劉 林 曹春信 劉新華

摘要：超低溫保存是指在-80℃～-196℃甚至更低溫度下保存生物材料的一種方法?；ǚ郯锓N的所有基因類型，作為植物種質(zhì)的重要形式，是種質(zhì)保存和交換以及雜交育種的重要材料。花粉超低溫保存廣泛應川于瓜菜、農(nóng)作物、果樹、藥用植物及園林植物等各類植物：花粉超低溫保存能大大延長花粉的保存時問，為種質(zhì)交換提供便利，同時能解決育種中花期不遇或異地授粉等問題，提高育種效率。闡述了花粉超低溫保存的技術(shù)流程，對花粉保存效果的評價方法進行了總結(jié)，探討了超低溫保存的遺傳穩(wěn)定性，同時介紹了超低溫保存機理的研究進展，以期為進一步研究瓜菜類植物花粉超低溫保存提供參考。

關鍵詞：瓜菜類植物；種質(zhì)資源；花粉；超低溫保存

花粉是植物種質(zhì)的重要形式之一，它包含該物種的所有基因類型，是種質(zhì)保存和交換以及雜交育種的重要材料。在育種或制種過程中常常遇到親本花期不遇或異地授粉，如能提前保存花粉，延長花粉壽命，無疑能很好地克服這一困難。

超低溫保存是指在-80℃（干冰溫度）～-196℃（液氮溫度）甚至更低溫度下保存生物材料的一種力‘法超低溫保存一般以液氮為冷源，在如此低的溫度下，植物材料中參與新陳代謝的各種生物酶的活性受到極大抑制，生物體新陳代謝基本停止，處于“假死”狀態(tài)。經(jīng)過“假死”狀態(tài)的生物材料能保持細胞正常的活性，并且遺傳物質(zhì)不發(fā)生變異。

1922年Knowlton報道將金魚草（Antirrhinummajus）花粉在-180℃貯藏后仍具有一定的萌發(fā)率，這是有關花粉超低溫保存最早的報道。20世紀80年代以來，關于花粉超低溫保存的研究日漸興起，日本、美國、中國及印度等國家相繼建立了花粉超低溫保存庫。國內(nèi)外已實現(xiàn)花粉超低溫保存的植物種類涉及農(nóng)作物、果樹、園林植物、蔬菜、經(jīng)濟作物、藥用植物以及牧草等幾大類。花粉超低溫保存技術(shù)能大大延長花粉的壽命，如水稻、紫菜苔、辣椒、芍藥、番茄等花粉經(jīng)長期超低溫保存后依然具有較強的生活力，一些其他植物花粉甚至能保存10a（年）以上。

花粉超低溫保存是種質(zhì)資源保存的重要方式，與其他保存方法相比，其具有操作簡單、占用空間小、保存成本低、安全穩(wěn)定等優(yōu)點。同時在育種實踐和生產(chǎn)中，花粉超低溫保存能夠很好地克服花期不遇或花時不遇、異地授粉及父本種植面積大等問題。

1 花粉超低溫保存的基本程序

1.1 花粉的采集

花粉采集受到植物花粉產(chǎn)量、散粉特性以及環(huán)境因子的影響。通常情況下，蟲媒花花粉粒體積較大、花粉量少，采集較費時費力，風媒花花粉粒小，花粉量多，較易采集。不同植物的開花習性不同，但大多數(shù)植物在上午的散粉量最大。環(huán)境因子對花藥開裂和散粉有很大影響，如開花前氣溫偏高，則花藥會提前開裂。花粉采集選擇在天氣晴好的上午效果最好，雨天或雨后花藥含水量太高且花粉易吸水脹裂，影響花粉生活力。采集花粉時可以根據(jù)花序開花順序、花冠顏色、花藥位置等信息采摘花藥即將開裂的花朵，然后置于具有篩網(wǎng)的容器中通風干燥，篩出散落的花粉。

