楊先國(guó)，谷陟欣，盧 捷，劉克明，黃 勝

(1.湖南中醫(yī)藥高等專科學(xué)校，湖南 株洲 412012；2.九芝堂股份有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410021； 3.湖南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410081)

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4種紫珠屬藥用植物RAPD多態(tài)性分析

楊先國(guó)1，谷陟欣2，盧 捷2，劉克明3，黃 勝2

(1.湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，湖南 株洲 412012；2.九芝堂股份有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410021； 3.湖南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410081)

目的：運(yùn)用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性技術(shù)探索4種紫珠屬藥用植物的遺傳多態(tài)性，為其種質(zhì)鑒定提供依據(jù)。 方法：采用試劑盒提取法提取裸花紫珠、廣東紫珠、大葉紫珠與杜虹花4種新鮮植物葉中的總DNA，采用經(jīng)過(guò)篩選的20條隨機(jī)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果：試劑盒可有效獲取4種紫珠植物的總DNA，擴(kuò)增得到條帶共152條，多態(tài)性條帶137條，多態(tài)率達(dá)到88.2%；聚類分析結(jié)果表明，4種紫珠供試材料共分為3類。結(jié)論：4種紫珠RAPD擴(kuò)增后的聚類分析結(jié)果與植物形態(tài)學(xué)觀察分類結(jié)果相一致，所得RAPD標(biāo)記可用于紫珠屬藥用植物的多態(tài)性研究，為開(kāi)發(fā)遺傳鑒定的分子標(biāo)記奠定基礎(chǔ)。

紫珠屬；基因組DNA；RAPD；多態(tài)性；聚類分析

紫珠屬植物(CallicarpaLinn)來(lái)源于馬鞭草科，我國(guó)紫珠屬植物有46種，主要分布于長(zhǎng)江以南的廣大地區(qū)，如海南、廣東、廣西、云南、貴州、湖南、江西、福建等地。其中約有30多種可以作為藥用，入藥部位為莖葉或全株，其性平、味苦，歸肝、脾、肺經(jīng)，具有活血止血、清熱解毒等功效，主要用于治療吐血、咳血、便血、崩漏、創(chuàng)傷出血等[1-2]。

紫珠作為一種重要的中藥資源，在我國(guó)被廣泛使用。對(duì)我國(guó)的中藥材地方標(biāo)準(zhǔn)中收載的紫珠品種進(jìn)行統(tǒng)計(jì)可知，我國(guó)湖南、廣東、廣西、江西、云南、河南以及山東7個(gè)省區(qū)的中藥材地方標(biāo)準(zhǔn)收載了近8種紫珠屬藥用植物，其中以裸花紫珠、廣東紫珠、大葉紫珠以及杜虹花為主，現(xiàn)已作為中成藥制劑的原料藥廣泛使用。由紫珠藥材制成的中成藥品種達(dá)20多種，其中裸花紫珠為九芝堂股份有限公司生產(chǎn)的裸花紫珠片的主要原料藥[3-4]。但在原料收集過(guò)程中，可能有紫珠屬的其他藥材混入到原料藥中，由于紫珠屬植物葉及枝均具有止血、解毒等功效，且原植物藥材性狀極其相似，在市場(chǎng)流通及臨床應(yīng)用過(guò)程中難以鑒別，因而常常相互混用。目前文獻(xiàn)研究主要集中在生藥學(xué)鑒定[5-6]、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究方面[7-11]，仍未從分子水平對(duì)常用紫珠屬藥材進(jìn)行鑒定。本研究采用RAPD分子標(biāo)記從DNA分子水平對(duì)四個(gè)紫珠品種展開(kāi)相關(guān)研究，為合理利用紫珠屬藥用植物資源、從DNA分子水平揭示四種紫珠屬藥用植物品種的親緣關(guān)系提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

裸花紫珠CallicarpanudifloraHooker & Amott，廣東紫珠callicarpakwangtungensisChun，大葉紫珠callicarpamacrophyllaVahl，杜虹花CallicarpaformosanaRolfe，由湖南中醫(yī)藥高等專科學(xué)校彭學(xué)著教授鑒定為真品。樣品來(lái)源及分類見(jiàn)表1，每種植物均取嫩葉提取基因組DNA，-20℃保存。

1.2 儀器

DYY-2C電泳儀(北京六一儀器廠)，PCR儀MASTERCYCLER(德國(guó)Eppendorf)，凝膠成像系統(tǒng)Tanon 1600R(上海天能)，-80℃超低溫冰箱DW-HL538(中科美菱)。

