張建盈　嚴(yán)景日　楊石奇　王平勇　劉辰　沈火林

摘要：番茄黃化曲葉病毒病和番茄潰瘍病是兩種分布廣泛、危害嚴(yán)重的世界性病害，嚴(yán)重影響了番茄的產(chǎn)量，是國內(nèi)外番茄抗病育種的重要目標(biāo)。為了提高抗病育種的效率，研究建立了抗番茄黃化曲葉病毒病Ty-3基因和抗番茄潰瘍病QTL的多重PCR反應(yīng)體系。該體系利用同一PCR反應(yīng)，對分別與番茄抗黃化曲葉病毒病的Ty-3基因和抗番茄潰瘍病的一個QTL位點Rcm5.1緊密連鎖的標(biāo)記進行了擴增、篩選，擴增的特異性片段與單引物擴增片段吻合。其中與Ty-3基因緊密連鎖的標(biāo)記Ty3F/Ty一3R為共顯性標(biāo)記，基因型為Ty-3/Ty-3的材料均產(chǎn)生630bp的特異性片段，基因型為Ty-3的材料均產(chǎn)生320bp的特異性條帶，基因型為Ty-3/ty-3的材料產(chǎn)生630bp和320bp的特異性片段；與番茄潰瘍病QTL位點Rcm5.1連鎖的標(biāo)記TG318F/TG318R為顯性標(biāo)記，只有抗病材料產(chǎn)生580bD的特異性片段，感病材料不產(chǎn)生特異性條帶。經(jīng)反復(fù)驗證結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定，可用于同—PCR反應(yīng)體系中對番茄抗黃化曲葉病毒病Ty-3基因和番茄潰瘍病QTL的同時篩選鑒定。

關(guān)鍵詞：番茄；黃化曲葉病毒?。环褲儾?；多重PCR

番茄適應(yīng)性廣、產(chǎn)量高、富含維生素和糖類，是全世界總產(chǎn)量最高的30種農(nóng)作物之一。番茄黃化曲葉病毒病是一種世界性病害，該病給世界上許多生產(chǎn)番茄的地區(qū)都帶來了毀滅性的災(zāi)害，它能夠使番茄的產(chǎn)量和品質(zhì)下降，尤其是對夏秋季栽培的番茄產(chǎn)生更加嚴(yán)重的影響。所以，選育抗番茄黃化曲葉病毒病的番茄優(yōu)良品種尤為重要。Ty-3基因是一個部分顯性基因，被定位在6號染色體上，引物Ty-3F/Ty-3R與Ty-3基因緊密連鎖。番茄潰瘍病也是一種分布較為廣泛，危害較為嚴(yán)重的細(xì)菌性病害。近年來，番茄潰瘍病成為我國番茄生產(chǎn)的重大潛在威脅嘲。選育抗病品種是解決該病害的最佳途徑。番茄潰瘍病抗病基因共有Rcml.0、Rcm2.0、Rcm5.0、Rcm5.1、Rcm6.0、Rcm7.0、Rcm7.1、Rcm8.0、Rcm9.0、Rcm10.等10個QTL位點，QTL位點Rcm5.1的貢獻(xiàn)率最高，為25.5%-27.9%。Coaker and Francis研究表明QTL位點Rcm5.1將會為番茄分子標(biāo)記輔助選擇抗?jié)儾∑贩N提供強有力的工具，引物TG318F/TG318R與QTL位點Rcm5.1緊密連鎖。本研究利用分子標(biāo)記對番茄黃化曲葉病毒病的Ty-3基因和番茄潰瘍病的QTL位點Rcm5.1進行多重PCR篩選鑒定，建立同時篩選番茄Ty-3基因和番茄潰瘍病QTL的多重PCR技術(shù)，以提高番茄抗病育種的分子輔助選擇效率。

1.材料和方法

1.1材料

試驗所用的24份番茄材料由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)番茄課題組提供，這些材料的Ty-3和潰瘍病的QTL的基因型和抗病表現(xiàn)見表1。

1.2方法

1.2.1DNA的提取用改良的堿裂解法提取番茄基因組DNA，方法如下：首先將96孔PCR板放在事先存放在20℃冰箱的冰盒上，并用連打槍加入每孔80μL的0.05mol·L·L^-1Tris-HCL（pH7.0）十0.1 mmol·L^-1EDTA的緩沖溶液；用鑷子撕取面積約為0.3 mm2的番茄葉片組織，放人另一塊冰盒上的96孔PCR板中；將放人葉片的PCR板中分別每孔加入1個直徑為2.5 mm的小鋼珠；用連打槍在放有葉片組織的96孔板中加入100IμL0.25mol·L^-1的NaOH溶液；用硅膠墊蓋在加入葉片、小鋼珠和NaOH溶液的PCR板上，并放到組織研磨器中將其固定；用組織研磨器在頻率70Hz、時長18s的設(shè)置下將葉片搗碎，用排槍快速吸取8，0μL研磨的組織液加入到有80μL0.05mol·L^-1Tris-HCL（pH7.0+0.1mmol·L^-1IEDTA緩沖溶液的PCR板中，用排槍吸打均勻，并用高速離心機離心，放于-20℃冰箱保存待用。此過程需要注意的是加入NaOH溶液后的操作必須在5min之內(nèi)完成。

