colonies of YLCs by fluorescence microscopy. These results indicated that RFP gene was integrated into the genome of T. fuciformis and was expressed successfully by the regulation of RP27 promoter which laid the foundation for foreign gene expression in YLCs of Tremella fuciformis.

Key words ?Tremella fuciformis;RFP gene;Expression vector

doi ?10.3969/j.issn.1000-2561.2015.10.015

銀耳（Tremella fuciformis Berk.）也稱白木耳，主要含有蛋白質(zhì)、碳水化合物、多種維生素和氨基酸等，是一種經(jīng)濟價值很高在中國醫(yī)學中久負盛名的一種食藥用真菌[1]。銀耳的主要功能成分是多糖，具有輻射防護[2]、抗腫瘤[3]、抗氧化[4]、抗?jié)僛5]、保肝作用[6]、促進神經(jīng)細胞生長及改善記憶力[7]、淬滅致病細菌群體感應[8]等多方面的活性功效。銀耳子實體和芽孢均可食用，因其具有特殊的二型性生活史，既可采用人工栽培，又可以酵母狀芽孢的形式進行大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，因而成為遺傳轉(zhuǎn)化的理想材料[9]。目前已實現(xiàn)綠色熒光蛋白基因（gfp）[10-12]、人胰島素基因（BCA）[13]、透明顫菌血紅蛋白基因（VHb）[14]、多功能纖維素基因（mfc）[15]、人乳鐵蛋白基因（hlf）[16]、蜜蜂抗菌肽基因（AP）[17]、高賴氨酸蛋白基因（lys）[17-18]、潮霉素抗性基因（hph）[19]等轉(zhuǎn)化銀耳并建立了較為完善的遺傳轉(zhuǎn)化體系[19-20]。

紅色熒光蛋白（red fluorescent protein，RFP）是1999年由Matz等[21]從一種名叫Discosomasp sp.的珊瑚蟲體內(nèi)分離出來的熒光蛋白，能在紫外線激發(fā)下發(fā)出紅色熒光，因其熒光性質(zhì)穩(wěn)定，檢測方便，能大量表達且對細胞沒有毒性，可作為各表達系統(tǒng)中靈敏而有效的報告基因而倍受重視[22]。雖然紅色熒光蛋白的應用暫時還不及綠色熒光蛋白（GFP）廣泛，但由于其激發(fā)和發(fā)射波長較長（最大吸收波長為558 nm，最大發(fā)射波長為583 nm）的優(yōu)點，可以避免自體熒光的干擾，具有比綠色熒光蛋白更高的信噪比[23-24]，將成為研究銀耳芽孢中外源基因表達模式的一個重要工具。

本研究旨在探討以pTE11中的RP27啟動子調(diào)控RFP基因構建真核表達載體的可行性，檢測pTE11-RFP基因在銀耳芽孢中的轉(zhuǎn)化及表達情況，為進一步研究外源基因在銀耳芽孢生物反應器中的高效表達奠定一定的基礎。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?供試菌株 ? 銀耳芽孢供試菌株為福建農(nóng)林大學生命科學學院微生物工程實驗室保藏菌種;大腸桿菌Escherichia coli DH5α感受態(tài)細胞購買于TaKaRa公司（大連）。

1.1.2 ?載體 ? 含有RFP基因的質(zhì)粒pET-28a-RFP為福建師范大學黃義德老師贈送，pTE11真核表達載體為福建農(nóng)林大學王宗華老師贈送。