1.3 試劑與引物

廣譜性植物總DNA提取試劑盒(HiPure Plant DNA Kits)購(gòu)自廣州Magen(美基)生物公司，2×Taq master Mix購(gòu)自康為世紀(jì)，RAPD引物購(gòu)自上海生工公司產(chǎn)品(見(jiàn)表2)。其他試劑均為分析純。

表1 4種紫珠樣品來(lái)源及分類

表2 RAPD分析所用引物

2 方法

2.1 紫珠植物組織DNA提取

采用Magen植物總DNA提取試劑盒標(biāo)示的使用方法進(jìn)行提取。采用液氮將植物樣品研磨成粉末，轉(zhuǎn)移50～100mg 凍藏樣品至 2mL離心管中，立即加入 600μL Buffer PTL/2-Me 和 5μL RNase Solution 至樣品中，劇烈渦旋使樣品充分分散，65°C水浴20min，期間顛倒混勻 2～3次，加入600μL氯仿-異戊醇(24∶1)，渦旋混勻30s，室溫下12 000xg離心5min，轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管中，加入等倍體積 Buffer PBL 至上清液中，渦旋混勻30s，將DNA 柱裝在收集管中，轉(zhuǎn)移混合液(<700μL)至柱子中，8 000xg離心30～60s。然后按照使用手冊(cè)方法進(jìn)行提取，將提取的 DNA 保存于-20℃下備用。

2.2 PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè)

為獲得穩(wěn)定的試驗(yàn)結(jié)果，減少實(shí)驗(yàn)過(guò)程中因操作導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)誤差，PCR反應(yīng)體系選擇2×Taq master Mix PCR擴(kuò)增體系，只需在反應(yīng)體系中加入DNA模板、引物以及去離子水，主要優(yōu)化對(duì)RAPD影響較大的3個(gè)反應(yīng)參數(shù)，即PCR反應(yīng)體系中的DNA模板濃度(1μL、1.5μL、2.0μL、2.5μL、3.0μL)、引物濃度(0.4μL、0.8μL、1.2μL、1.6μL、2.0μL)、體系循環(huán)次數(shù)(25、30、35、40、45次)。優(yōu)化結(jié)果表明，DNA模板濃度為2.5μL、引物濃度為2.0μL、循環(huán)40次為最佳反應(yīng)條件。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：向紫珠RAPD反應(yīng)的50μL反應(yīng)體系中加入模板DNA 2.5μL、引物2μL、2×Taq Master Mix 25μL以及去離子水20.5μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，36℃退火30s，72℃延伸30s，40次循環(huán)，72℃后延伸7min，4℃保存。取擴(kuò)增產(chǎn)物5μL，在1.5%瓊脂糖凝膠上恒壓(110V)電泳60min，凝膠中含0.5μg/mL溴化乙錠(EB)，采用凝膠成像系統(tǒng)照相。

2.3 數(shù)據(jù)分析

對(duì)擴(kuò)增后電泳帶總數(shù)及多態(tài)性條帶數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。將電泳圖譜中的每一條帶(DNA片段)作為一個(gè)分子標(biāo)記，并在模板上有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，不同的樣本在凝膠上泳動(dòng)距離相同則表明其有相同的位點(diǎn)。根據(jù)各分子標(biāo)記的有無(wú)得到所有位點(diǎn)的二元數(shù)據(jù)，有帶記為“1”(強(qiáng)帶和弱帶同記)，無(wú)帶記為“0”，采用SPSS17.0軟件進(jìn)行聚類分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 基因組DNA電泳檢測(cè)

取4種紫珠基因組DNA提取液10μL，在穩(wěn)壓110V、1.0%瓊脂糖凝膠上電泳60min?；蚪MDNA 電泳檢測(cè)結(jié)果表明(見(jiàn)圖1)，通過(guò)試劑盒提取的紫珠DNA樣品整齊一致，條帶清晰，沒(méi)有出現(xiàn)拖尾與擴(kuò)散現(xiàn)象，純度較高，因而可以滿足RAPD擴(kuò)增試驗(yàn)的要求。

圖1 4種紫珠基因組DNA電泳譜

3.2 RAPD標(biāo)記多態(tài)性分析

20條RAPD引物對(duì)4種紫珠屬植物樣本進(jìn)行擴(kuò)增得到的條帶的相對(duì)分子量主要集中在300～200bp，共擴(kuò)增得到條帶152條，其中多態(tài)性條帶共137條，多態(tài)率達(dá)88.2%，平均每條引物產(chǎn)生7.6個(gè)條帶與6.8個(gè)多態(tài)性條帶(見(jiàn)表3)，4個(gè)樣品的RAPD擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖2、圖3、圖4、圖5。

表3 RAPD分析所用引物序列及擴(kuò)增結(jié)果 (n)