1.2.2DNA的檢測

由于堿裂解法提取的基因組DNA濃度較低，不能夠直接被瓊脂糖凝膠電泳所檢測。所以，用本實驗室用來檢測DNA的通用引物acting通過PCR之后再跑瓊脂糖凝膠電泳檢測。若PCR產(chǎn)物在瓊脂糖上跑出230bp的條帶，說明DNA能夠用于做為PCR的模板DNA。PCR反應(yīng)的體系為20μL，試劑及其用量如下：DNA模板1μL、2xTaq 10 MasterMix 10μL、正向引物（F）（10 pmo·L^-1μ）0.6μL、反向引物（R）（10 pmol·L^-1）0.6μL、ddH²O7.8μL。PCR的反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性3min；95℃30s，52℃退火30s，72℃30s，30個循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存。PCR的反應(yīng)產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳（加熒光染料），在電壓5v，cm^-1。的條件下電泳1h，隨后在Chalp Gel 15000凝膠電泳成像儀上觀察并拍照分析。檢測結(jié)果（圖1）顯示所檢測的DNA都能擴增出230bp的DNA條帶，能夠用于PCR檢測抗病性的DNA模板。

1.2.3基因Ty-3、Rcm5.1特異引物和擴增的PCR反應(yīng)體系番茄抗黃花曲葉病毒病Ty-3基因的引物參照J(rèn)i等設(shè)計，番茄潰瘍病的一個9TL位點Rcm5.1的連鎖標(biāo)記的引物TG318參照Coaker andFrancis設(shè)計。引物的序列（表2）。引物由北京三博志遠(yuǎn)生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。Taq酶和dNTP購自北京天根生物技術(shù)公司。2xTaq 10Mas-terMix PCR購自北京奧賽博科技發(fā)展有限公司。PCR反應(yīng)的體系為20>μL，其中包括DNA模板1lxL、10xbuffer（含Mg²⁺）2μL、正向引物（F）（10pmol·L^-1）0.6μL、反向引物（R）（10pmol·L^-1）0.6μL、dNTPs（2.5mmol·L^-1）0.4μL、Taq DNA聚合酶（2.5u·μL^-1）0.4μL、ddH₂μO15μL。我們用購自北京奧賽博科技發(fā)展有限公司的2XTaq 10 MasterMix來代替10×buffer（含Mg2）、dNTPs（2.5 mmo]·L^-1）和TaqDNA聚合酶（2.5 u·L^-1），最后所加試劑及其用量如下：DNA模板1μL、2XTaq 10 MasterMixl0μL、正向引物（F）（10pmol·L^-1）0.6μL、反向引物（R）（10pom01.L^-1）0.6μL、ddH²O7.8μL。用于擴增Ty-3、Rcm5.1，基因的反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性4min；94℃ 30s.57℃退火1min，72℃1min30s，35個循環(huán)；72℃延伸10min；4℃二保存。PCR的反應(yīng)產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳（加熒光染料），在電壓5V·cm^-1的條件下電泳1h，隨后在Chalp Gel 5000凝膠電泳成像儀上觀察并拍照分析。

1.2.4基因Ty-3和Rcm5.1共同擴增的PER反應(yīng)體系與程序試劑的購買同上，PCR反應(yīng)的體系為20μL，其中包括DNA模板2μL、10×buffer（含Mg²）2μL、正向引物（F）（10pmol·L）分另4 0，4μL共0.8μL、反向引物（R）（10 pmol·L^-1）分別0，4μL，共0.8μL、dNTPs（2.5mmol·L^-1）0，4μL、Taq DNA聚合酶（2.5 U·μL^-1）0，4μL、ddH₂O13.6μL。用購自北京奧賽博科技發(fā)展有限公司的2xTaql0 MasterMix來代替10xbuffer（含Mg²⁺）、dNTPs（2.5mmol·L^-1）和Taqase酶（2.5 U·μL^-1），最后所加試劑及其用量如下：DNA模板2μL、2×Taq10MasterMix10μL、正向引物（F）（10 pmol·L^-1）0.8μL、反向引物（R）（10 pmol.L^-1）0.8μL、ddH₂6.4μL。共同擴增Ty-3和Rcm5.1基因的PCR反應(yīng)程序同上。PCR的反應(yīng)產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳（加熒光染料），在電壓5v·am^-1的條件下電泳1h，隨后在Chalp Gel 5000凝膠電泳成像儀上觀察并拍照分析。