1.2花粉的干燥

花粉含水量是決定花粉超低溫貯藏成功與否的關鍵因素。不同植物花粉都有其超低溫保存的適宜含水量。張保才等認為辣椒花粉超低溫保存適宜含水量為14.O%，此含水量的干燥花粉超低溫貯藏1a后還能保持新鮮花粉一半的生活力，而未經(jīng)干燥處理的辣椒花粉超低溫貯藏30 d后生活力基本喪失：水稻超低溫保存適宜含水量為13.24%，此時花粉田間授粉結(jié)實率達65%，且含水量在5.8%—29.6%的花粉經(jīng)超低溫保存后授粉均能結(jié)實，花粉含水量過高或過低均導致花粉超低溫保存后授粉活性喪失。玉米最適宜超低溫保存的含水量為11.3%～14.7%，未經(jīng)干燥處理的花粉含水量高達53.3%，直接超低溫保存導致其完全喪失授粉活性。無論是超低溫貯藏還是低溫貯藏，維持適宜的含水量是保持花粉正?；钚缘那疤?。魔芋花粉真空干燥后可在-20℃下長期保存，保存la后的花粉田間授粉率可達23.63%。陳宗光等研究發(fā)現(xiàn)西瓜花粉在低溫（4℃）干燥（RH25%）條件下保存，前8d坐果率可達新鮮花粉的73%。宋紅霞等以胡蘿卜花粉為材料，試驗結(jié)果同樣也表明干燥貯藏有利于保持花粉的生活力。從目前的研究結(jié)果來看，花粉含水量多少是決定超低溫保存成敗的關鍵因素，含水量過高，投入液氮時易在細胞內(nèi)形成冰晶，使細胞膜結(jié)構(gòu)受到機械損傷導致細胞死亡；含水量過低，也會影響花粉活性。花粉干燥常用的方法有室內(nèi)陰干法、干燥劑干燥法、白熾燈照射法等，均能獲得較好的效果。

1.3預凍處理

大量研究表明預凍處理和化凍處理對超低溫保存后的花粉活性影響較大，液氮對植物細胞和組織的傷害主要發(fā)生在冰凍和化凍這兩個過程中，趙樹仁等研究結(jié)果表明-25℃預凍處理30min能顯著提高番茄花粉超低溫保存后的萌發(fā)率。時婷婷等認為百合花粉超低溫保存以-20℃預凍處理30min效果最好。湯青林等認為預凍處理可提高甘藍花粉保存效果，且-20℃預凍處理效果最佳，萌發(fā)率達38.17%。王玉萍以馬鈴薯花粉為材料，發(fā)現(xiàn)0、-20℃預凍處理的花粉其相對活力與不經(jīng)預凍處理的對照組間差異不顯著，而經(jīng)0℃（12h）→-10℃（12h）→-20℃（12h）程序降溫處理的花粉活力高于對照。也有報道稱預凍處理對花粉超低溫保存效果沒有顯著影響。尚曉倩等f吲研究發(fā)現(xiàn)，預凍處理后的花粉超低溫保存效果反而較直接投入液氮的保存效果差。造成預凍處理效果差異大的主要原因與花粉含水量不同和植物材料種類差異有關。劉燕等認為，決定是否進行預凍處理由花粉含水量決定，當花藥含水量較高時，經(jīng)預凍處理的花粉保存效果好于直接投入液氮的，這可能因為預凍處理后細胞內(nèi)的水分向細胞間隙移動，細胞質(zhì)的可溶性物質(zhì)濃度升高，導致細胞質(zhì)冰點降低，而當材料含水量較低時，直接投入液氮保存效果較好，此時細胞內(nèi)的水來不及結(jié)冰，直接達到玻璃化狀態(tài)。

1.4化凍處理

化凍也是花粉超低溫保存的重要環(huán)節(jié)。在化凍過程中要避免細胞內(nèi)的次生結(jié)冰，同時要防止化凍吸水對細胞膜產(chǎn)生的滲透沖擊。冰晶在-3—-50℃的溫度范圍內(nèi)最容易形成和生長，這個溫度區(qū)間稱之為超低溫傷害的“危險溫度區(qū)”，材料溫度處于這一溫度區(qū)間時細胞內(nèi)的自由水可能發(fā)生同核結(jié)晶，但這些微小冰晶并不會對細胞產(chǎn)生傷害，此時如果解凍速度太慢，使材料長時間處于這一溫度區(qū)間，更多的自由水就會以同核結(jié)晶形成的微小冰晶為結(jié)晶核而發(fā)生重結(jié)晶，直接導致冰晶變大引起傷害。比較番茄花粉在23℃水浴、37℃水浴、0℃水沖洗和自來水沖洗4種不同解凍方法對超低溫保存的花粉活力的影響，發(fā)現(xiàn)自來水沖洗效果較為理想。劉燕等采用室溫、自來水沖洗和溫水浴3種化凍方式對梅花花粉進行處理，發(fā)現(xiàn)自來水沖洗和溫水浴化凍效果較好。以百合花粉為材料，采用不同的化凍方法對花粉萌發(fā)率進行研究，結(jié)果表明40℃水浴化凍后花粉的萌發(fā)率極顯著高于室溫化凍和4℃冰箱緩慢化凍。王玉萍研究表明，不同化凍方法對馬鈴薯花粉超低溫保存有明顯影響，-20℃（12h）→4℃（12h）→25℃（12h）梯度解凍花粉活力最高，35～40℃水浴解凍次之。

