婁　強(qiáng)，謝盼盼，崔秀坤，馬遠(yuǎn)方，胡延忠(河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)與分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室，抗體藥物河南省工程實(shí)驗(yàn)室，河南開封475004)

致白內(nèi)障基因Hsf4b K65R位點(diǎn)突變
對下游熱休克蛋白表達(dá)的影響*

婁強(qiáng)，謝盼盼，崔秀坤，馬遠(yuǎn)方，胡延忠△
(河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)與分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室，抗體藥物河南省工程實(shí)驗(yàn)室，河南開封475004)

［摘要］目的:探討致白內(nèi)障基因熱休克因子4b(Hsf4b) K65R位點(diǎn)突變對其調(diào)控下游熱休克蛋白(HSP)表達(dá)的影響。方法:采用KOD-Plus-Mutagenesis-Kit試劑盒構(gòu)建pWZL-blast-HA-Hsf4b/K65R賴氨酸突變質(zhì)粒;通過慢病毒感染小鼠晶狀體上皮細(xì)胞mLEC構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)Hsf4b/K65R突變質(zhì)粒的細(xì)胞株; Western blotting檢測Hsf4b 在mLEC K65R點(diǎn)突變細(xì)胞株和野生株中的表達(dá); Western blotting及real-timePCR檢測K65R點(diǎn)突變后下游蛋白Hsp70、Hsp90、Hsp27和CryAB表達(dá)的變化。結(jié)果:陽性克隆PCR及基因測序證明慢病毒載體pWZL-blast-HAHsf4b/K65R構(gòu)建成功。K65R點(diǎn)突變后不影響Hsf4b在小鼠晶狀體上皮細(xì)胞mLEC中的表達(dá)，但能影響下游蛋白CryAB、Hsp27、Hsp70i和Hsp90a的表達(dá)。結(jié)論: pWZL-blast-HA-Hsf4b/K65R載體可用于慢病毒感染穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建。Hsf4b K65R位點(diǎn)突變能顯著影響其對熱休克蛋白的調(diào)控功能。

［關(guān)鍵詞］熱休克因子4b;晶狀體上皮細(xì)胞;熱休克蛋白;點(diǎn)突變

先天性白內(nèi)障是導(dǎo)致兒童失明的主要原因，其主要病理改變?yōu)榫铙w發(fā)育遲緩、晶狀體內(nèi)非透明瘢塊組織形成。熱休克因子4b(heat shock factor 4b，Hsf4b)主要在晶狀體內(nèi)表達(dá)，是調(diào)控新生兒期晶狀體發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其通過調(diào)控?zé)嵝菘说鞍?heat shock protein，HSP)和晶狀體蛋白的表達(dá)影響新生期晶狀體上皮細(xì)胞的增生和纖維細(xì)胞分化［1］。正常情況下，Hsf4蛋白在胚胎E13.5晶狀體組織內(nèi)開始表達(dá)，在新生兒期達(dá)到高峰，隨著晶狀體成熟而逐漸減少［2］。敲除小鼠Hsf4基因能使晶狀體在新生期發(fā)育受阻，晶狀體呈現(xiàn)非透明狀白內(nèi)障［3］。在晶狀體發(fā)育過程中，Hsf4b賴氨酸位點(diǎn)易被類泛素化、乙?；头核鼗揎棧瑥亩{(diào)控Hsf4b轉(zhuǎn)錄活性和蛋白穩(wěn)定性［4-5］。Hsf4 DNA結(jié)合域密碼錯(cuò)義突變(如L115P、I87V、A20D、R120C和R74H)與家族常染色體顯性遺傳性白內(nèi)障的發(fā)生密切相關(guān)［6-7］。Hsf4b DNA結(jié)合域錯(cuò)義突變與人和動(dòng)物遺傳性白內(nèi)障的發(fā)生密切相關(guān)［8-10］。然而，Hsf4b DNA結(jié)合域賴氨酸位點(diǎn)如何影響其對熱休克蛋白的調(diào)控仍不清楚。