1.1.3 ?試劑與引物 ? 限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和SpeⅠ，PCR反應過程中所用的10×PCR Buffer、dNTP Mixture、rTaq酶和DNA Marker等均為TaKaRa公司（大連）產(chǎn)品;質(zhì)粒提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒均購自Omega Biotek公司;T4 DNA連接酶為賽默飛世爾科技公司（Thermo Fisher Scientific）產(chǎn)品;潮霉素B購自美國Calbiochem公司;溶壁酶為廣東省微生物研究所生產(chǎn);胰蛋白胨（Tryptone）和酵母粉（Yeast Extract）為英國Oxoid公司產(chǎn)品;其余常規(guī)試劑為國產(chǎn)分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.1.4 ?培養(yǎng)基及溶液的配制 ? LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10 g、酵母粉 5 g、NaCl 10 g，蒸餾水定容至1 L，pH 7.0-7.2;完全培養(yǎng)基（CM）：葡萄糖 20 g、蛋白胨 2 g、酵母膏 2 g、K2HPO4 1 g、KH2PO4 0.46 g、MgSO4 1 g，蒸餾水定容至1 L，pH自然;再生培養(yǎng)基（RM）：麥芽糖 10 g、葡萄糖 10 g、蛋白胨 2 g、K2HPO4 1 g、KH2PO4 0.46 g、MgSO4 1 g、0.6 mol/L的KCl、瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 L，pH自然;TPB緩沖液：0.6 mol/L KCl，25 mmol/L CaCl2·H2O;以上培養(yǎng)基及溶液0.11 MPa滅菌20 min備用。選擇培養(yǎng)基（SM）：RM培養(yǎng)基中加入過濾除菌的潮霉素，終濃度為100 μg/mL。PEG/S：往TPB緩沖液中加入聚乙二醇（PEG）4 000，使緩沖液中PEG終濃度為40%（W/V），過濾除菌。溶壁酶液：用0.6 mol/L KCl配制成2%（W/V）濃度的酶液，過濾除菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 ?方法

1.2.1 ?重組質(zhì)粒的構建與鑒定 ? 以pET-28a-RFP為模板，用分別含有BamHⅠ和SpeⅠ酶切位點的引物RFP-F和RFP-R擴增RFP全長基因，擴增條件：94 ℃預變性5 min（表1）;94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個循環(huán);72 ℃延伸5 min。參照分子克隆實驗基本操作[25]及試劑盒說明書用BamHⅠ和SpeⅠ對擴增出的RFP片段和載體pTE11進行酶切、連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，涂布Amp抗性的LB篩選平板，挑取陽性克隆進行雙酶切和測序驗證，將驗證正確的重組質(zhì)粒命名為pTE11-RFP。

1.2.2 ?銀耳芽孢的培養(yǎng) ? 將實驗室保藏的銀耳芽孢接入斜面培養(yǎng)基中，25 ℃活化培養(yǎng)4 d后取2環(huán)接入100 mL液體完全培養(yǎng)基（CM）中，于25 ℃、110 r/min的搖床中發(fā)酵培養(yǎng)5 d。

1.2.3 ?PEG介導轉(zhuǎn)化銀耳芽孢 ? 取適量銀耳芽孢發(fā)酵液，離心收集沉淀，用0.6 mol/L KCl洗滌2次后加入2%（W/V）的溶壁酶溶液，35 ℃水浴酶解約2 h，離心沉淀原生質(zhì)體，加入適量的TPB緩沖液使原生質(zhì)體終濃度為1×108個/mL。取處理后的銀耳芽孢100 μL與1.0 μg重組質(zhì)粒pTE11-RFP輕輕混勻，冰水浴5 min后加入50 μL的PEG/S，輕輕混勻，繼續(xù)冰浴5 min。再加入1 mL的PEG緩沖液，充分混勻后于25 ℃水浴30 min， 40 ℃熱激20 min，用再生液體培養(yǎng)基稀釋到合適濃度后，涂布于SM培養(yǎng)基，25 ℃培養(yǎng)6 d[26]。

1.2.4 ?轉(zhuǎn)化子的篩選與鑒定 ? 將在SM平板中長出的銀耳芽孢單菌落轉(zhuǎn)接至含有150 μg/mL的潮霉素的篩選培養(yǎng)基中進行復篩，挑取長勢較好的菌株至100 mL液體完全培養(yǎng)基中25 ℃、110 r/min搖床培養(yǎng)5 d，采用改良的CTAB法[27]提取轉(zhuǎn)化子和出發(fā)菌株的基因組DNA，并以此為模板，分別用引物RFP-F、RFP-R和Hpt-F、Hpt-R對轉(zhuǎn)化子DNA中RFP基因和潮霉素抗性基因hph進行PCR鑒定，其擴增條件分別為：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個循環(huán);72 ℃延伸10 min和94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s， 55 ℃退火30 s， 72 ℃延伸1 min，30個循環(huán);72 ℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增條帶。熒光顯微鏡在10×物鏡下用綠光（波長范圍：500～570 nm）對轉(zhuǎn)化子和原始菌株進行對比觀察，拍照。