2 花粉生活力檢測

花粉生活力檢驗方法主要有染色法、離體萌發(fā)法及田問授粉法等?；ǚ廴旧ㄖ饕新然交牡蛉旧ǎ═TC法）、聯(lián)苯胺染色法等。氯化三苯基四氮唑是一種氧化還原染料，它的氧化態(tài)是無色的，活細胞的脫氫酶可以將TTC還原為紅色的三苯甲潛（TTF）。聯(lián)苯胺染色法是根據(jù)花粉中過氧化物酶的活性來判斷花粉的活性，具有生活力的花粉含有活躍的過氧化物酶，該酶與所用試劑發(fā)生氧化反應而產(chǎn)生顏色，根據(jù)顏色可知花粉有無活性？花粉離體萌發(fā)法是測定花粉活力的常用方法，由于其檢測效果較為準確，廣泛用于各種植物花粉活性檢測。測定時配制一定濃度的培養(yǎng)基（基本成分為蔗糖和硼酸），在人工控制條件下培養(yǎng)一段時間，然后在顯微鏡下觀察花粉的萌發(fā)，根據(jù)花粉發(fā)芽率的高低衡量花粉生活力大小。花粉發(fā)芽的標準以花粉管伸長超過花粉直徑為準?；ǚ垭x體萌發(fā)法準確度高，但操作相對復雜，且花粉萌發(fā)易受培養(yǎng)基配方的影響而導致結(jié)果與實際不完全相符。田間授粉法是衡量花粉生活力最直接最具實際應用價值的方法，但其比較費時費力，還易受到外界環(huán)境如病蟲害、機械損傷的影響。

3 超低溫保存遺傳穩(wěn)定性

理論上，花粉在超低溫保存過程中其細胞新陳代謝與生長發(fā)育近乎完全停止，處于“假死”狀態(tài)，因而花粉遺傳性狀不會發(fā)生改變。大多數(shù)研究表明，超低溫保存不會產(chǎn)生表型特征的變化。Mou-kadiri等以水稻超低溫保存后的愈傷組織為材料，發(fā)現(xiàn)超低溫保存后的再生后代植株的表型性狀沒有發(fā)生變異、石思信等以超低溫保存1—2a的玉米花粉為材料，發(fā)現(xiàn)后代植株田間農(nóng)藝性狀、染色體數(shù)日和結(jié)構(gòu)以及過氧化物酶同工酶和醇溶蛋圖譜都沒有異常。通過各種分子標記技術(shù)對超低溫保存12個月的袋鼠花（Anigozanthos flavidus）的莖尖基因組DNA進行分析，發(fā)現(xiàn)其遺傳穩(wěn)定性良好，基因組沒有發(fā)生遺傳變異。Crisp等對花椰菜花粉超低溫保存農(nóng)藝性狀的研究巾發(fā)現(xiàn)，花粉冷凍前后結(jié)實率沒有差異，其后代性狀沒有表現(xiàn)出基因型的改變。陳芳等利用AFLP技術(shù)分析小麥超低溫保存前后基因組DNA序列的變化，發(fā)現(xiàn)樣品處理前后帶型一致，未檢測到明顯帶型差異進一步利用MSAP技術(shù)分析了樣品超低溫保存前后基因組甲基化水平，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)超低溫保存后樣品發(fā)生了甲基化變異，且以脫甲基化為主何艷霞等研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥超低溫保存對材料甲基化狀態(tài)有影響，有新產(chǎn)生的甲基化也有脫甲基化，且脫甲基化是主要趨勢?；蚪M甲基化水平對于維持基因組的穩(wěn)定性和基因表達具有重要作用，其水平過高或過低，都會導致植物生長發(fā)育異常，且這種特征仃時可以連續(xù)遺傳很多代。

4超低溫保存機理研究

4.1 膜系統(tǒng)與超低溫保存

細胞膜既維持細胞穩(wěn)定代謝的胞內(nèi)環(huán)境，義洲控物質(zhì)進出細胞?！澳ぶ嘧兝浜Α奔僬f認為，在低溫脅迫下，植物生物膜首先從液品相變?yōu)槟z相，膜收縮產(chǎn)生孑L道或龜裂，質(zhì)膜的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，導致質(zhì)膜透性不同程度增大，膜內(nèi)離子和溶質(zhì)大量向外滲，細胞內(nèi)外離子平衡遭到破壞，研究認為，V-ATPase是各種膜結(jié)合酶中對低溫最敏感的，在10℃以下，其亞基解聚或酶分子處于松散狀態(tài)，活性降低甚至完全失活。以超低溫保存后的芍藥花粉為材料，發(fā)現(xiàn)其細胞膜透性在超低溫保存后均顯著增加，且隨保存時間延長，細胞膜透性持續(xù)L升。