在本研究中，在前期構(gòu)建Hsf4－/－小鼠晶狀體永生化上皮細(xì)胞系的基礎(chǔ)上［11］，采用定點(diǎn)突變技術(shù)將Hsf4b DNA結(jié)合域第65位賴氨酸位點(diǎn)錯(cuò)義突變?yōu)榫彼?，研究Hsf4b對熱休克蛋白表達(dá)的調(diào)控，進(jìn)而為研究第65位賴氨酸點(diǎn)的修飾在晶狀體發(fā)育過程中的調(diào)控提供基礎(chǔ)。

材料和方法

1菌種、細(xì)胞、載體來源

DH5α大腸桿菌本實(shí)驗(yàn)室保存; 293T細(xì)胞、小鼠晶狀體上皮細(xì)胞mLEC細(xì)胞來自本實(shí)驗(yàn)室; PWZL-blast-HA-Hsf4b真核表達(dá)載體由本實(shí)驗(yàn)室保存。

2主要方法

2.1PWZL-blast-Hsf4b/S15A突變質(zhì)粒的構(gòu)建使用KOD-Plus-Mutagenesis-Kit試劑盒(Toyobo)構(gòu)建點(diǎn)突變表達(dá)質(zhì)粒;由上海生工生物工程公司設(shè)計(jì)引物，K65R的上游引物為5’-CTGCCCCAGTATTTCCGCCATAGCAACATGGCG-3’，下游引物為5’-CGCCATGTTGCTATGGCGGAAATACTGGGGCAG-3’，其中字體加粗部分為突變后堿基。以pWZL-blast-HA-Hsf4b為模板，使用導(dǎo)入了突變的引物進(jìn)行反向PCR;在PCR產(chǎn)物中添加限制酶Dpn I，消化質(zhì)粒模板(Dpn I只有在識別位點(diǎn)(GATC)中的腺嘌呤被甲基化后才會對其進(jìn)行切斷。由于用一般的Dam甲基(+ )的大腸桿菌(JM109、DH5α等)制備的質(zhì)粒已被甲基化，因而會被Dpn I切斷;直鏈狀的質(zhì)粒PCR產(chǎn)物通過自連接環(huán)化以后，用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，取得突變導(dǎo)入克隆。

2.2Hsf4b野生型和Hsf4b/K65R突變型表達(dá)細(xì)胞株的篩選及建立將PWZL-blast-Hsf4b質(zhì)粒和PWZL-blast-Hsf4b/S15A質(zhì)粒分別與慢病毒包裝質(zhì)粒pLECO共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)液，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，慢病毒感染小鼠晶狀體上皮細(xì)胞(mLEC/Hsf4b－/－)，同時(shí)加入2 mg/L的polybrane，48 h后換液，在含有4 mg/L blasticidin的 DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d，然后在含有2 mg/L blasticidin的DMEM培養(yǎng)基中維持培養(yǎng)，至此已成功構(gòu)建并篩選到穩(wěn)定株mLEC/Hsf4b和mLEC/Hsf4b/K65R。

2.3Western blotting分析K65位氨基酸突變對Hsf4b下游蛋白表達(dá)的影響mLEC/Hsf4b、mLEC/Hsf4b－/－、mLEC/Hsf4b/K65R細(xì)胞分別經(jīng)PBS洗3次，加細(xì)胞裂解液(50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L氯化鈉，1% NP-40和蛋白水解酶抑制劑)冰上裂解30 min。10 000×g離心10 min，棄沉淀，分別取上清液與SDS上樣緩沖液混勻，100℃煮沸10 min。用10% SDS-PAGE分離，分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5 %脫脂奶封閉1 h，I抗［CryAB，1∶200，Santa Cruz; Hsp70i，1∶1 000，CST; Hsp90a，1∶1 000，CST; Hsp27，1∶500，Sigma;β-actin，1∶5 000，Sigma; HA-Tag (6E2)，1∶2 000，CST］于4℃孵育過夜，PBS洗去未結(jié)合的I抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的II抗于37℃孵育1 h，隨后用PBST洗膜，洗膜后用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測信號。

