劉慧敏，徐惠芳，邵貝貝(.武漢市中醫(yī)醫(yī)院 藥學(xué)部，湖北 武漢43000；武漢聯(lián)合藥業(yè)，湖北 武漢4300)

?

湖北產(chǎn)葛根藥材及提取物指紋圖譜分析

劉慧敏1，徐惠芳1，邵貝貝2
(1.武漢市中醫(yī)醫(yī)院 藥學(xué)部，湖北 武漢430010；2武漢聯(lián)合藥業(yè)，湖北 武漢430011)

目的：建立湖北產(chǎn)葛根藥材及提取物的指紋圖譜檢測(cè)方法，為確保葛根藥材、提取物及其制劑的內(nèi)在質(zhì)量提供依據(jù)。方法：采用TIANHE Kormasil C18柱；流動(dòng)相A：甲醇，流動(dòng)相B：1%醋酸溶液；流速1.0mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為250nm；柱溫為35℃。梯度洗脫程序：0～10min 22%A，10～40min 22%～45%A， 40～45min 45%A。對(duì)湖北省十堰竹溪、恩施州和黃岡羅田三個(gè)產(chǎn)地的葛根藥材及提取物進(jìn)行指紋圖譜研究。結(jié)果：湖北省三個(gè)產(chǎn)地葛根藥材及提取物的指紋圖譜基本一致。結(jié)論：湖北三個(gè)產(chǎn)地的葛根藥材質(zhì)量差異不大。葛根藥材、提取物相關(guān)性良好，各產(chǎn)地指紋圖譜基本一致，制備工藝穩(wěn)定可行。

葛根藥材；葛根提取物；指紋圖譜；質(zhì)量控制

葛根為我國(guó)常用中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為豆科植物野葛Puerarialobata(Willd.) Ohwi的干燥根[1]。葛根性涼、氣平、味甘，主要含異黃酮成分葛根素、葛根素木糖苷、大豆苷、大豆苷元及β-谷甾醇、花生酸等多種生理活性物質(zhì)，尤以葛根素含量最高[2, 3]。葛根素具有解肌退熱、透發(fā)麻疹、生津止渴、升陽止瀉、通經(jīng)活絡(luò)、解酒毒等功效[4]，臨床上主要用于治療外感發(fā)熱頭痛、頸項(xiàng)強(qiáng)痛、口渴、麻疹不透、熱痢、泄瀉、眩暈頭痛、中風(fēng)偏癱、酒毒傷中等癥[5, 6]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明葛根中的異黃酮類化合物葛根素對(duì)高血壓、高血脂、高血糖和心腦血管疾病有很好的療效[7, 8]。

葛根喜生長(zhǎng)于山坡草叢中或路旁及疏林中較陰濕的地方。我國(guó)的葛根資源主要分布在陜西、湖北、四川[9]和安徽等地[10-12]，其中湖北為葛根產(chǎn)量最大的省市之一。湖北葛根資源主要集中在十堰市、黃岡市、恩施州，被廣泛用于食品和醫(yī)藥等行業(yè)[13]。由于不同產(chǎn)地的葛根藥材外形相似，在市場(chǎng)流通和使用階段存在混雜現(xiàn)象，目前對(duì)葛根的質(zhì)量控制主要是檢測(cè)葛根素的含量[1]，單一指標(biāo)難以反映中藥多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)[14]。為了更有效地控制葛根質(zhì)量，葛根指紋圖譜的研究逐漸增多[15-19]。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法對(duì)湖北產(chǎn)葛根藥材及不同產(chǎn)地藥材相同工藝的提取物進(jìn)行了指紋圖譜研究[20]，為確保葛根藥材、提取物及其制劑的內(nèi)在質(zhì)量提供參考依據(jù)。

1 儀器和材料

島津LC-20AT液相色譜儀(包括LC-20AT色譜泵, SPD-20A紫外檢測(cè)器),SP-756(PC)型紫外可見分光光度計(jì)(Spectrum shanghai),HPD200A型大孔樹脂(滄州寶恩吸附材料科技有限公司)，15mm×500mm 的玻璃柱。

葛根對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110752-200912，供含量測(cè)定用),冰乙酸(北京化工廠，批號(hào)：20080708)，甲醇為色譜級(jí)，水為純凈水，其余試劑均為分析純。

葛根藥材3批，分別采購(gòu)于湖北省的十堰竹溪、恩施州和黃岡羅田，經(jīng)武漢市中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部鑒定為豆科植物野葛。