2 ?結果與分析

2.1 ?重組質(zhì)粒的鑒定

2.1.1 ?菌落PCR鑒定 ? 挑取陽性單克隆用RFP特異性引物PCR擴增得到約680 bp左右的條帶，產(chǎn)物大小與理論預測片段大小基本一致（見圖1），初步判斷重組質(zhì)粒中含有目的基因RFP基因。

2.1.2 ?酶切鑒定 ? 重組質(zhì)粒經(jīng)過 BamHⅠ和SpeⅠ雙酶切，電泳結果顯示有兩條帶（見圖2），其中一條帶大小680 bp左右，另一條約為6 800 bp，符合連接片段的大小，故可以判斷所獲質(zhì)粒為重組質(zhì)粒pTE11-RFP。

2.1.3 ?測序鑒定 ? 將測序結果提交NCBI在線比對分析，與GenBank中發(fā)表的RFP基因序列同源性為100%。綜上實驗結果可判斷所獲得的質(zhì)粒確實為重組質(zhì)粒pTE11-RFP，載體構建成功。

2.2 ?銀耳芽孢轉(zhuǎn)化子的鑒定

2.2.1 ?PCR鑒定 ? 提取的轉(zhuǎn)化子和出發(fā)菌株的基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳結果見圖3，條帶完整。采用PCR檢測目的基因RFP和潮霉素抗性基因hph結果如圖4，電泳結果顯示轉(zhuǎn)化子能獲得680 bp左右的目的基因條帶及1 000 bp左右的潮霉素抗性基因條帶，而原始銀耳芽孢基因組DNA均未擴增出任何條帶，表明該轉(zhuǎn)化子已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入RFP基因。

2.2.2 ?熒光觀察 ? 在普通日光下觀察轉(zhuǎn)化子即可看到微紅色，而將轉(zhuǎn)化子放在熒光顯微鏡下用綠光（500～570 nm）在10倍鏡下觀察，可明顯看到轉(zhuǎn)基因細胞發(fā)出紅色熒光，而原始菌株細胞未見任何熒光（見圖5），證實外源紅色熒光蛋白在銀耳芽孢中表達成功，RP27啟動子可以調(diào)控外源基因在銀耳芽孢中的正確表達。

3 ?討論與結論

通過基因重組技術生產(chǎn)高價值的外源性蛋白質(zhì)是當今生物技術研究與開發(fā)的熱點之一，高效表達及純化外源蛋白的關鍵是要有一個適合的表達系統(tǒng)，銀耳的雙型性（芽孢和菌絲體）賦予它作為生物反應器既具有與原核生物、酵母菌一樣后代穩(wěn)定的優(yōu)點，又克服了大腸桿菌表達系統(tǒng)由于其蛋白質(zhì)翻譯后修飾加工系統(tǒng)不完善及含有內(nèi)毒素，表達產(chǎn)物以包涵體形式存在，產(chǎn)物不易純化及表達真核生物的基因產(chǎn)物活性低等問題[28-29]，又具有高等生物分化發(fā)育過程，是進行遺傳轉(zhuǎn)化研究的理想材料;目前已轉(zhuǎn)化并整合到銀耳芽孢基因組中的人胰島素基因（BCA）[13]、人乳鐵蛋白基因（hlf）[16]、蜜蜂抗菌肽基因（AP）[17]等外源基因均只在DNA水平或者mRNA水平上檢測到外源基因的存在，然而對外源蛋白在銀耳芽孢中最終是否表達并未作出明確判斷。高賴氨酸蛋白基因（lys）[18]、多功能纖維素基因（mfc）[15]、透明顫菌血紅蛋白基因（VHb）[14]、潮霉素抗性基因（hph）[19]等雖然能夠通過其他方式初步定性得到表達鑒定，但是只有達到一定表達量的轉(zhuǎn)化子才能檢測到表達產(chǎn)物，且具體產(chǎn)物與結構分析還需要進一步深入研究確定。