2.4Real-time PCR實(shí)驗(yàn)采用TRIzol試劑(Invitrogen)分離純化各組細(xì)胞的總RNA，分光光度法測定計(jì)算提取的總RNA含量及濃度。參照cDNA Synthesis Kit和Universal SYBR Green Supermix(Bio-Rad)實(shí)驗(yàn)操作說明進(jìn)行PCR，采用Step One Plus real-time PCR system，總反應(yīng)體積20.0 μL，其中2×Universal SYBR Green Supermix 10.0 μL，cDNA 0.1 μg，引物0.5 μmol/L。PCR擴(kuò)增條件為: 95℃15 s，60°C 1 min，35～40個(gè)循環(huán)。所用引物由上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)有限公司根據(jù)設(shè)計(jì)合成，見表1。

表1　實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Table 1.Sequences of the primers for real-time PCR

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用Student t-test分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 Hsf4b蛋白結(jié)構(gòu)域生物信息學(xué)分析

Hsf4b全長1 482 kb，編碼493個(gè)氨基酸，含有5個(gè)重要的結(jié)構(gòu)域，見圖1。其中DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域在調(diào)控下游蛋白表達(dá)上發(fā)揮重要作用。從BLASTW的分析結(jié)果來看，該DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域高度保守，與其它物種的基因同源性很高，見圖2。

Figure 1.Structural domain analysis of human Hsf4b protein (GI: 5921135) (http://smart.embl-heidelberg.de/and http://cplm.biocuckoo.org/).The K65R mutation site and the S299 phosphoserine site were directed by arrow heads.圖1人Hsf4b蛋白結(jié)構(gòu)域分析

2 Hsf4b/K65R的測序結(jié)果比對

在本研究中，采用KOD-Plus-Mutagenesis-Kit試劑盒將DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的賴氨酸位點(diǎn)突變?yōu)榫彼?。圖3顯示了Hsf4b突變后的測序比對結(jié)果。

3 Western blotting分析K65R位點(diǎn)突變后Hsf4b及下游蛋白的表達(dá)

已有報(bào)道CryAB基因錯(cuò)義突變能顯著降低分子伴侶活性，在應(yīng)激狀態(tài)下，蛋白質(zhì)聚集沉淀，能夠?qū)е掳變?nèi)障［12］。熱休克蛋白Hsp27、Hsp70和Hsp90在生理和應(yīng)激情況下的晶狀體上皮細(xì)胞中均有表達(dá)［13-14］。本文推測，Hsf4b可能通過調(diào)控晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)熱休克蛋白家族成員的表達(dá)來調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)功能。本室的前期工作［15］已報(bào)道，Hsp27和CryAB是Hsf4b的直接下游靶點(diǎn)。用免疫印跡法測定了CryAB和Hsp27蛋白在mLEC/Hsf4b/K65R、mLEC/Hsf4b－/－及mLEC/Hsf4b細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。結(jié)果顯示，HA-Hsf4b在重建的mLEC/HA-Hsf4b細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，并上調(diào)CryAB和Hsp27蛋白的表達(dá)、下調(diào)Hsp70i和Hsp90a的表達(dá)(圖4)，結(jié)果說明構(gòu)建細(xì)胞株成功。進(jìn)而發(fā)現(xiàn)，CryAB和Hsp27蛋白在mLEC/HSF4b細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯高于它在mLEC/Hsf4b/K65R細(xì)胞中的表達(dá)，而Hsp70i和Hsp90a的表達(dá)降低。