2.結(jié)果與分析

2.1番茄黃化曲葉病毒病Ty-3基因的PCR擴增結(jié)果

根據(jù)Ji等人的報道，引物Ty-3F/Ty-3R是與番茄黃化曲葉病毒病緊密連鎖的共顯性標(biāo)記，利用該標(biāo)記對24份番茄材料進行單分子PCR擴增，檢測番茄材料的基因型，11份番茄材料為Ty-3/Ty-3基因型，瓊脂糖凝膠電泳均產(chǎn)生630bp的特異性片段，6份番茄材料為ty-3/ty-3基因型，瓊脂糖凝膠電泳均產(chǎn)生320bp的特異性條帶，7份番茄材料為Ty-3/ty-3基因型，瓊脂糖凝膠電泳產(chǎn)生630 bp和320bd的特異性片段（圖2）。該標(biāo)記利用番茄相關(guān)的材料進行過多次檢驗，結(jié)果穩(wěn)定可靠，可用于番茄抗黃化曲葉病毒病Ty-3基因的輔助選擇。

2.2番茄潰瘍病Rcm5.1QTL的PCR擴增結(jié)果

根據(jù)Coaker and Francis報道，與番茄潰瘍病QTL位點Rcm5.1緊密連鎖的標(biāo)記是個顯性標(biāo)記。本研究利用了不同的番茄材料經(jīng)過了大量的重復(fù)試驗，結(jié)果穩(wěn)定可靠。所以，利用引物可以準(zhǔn)確地篩選含有番茄潰瘍病抗病基因的材料。利用引物TG318F/TG318R對24份番茄材料進行單分子PCR擴增，檢測番茄材料的基因型，結(jié)果供試的24份番茄材料通過瓊脂糖凝膠電泳均產(chǎn)生580 bp的特異性抗病條帶，沒有感病條帶（圖3）。

2.3番茄黃化曲葉病毒病Ty-3基因和番茄潰瘍病Rcm5.1QTL的PCR擴增結(jié)果

為了獲得可以同時對番茄黃化曲葉病毒病和番茄潰瘍病抗病基因篩選的PCR擴增反應(yīng)體系，本研究在單引物穩(wěn)定PCR擴增基礎(chǔ)上，將引物TG318F/TG318R和Ty-3F/Ty-3R混合對24份番茄材料進行雙分子PCR擴增，檢測番茄材料的基因型，多重PCR結(jié)果為這2對引物擴增出來的特異性條帶的疊加（圖4）。由結(jié)果可以看出，無論是番茄黃化曲葉病毒病的純合抗病、純合感病或雜合抗病的基因型，還是番茄潰瘍病的抗病基因型，通過PCR擴增均可擴增出原來單一引物所擴增的片段。經(jīng)過大量的重復(fù)試驗，結(jié)果穩(wěn)定，能夠準(zhǔn)確地區(qū)分番茄材料的基因型。所以，本研究成功地建立了可以同時篩選番茄黃化曲葉病毒病Ty-3和番茄潰瘍病QTL穩(wěn)定的雙基因PCR標(biāo)記識別體系。

3.討論

所謂的多重PCR是指在單一反應(yīng)體系中加入一對以上的特異性引物，從而同時擴增多個序列的的反應(yīng)過程，能夠節(jié)省時間和精力。隨著分子技術(shù)的迅速發(fā)展，利用分子標(biāo)記輔助育種極大地加快了育種的進度。以番茄為模式植物的研究尤為深入，國內(nèi)外已獲得了多個與抗病基因緊密連鎖的標(biāo)記，這都為番茄分子輔助育種提供了有力的工具。目前多重PCR技術(shù)在番茄抗病育種中的應(yīng)用主要有：黃化曲葉病毒病Ty-2基因和Ty-3基因、黃化曲葉病毒病Ty-1，基因和番茄根結(jié)線蟲Mi基因、黃化曲葉病毒病Ty-1，基因和番茄葉霉病Cf-5基因、番茄葉霉病Cf-9基因和番茄煙草花葉病毒Tm-1基因、番茄斑萎病毒Sw-5基因和番茄根結(jié)線蟲Mi基因、番茄花葉病毒Tm-22基因和番茄斑萎病毒Sw-5基因”、番茄花葉病毒Tm-22基因和番茄根結(jié)線蟲Mi基因等。但是在番茄黃化曲葉病毒病和番茄潰瘍病的多重PCR在番茄抗病育種中的應(yīng)用未見報道，本研究基于前人的研究結(jié)果，開展了可以同時對番茄黃化曲葉病毒Ty-3基因和番茄潰瘍病QTL進行篩選的雙重PCR標(biāo)記體系的建立。本研究在試驗的過程中都進行了多次重復(fù)，結(jié)果完全一致，并且雙引物PCR擴增結(jié)果為兩對單引物擴增出來的特異性條帶的疊加。本試驗建立的多重PCR體系能夠快速篩選和鑒定番茄抗黃化曲葉病毒病Ty-3基因和番茄潰瘍病QTL位點，可省時、省力，大大降低成本，為番茄抗病基因的鑒定和輔助選擇提供了有力的技術(shù)支撐。