4.2細胞內(nèi)物質(zhì)與超低溫保存

植物在低溫脅迫下，細胞內(nèi)的物質(zhì)如可溶性糖、氨基酸、蛋白質(zhì)等發(fā)生急劇變化，通過可溶物質(zhì)積累來響應低溫脅迫?？扇苄蕴亲鳛闈B透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可以增加細胞滲透壓，提高細胞的保水能力，還可以降低細胞質(zhì)冰點，防止細胞質(zhì)凝膠凝固。劉燕在對玻璃化超低溫保存擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)，糖的轉(zhuǎn)變量對幼苗耐液氮凍存起到了一定的作川

通常情況下，植物體內(nèi)的游離氨基酸維持在一個較低的水平，而在低溫脅迫下，游離氨基酸大量積累。游離氨基酸既能增加細胞液的濃度，又能提高原生質(zhì)的保水能力及膠體的穩(wěn)定性。在游離氨基酸中，脯氨酸與植物抗寒性密切相關。脯氨酸的疏水吡咯烷環(huán)能與蛋白質(zhì)分子的疏水區(qū)結(jié)合，而親水基團分布于表面，增強了蛋白質(zhì)的可溶性。

可溶性蛋白與植物抗冷性密切相關。多數(shù)研究者認為，較高的可溶性蛋白含量有利于提高植物的抗冷性?？扇苄缘鞍拙哂休^強的親水性能，能夠增強細胞的持水能力。尚曉倩在對芍藥花粉可溶性蛋白含量進行測定后發(fā)現(xiàn)，超低溫保存后其可溶性蛋白含量顯著上升。

4.3 植物抗氧化酶系統(tǒng)與超低溫保存

活性氧（ROS）是一類具有較高化學反應活性的氧衍生物，包括超氧物陰離子白由基（O2ˉ）、羥自由基（·OH）、過氧化氫（H2O2）等。ROS能引起植物體內(nèi)大分子物質(zhì)如脂類、蛋白質(zhì)及DNA的損傷。植物抗氧化酶系統(tǒng)包括超氧化物歧化酶（SOD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）及過氧化氫酶（CAT）等。低溫脅迫能激發(fā)植物抗氧化酶系統(tǒng)，從而提高植物的耐冷性。

4.4抗凍蛋白與超低溫保存

抗凍蛋白（antifreeze proteins，AFPs）是低溫生物為適應極端寒冷而產(chǎn)生的一種多肽或糖肽，它能直接和冰晶形成相互作用的蛋白質(zhì)。最初它是從極區(qū)海魚中發(fā)現(xiàn)的，至今在細菌、真菌、昆蟲和植物中均有發(fā)現(xiàn)。AFPs以非依數(shù)性形式降低水溶液的冰點，但對熔點影響甚微，將這種水溶液的熔點和冰點之間出現(xiàn)的差值稱為熱滯活性（thermal hystere-sis activitV，THA）。 AFPs在植物中既能抑制冰的重晶化，又能減緩冰晶的生長速度或降低結(jié)冰水的百分比。1992年，Griffith等首次報道獲得植物內(nèi)生AFP，他們在能夠忍受細胞外結(jié)冰的冬黑麥中發(fā)現(xiàn)了內(nèi)源AFP，并從冬黑麥葉片的質(zhì)外體中提取并純化了該蛋白。1994年，我國學者費云標等從沙冬青葉片中分離到了AFP。1998年，第1個AFPs基因從胡蘿卜中分離到，標志著首個AFP基因克隆成功。此后，冬黑麥具有幾丁質(zhì)酶活性的抗凍基因CHT9和CHT46、歐白英AFPs基因sthp-64等相繼被克隆。

5 問題與展望

目前，花粉超低溫保存技術(shù)已經(jīng)成功應用于各種農(nóng)作物、瓜菜、園藝作物和中草藥等植物。從研究對象來看，主要集中在農(nóng)作物和果樹上，對花卉和觀賞植物研究較少。目前花粉超低溫保存主要集中在對適宜含水量、預凍處理和化凍處理方式等的研究上，尚未建立標準化的超低溫保存操作流程，而且對超低溫保存遺傳穩(wěn)定性和凍存機理研究較少。近年來，隨著分子生物學和細胞學等領域的發(fā)展，各學科相互滲透，推進了花粉超低溫保存研究的不斷深入。盡管植物花粉進行超低溫保存的條件不同，甚至同種植物不同品種間也具有較大差異，這使超低溫保存在大規(guī)模實際應用中存在困難，但花粉超低溫保存具有巨大的應用價值，尤其是在保護珍稀瀕危植物種質(zhì)資源，解決育種中花期不遇、異地授粉以及減少父本種植面積上將發(fā)揮重要作用。