Figure 4.The images of Western blotting showed the effects of Hsf4b overexpression and Hsf4b/K65R site-mutagenisis on the expression levels of CryAB，Hsp27，Hsp70i and Hsp90a in mLEC.圖4 Western blotting檢測Hsf4b及Hsf4b/K65R突變的表達(dá)對人晶狀體上皮細(xì)胞中CryAB、Hsp27、Hsp70i及Hsp90a表達(dá)的影響

4 Real-time PCR分析Hsf4b K65R位點(diǎn)突變后熱休克蛋白的轉(zhuǎn)錄水平

CryAB和Hsp27基因在mLEC/Hsf4b細(xì)胞中較未轉(zhuǎn)染Hsf4b的mLEC細(xì)胞表達(dá)明顯增加，Hsp70表達(dá)明顯下降，有顯著差異，而Hsp90表達(dá)沒有明顯變化，見圖5。mLEC/Hsf4b/K65R細(xì)胞組與mLEC/Hsf4b細(xì)胞組相比，CryAB、Hsp27表達(dá)明顯減少，Hsp70的表達(dá)明顯增加。

Figure 5.The mRNA expression of CryAB，Hsp27，Hsp90a，and Hsp70i in mLEC/Hsf4b/K65R　(K65R)，mLEC/Hsf4b－/－(Hsf4b－/－)，and mLEC/Hsf4b cells (Hsf4b) determined by real-time PCR.Mean± SD.n=3.*P＜0.05 vs Hsf4b－/－;#P＜0.05 vs Hsf4b.圖5 CryAB、Hsp27、Hsp90a和Hsp70i的mRNA在K65R，Hsf4b－/－和Hsf4b細(xì)胞中的表達(dá)

討論

DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域在用于轉(zhuǎn)錄因子的生物學(xué)功能研究中起到重要作用。人Hsf4b的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域在進(jìn)化上高度保守，顯示其可能參與基本的與下游蛋白結(jié)合與調(diào)控功能; Hsf4b第65位賴氨酸是乙?；揎椀奈稽c(diǎn)，與蛋白質(zhì)發(fā)揮作用密切相關(guān)。在本研究中采用了KOD-Plus-高保真性的Inverse PCR法的位點(diǎn)特異性突變導(dǎo)入試劑盒進(jìn)行K65R基因定點(diǎn)突變。Inverse PCR法以質(zhì)粒為模板，使用反向引物進(jìn)行PCR，對質(zhì)粒全長進(jìn)行擴(kuò)增，整個(gè)過程包括轉(zhuǎn)化在內(nèi)只需3個(gè)步驟，比較簡便。通過采用KOD -plus聚合酶及降低PCR循環(huán)數(shù)，使可能來自PCR錯(cuò)誤的2nd-site mutation(目的突變以外的突變)的可能性降到最低，可以獲得最大的突變導(dǎo)入率。

小鼠晶狀體上皮細(xì)胞mLEC來源于新生6 d的Hsf4－/－小鼠晶狀體前囊膜，在培養(yǎng)皿中經(jīng)含有10%胎牛血清和青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)成單層后即傳代，然后用猴腎病毒(SV40)大T-抗原轉(zhuǎn)染mLEC細(xì)胞，G418篩選建立永生化細(xì)胞系mLEC/Hsf4－/－。因此本研究中小鼠晶狀體上皮細(xì)胞mLEC沒有Hsf4b的內(nèi)源性表達(dá)。