3.3 聚類分析

根據(jù)擴(kuò)增條帶，采用SPSS17.0軟件中的Within-groups linkage方法，根據(jù)遺傳距離對(duì)4個(gè)樣本進(jìn)行聚類分析，繪出紫珠樣本間的RAPD聚類系統(tǒng)圖(見(jiàn)圖6)。從圖6中可以看出，利用RAPD方法可將4個(gè)紫珠樣本分為3類，其中杜虹花與廣東紫珠的遺傳距離最近，可歸為一類，大葉紫珠與裸花紫珠各為一類，而大葉紫珠比裸花紫珠在親緣關(guān)系上更靠近廣東紫珠與杜虹花。

4 結(jié)論

RAPD是建立在PCR基礎(chǔ)上的一種可對(duì)整個(gè)未知序列的基因組進(jìn)行多態(tài)性分析的分子標(biāo)記技術(shù)，該技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、快速，能在短時(shí)間內(nèi)完成對(duì)多個(gè)樣本研究的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于藥用植物種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究[12-13]、種質(zhì)鑒定及評(píng)價(jià)[14-15]、引種馴化[16]和分類學(xué)研究等方面[17]。但由于RAPD-PCR的影響因素較多，重復(fù)性與穩(wěn)定性較差，為提高實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性與可重復(fù)性，本實(shí)驗(yàn)采用2×Taq master Mix PCR混合反應(yīng)體系，該體系中含有Mg2+、dNTP以及Taq酶濃度等均經(jīng)過(guò)優(yōu)化，適宜各類植物的擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。在體系的優(yōu)化過(guò)程中，僅需要對(duì)基因組DNA模板的濃度、引物濃度及循環(huán)次數(shù)等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DNA模板濃度為2.5μL、引物濃度為2.0μL、循環(huán)40次時(shí)，擴(kuò)增的條帶較多，條帶較清晰。

圖2 裸花紫珠RAPD擴(kuò)增圖

圖3 廣東紫珠RAPD擴(kuò)增圖

圖4 大葉紫珠RAPD擴(kuò)增圖

圖5 杜虹花RAPD擴(kuò)增圖

圖6 紫珠樣品RAPD聚類分析結(jié)果

紫珠屬植物RAPD分析結(jié)果表明，20個(gè)引物共檢測(cè)出152條帶，多態(tài)性條帶共137條，多態(tài)率達(dá)88.2%。從DNA分子水平來(lái)說(shuō)，樣本間遺傳距離越大，說(shuō)明遺傳分化越大；聚類分析結(jié)果表明，4個(gè)紫珠屬樣本可分為3類，其中杜虹花與廣東紫珠的遺傳距離最近，大葉紫珠與裸花紫珠各為一類，上述分析結(jié)果與紫珠屬植物的生藥學(xué)分類相一致。采用RAPD分子標(biāo)記研究紫珠屬資源之間的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，對(duì)于紫珠屬藥用植物種質(zhì)資源的遺傳育種、合理利用具有重要意義。

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(責(zé)任編輯：尹晨茹)

Polymorphism of Four Kinds of Medicinal Plants Callicarpa Linn by RAPD

Yang Xianguo1，Gu Zhixin2，Lu Jie2，Liu Keming3，Huang Sheng2

(1.Traditional Chinese Medical College of Hunan，Zhuzhou 412012,China;2.Jiuzhitang Co Ltd,Changsha 410021，China；3.College of Life Science,Hunan Normal University，Changsha 410081,China)

Objective:To research the polymorphism of four kinds of medicinal plants Callicarpa linn by random amplified polymorphic DNA(RAPD)analysis and provide a basis for germplasm identification.Methods:The extraction kit was used to extract the genomic DNA of several plants，including 3 regions of Callicarpa nudiflora Hooker﹠Amott，callicarpa kwangtungensis Chun，callicarpa macrophylla Vahl and Callicarpa formosana Rolfe，then amplified by 20 selected random primers.Results:Extraction kit Was effeetive for 4 Callicarpa linn species genome DNA.With the DNA extracted from several plants as template，20 primers amplified a total of 152 bands，137 bands were polymorphic，polymorphism rate was 88.2%，and the effect amplification was good.The dendogram reflected that 4 samples clustered into three taxa.Conclusion:This result is in accordance with their morphological observed.RAPD markers can be used to analyze polymorphisms of medicinal plants Callicarpa linn，and provide the genetic basis for identification.

Callicarpa Linn;Genomic DNA;RAPD;Polymorphism;Clustering Analysis

2014-11-03

楊先國(guó)(1977-)，男，湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校講師，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量與中藥資源。

R282.6

A

1673-2197(2015)07-0028-04

10.11954/ytctyy.201507014