熒光蛋白由于其自發(fā)熒光的特性，在細胞生物學上有著廣泛的應用。孫淑靜等[30]曾將EGFP轉(zhuǎn)化進銀耳芽孢并證實了其可在銀耳芽孢中表達，但因銀耳芽孢本身顏色是淺黃色的，綠色熒光蛋白表達弱時為黃綠色，干擾了綠色熒光蛋白表達鑒定。紅色熒光蛋白（RFP）基因是與綠色熒光蛋白（GFP）同源的熒光蛋白，其發(fā)光不需要其他因子的參與，且亮度高、熒光性質(zhì)極其穩(wěn)定，無毒性，表達產(chǎn)物可以用眼睛直接觀察或者在紫外線激發(fā)下發(fā)出與銀耳芽孢本底顏色差異較大的紅色熒光[21，31]。因此將紅色熒光蛋白基因作為報告基因與外源目標蛋白融合表達后，即使外源基因在低水平表達時也可以方便靈敏地通過熒光檢測出外源基因是否表達以及表達量的高低，此外還可以在不破壞細胞活性的情況下對目標蛋白進行定位，是外源基因表達非常方便的標記物和監(jiān)測方法。目前RFP基因已被廣泛應用于動物、植物、酵母等真核細胞內(nèi)基因表達的報告基因，但是尚未見其在銀耳芽孢中的研究報道。因此本研究構建含有紅色熒光蛋白RFP基因的表達載體，采用RFP進行表達分析。

雖然銀耳芽孢作為新的外源基因表達系統(tǒng)克服了以往大腸桿菌、酵母菌表達系統(tǒng)的不足之處，具有無可比擬的優(yōu)越性，但其自身也存在著一些問題。主要是遺傳背景不清楚，外源基因在銀耳芽孢中表達量低，原因至今尚未闡明。外源基因在生物中表達量低受多種因素影響，如表達體系、啟動子和增強子等，從而表現(xiàn)出表達量低、蛋白量少、不穩(wěn)定以及基因沉默等，因而必須從這些因素入手，在不同水平上對基因進行調(diào)控，尋找提高外源基因表達效率的有效途徑。目前銀耳表達外源基因可以采用雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）gpd（glyceraldehyde-

3-phosphate dehydrogenase， 3-磷酸甘油醛脫氫酶）啟動子[27]、 銀耳內(nèi)源gpd啟動子[11，15]、構巢曲霉（Aspergillus nidulans）gpd-An啟動子[19]、 香菇（Lentinus edodes）gpd-Le啟動子[19]、 CaMV35S啟動子[13]等， 但表達效率不夠理想。本實驗所采用的啟動子RP27來自絲狀真菌的重要模式生物-稻瘟病菌（Magnaporthe grisea），同時也是是真核表達載體pTE11自帶的強啟動子。該啟動子已實現(xiàn)絲氨酸蛋白酶基因（MGG07965.60[32]、 漆酶基因（Laccase）[33]、 MgCdc42基因等[34]外源基因的過量表達。本研究首次采用強啟動子RP27來調(diào)控外源基因在銀耳芽孢的表達，并選用了紅色熒光蛋白（RFP）作為目的基因，證明RP27啟動子在銀耳芽孢中可以正確地調(diào)控RFP基因的高效表達，從而可以利用該啟動子轉(zhuǎn)化其它藥用蛋白基因并作表達量檢測，為進一步利用熒光蛋白基因作為報告基因和篩選標志及驗證啟動子活性提供一定的參考依據(jù)，對外源基因在銀耳生物反應器中的高效表達研究有重要意義。

致謝 ?感謝福建農(nóng)林大學真菌實驗室王宗華研究員、福建師范大學黃義德副教授質(zhì)粒的饋贈與實驗的指導，感謝福建農(nóng)林大學真菌實驗室陳曉峰博士后和福建農(nóng)林大學生命科學學院林聰老師在本實驗中給予的支持與幫助！

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