Hsf4是熱休克轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，在機(jī)體內(nèi)有Hsf4a和Hsf4b 2種亞型。它們來源于同一個(gè)基因的不同mRNA剪輯過程。Hsf4a和Hsf4b因結(jié)構(gòu)不同造成其轉(zhuǎn)錄活性相反。Hsf4a為轉(zhuǎn)錄抑制子，而Hsf4b則為轉(zhuǎn)錄激活子。Hsf4b感受外界環(huán)境刺激(比如細(xì)胞老化、加熱、紫外線照射、糖皮質(zhì)激素刺激等)后，形成3聚體后和熱休克元件(HSE)結(jié)合，調(diào)控下游Hsp27、αB晶狀體蛋白、Hsp70、Hsp90的表達(dá)［6，16］，這些蛋白質(zhì)對維持晶狀體的正常結(jié)構(gòu)和功能具有重要的調(diào)控作用，并可調(diào)節(jié)晶狀體上皮細(xì)胞的生長［17-18］。在本研究中，Hsf4b在RNA及蛋白水平上正向調(diào)控小分子量熱休克蛋白Hsp27及CryAB的表達(dá)，負(fù)向調(diào)控?zé)嵝菘说鞍譎sp70的表達(dá)，但并不顯著影響Hsp90的表達(dá)。Hsf4b的K65R位點(diǎn)突變能夠回復(fù)下游熱休克蛋白的表達(dá)，即HSP27和Cry-AB表達(dá)降低，而HSP70表達(dá)增加，提示Hsf4b的第65位賴氨酸位點(diǎn)在調(diào)控?zé)嵝菘说鞍椎谋磉_(dá)中發(fā)揮重要作用，進(jìn)而可能與白內(nèi)障的發(fā)生密切相關(guān)。在本研究中構(gòu)建的K65R突變穩(wěn)定細(xì)胞株，可以用來進(jìn)一步分析Hsf4b對下游蛋白的調(diào)控機(jī)理，深入認(rèn)識其在導(dǎo)致白內(nèi)障中發(fā)揮的作用。

［參考文獻(xiàn)］

［1］張軍，馬增翼，李淑蓮，等.HSF4B通過上調(diào)RhoA和Rac1促進(jìn)晶狀體上皮細(xì)胞遷移［J］.中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2013，29(4) : 377-382.

［2］Min JN，Zhang Y，Moskophidis D，et al.Unique contribution of heat shock transcription factor 4 in ocular lens development and fiber cell differentiation［J］.Genesis，2004，40(4) : 205-217.

［3］Merath K，Ronchetti A，Sidjanin DJ.Functional analysis of HSF4 mutations found in patients with autosomal recessive congenital cataracts［J］.Invest Ophthalmol Visual Sci，2013，54(10) : 6646-6654.

［4］Zhang J，Ma Z，Wang J，et al.Regulation of Hsf4b nuclear translocation and transcription activity by phosphorylation at threonine 472［J］.Biochim Biophys Acta，2014，1843(3) : 580-589.

［5］Hu Y，Zhang J，Wang C，et al.The transcription activity of heat shock factor 4b is regulated by FGF2［J］.Int J Biochem Cell Biol，2013，45(2) : 317-325.

［6］Nakai A，Tanabe M，Kawazoe Y，et al.HSF4，a new member of the human heat shock factor family which lacks properties of a transcriptional activator［J］.Mol Cell Biol，1997，17(1) : 469-481.

［7］Ke T，Wang QK，Ji B，et al.Novel HSF4 mutation causes congenital total white cataract in a Chinese family［J］.Am J Ophthalmol，2006，142(2) : 298-303.

［8］Bu L，Jin Y，Shi Y，et al.Mutant DNA-binding domain of HSF4 is associated with autosomal dominant lamellar and Marner cataract［J］.Nat Genet，2002，31(3) : 276-278.

［9］Cui X，Zhang J，Du R，et al.HSF4 is involved in DNA damage repair through regulation of Rad51［J］.Biochim Biophys Acta，2012，8(15) : 1308-1315.

［10］Enoki Y，Mukoda Y，F(xiàn)urutani C，et al.DNA-binding and transcriptional activities of human HSF4 containing mutations that associate with congenital and age-related cataracts［J］.Biochim Biophys Acta，2010，1802(9) : 749-753.

［11］張軍，馬增翼，王悅玲，等.Hsf4－/－小鼠晶狀體永生化上皮細(xì)胞系建立的研究［J］.中華眼科雜志，2013，49(11) : 1029-1031.

［12］Chen Q，Ma J，Yan M，et al.A novel mutation in CRYAB associated with autosomal dominant congenital nuclear cataract in a Chinese family［J］.Mol Vis，2009，15: 1359-1365.

［13］Banh A，Deschamps PA，Vijayan MM，et al.The role of Hsp70 and Hsp90 in TGF-beta-induced epithelial-to-mesenchymal transition in rat lens epithelial explants［J］.Mol Vis，2007，13: 2248-2262.

［14］Yao K，Rao H，Wu R，et al.Expression of Hsp70 and Hsp27 in lens epithelial cells in contused eye of rat modulated by thermotolerance or quercetin［J］.Mol Vis，2006，12: 445-450.

［15］Hu Y，Mivechi NF.Association and regulation of heat shock transcription factor 4b with both extracellular signalregulated kinase mitogen-activated protein kinase and dualspecificity tyrosine phosphatase DUSP26［J］.Mol Cell Biol，2006，26(8) : 3282-3294.

［16］Miao A，Zhang X，Jiang Y，et al.Proteomic analysis of SRA01/04 transfected with wild-type and mutant HSF4b identified from a Chinese congenital cataract family［J］.Mol Vision，2012，18: 694-704.

［17］季櫻紅，盧奕，李娜，等.遺傳性白內(nèi)障小鼠晶狀體的比較蛋白質(zhì)組分析［J］.中國病理生理雜志，2009，25(7) : 1415-1419.

［18］吳明星，吳開力，卞慶寧，等.年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶體上皮細(xì)胞的基因表達(dá)譜變化的初步分析［J］.中國病理生理雜志，2006，22(7) : 1429-1434.

(責(zé)任編輯:陳妙玲，余小慧)

Eeffect of K65R site-mutagenesis of cataracts-related gene Hsf4b on downstream heat shock proteins expression

LOU Qiang，XIE Pan-pan，CUI Xiu-kun，MA Yuan-fang，HU Yan-zhong
(Antibody Drug Engineering Laboratory of Henan Province，Medical and Molecular Immunology Laboratory，Medical School of Henan University，Kaifeng 475004，China.E-mail: hyz@henu.edu.cn)

［ABSTRACT］AIM: To clarify the impact of heart shock factor 4b (Hsf4b) K65R mutation on the regulation of downstream protein expression.METHODS: Non-functional Lys mutant plasmid pWZL-blast-HA-Hsf4b/K65R was generated by replacing single，homologous amino acids using KOD-Plus-Mutagenesis-Kit.Mouse lens epithelial mLEC stable cell lines expressing Hsf4b or Hsf4b/K65R were constructed by lentivirus infection.The expression of Hsf4b in the mutant and the wildtype mLEC cells was confirmed by Western blotting.The expression of Hsf4b downstream proteins such as heat shock protein (Hsp) 70，Hsp90，Hsp27 and CryAB was examined by Western blotting and real-time PCR.RESULTS: The results of PCR and DNA sequencing confirmed the successful construction of mLEC Hsf4b/K65R mutant.The K65R mutation didn’t influence Hsf4b expression in the mLEC cells.After K65R mutation in Hsf4b，the expression levels of Hsp27 and CryAB were down-regulated and the expression of Hsp70i and Hsp90a upregulated.CONCLUSION: pWZL-blast-HA-Hsf4b/K65R can be used to construct a stable cell line by infecting with lentivirus.Hsf4b/K65R mutation influences the regulation of downstream heat shock proteins.

［KEY WORDS］Heat shock factor 4b; Lens epithelial cells; Heat shock proteins; Site-mutagenesis

通訊作者△Tel: 0371-23885036; E-mail: hyz@henu.edu.cn

*［基金項(xiàng)目］國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.U1404826) ;河南省教育廳項(xiàng)目(No.14B310015) ;河南大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)科研專項(xiàng)(青年科研人才種子基金)

［收稿日期］2015-03-25［修回日期］2015-05-15

［文章編號］1000-4718(2015)09-1699-05

［中圖分類號］R363

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.030