自制葛根提取物3批：3批藥材分別加10倍量水，提取3次，每次1.5h；60%乙醇提取24h，回收溶劑，得干膏。提取物干膏中葛根素和總黃酮含量分別為(12.08%±0.56%)和(31.42%±0.12%)。

自制葛根純化物3批：將自制提取物用HPD200A大孔樹脂純化，收集30%乙醇洗脫液，回收溶劑，得干膏。純化物干膏中葛根素和總黃酮含量分別為(32.40%±0.47%)和(75.52%±0.19%)。

2 色譜條件

TIANHE Kormasil C18柱(4.6mm×150mm，5μm)；流動(dòng)相A：甲醇，流動(dòng)相B：1%醋酸溶液；流速1.0mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為250nm；柱溫為35℃。梯度洗脫程序：0～10min 22%A，10～40min 22%～45%A， 40～45min 45%A。

3 方法

3.1 對(duì)照品溶液制備

精密稱取葛根素對(duì)照品10.40mg于5 mL容量瓶中，無水乙醇定容，再取1mL于25mL容量瓶中定容，得濃度為83.2μg·mL-1的對(duì)照品溶液。

3.2 供試品溶液制備

藥材：葛根素含量測(cè)定按照2010版《中國(guó)藥典》(一部)方法，取葛根飲片，粉碎，過50目篩備用。精密稱取葛根粉末0.1g于燒瓶中，精密加入30%乙醇50mL，稱定重量，加熱回流30min，放冷，再稱定重量，用30%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液10μL進(jìn)樣。

提取物：取自制葛根提取物的干膏，加 30%乙醇溶解稀釋，過濾，取續(xù)濾液，進(jìn)樣。

純化物：取自制葛根純化物的干膏，加30%乙醇溶解稀釋，過濾，取續(xù)濾液，進(jìn)樣。

3.3 測(cè)定方法

分別精密吸取對(duì)照品溶液和藥材的供試品溶液10μL， 在色譜條件下分析，對(duì)照品色譜見圖1，藥材供試品色譜見圖2。

4 方法學(xué)考察

精密稱取葛根素對(duì)照品適量，用流動(dòng)相溶解并稀釋為5.32、10.63、21.26、63.78、85.04、106.30μg·mL-1的對(duì)照品溶液，準(zhǔn)確量取各溶液10μL進(jìn)樣。以樣品的峰面積(A)和對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度(C)，應(yīng)用最小二乘法線性回歸處理后得方程為A=47 257C+2 524.2，r=0.999 9，表明在質(zhì)量濃度為5.32～106.30μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，符合試驗(yàn)要求。

圖1 葛根素對(duì)照品HPLC圖譜

葛根素乙醇溶液低、中、高濃度(21.26，53.15，85.04μg·mL-1)精密度的RSD分別為0.11 %、0.18 %、0.27 %，符合要求。

5 結(jié)果

5.1 共有峰標(biāo)定

湖北省三個(gè)產(chǎn)地葛根的提取物和純化物分別在色譜條件下測(cè)得HPLC圖譜，在《指紋圖譜相似度軟件藥典2004A版》下處理，得到葛根提取物和純化物的HPLC對(duì)照?qǐng)D譜(提取物：圖3中R、純化物：圖4中R)。 以R為對(duì)照?qǐng)D譜，計(jì)算湖北省三個(gè)產(chǎn)地葛根提取物和純化物在同一保留時(shí)間的相對(duì)峰面積值。結(jié)果見表1、表2。疊加色譜峰見圖3、圖4。

a：湖北十堰；b：湖北恩施；c：湖北黃岡

表1 三個(gè)產(chǎn)地(十堰、恩施、黃岡)葛根提取物共有峰相對(duì)面積

由上述可知，湖北省不同產(chǎn)地葛根藥材提取物和純化物指紋圖譜比較，結(jié)果表明：十堰、恩施和黃岡三個(gè)產(chǎn)地的葛根藥材提取物共有峰有 19個(gè)，三個(gè)產(chǎn)地葛根藥材純化物的共有峰也有11個(gè)，各個(gè)峰的信噪比都在10 以上且共有峰面積之和大于總峰面積的90%。

5.2 相似度比較

利用國(guó)家藥典委員會(huì)相似度計(jì)算軟件《指紋圖譜相似度軟件藥典2004B版》，使用相關(guān)系數(shù)法計(jì)算，對(duì)所得的葛根藥材提取物和純化物HPLC指紋圖譜全譜進(jìn)行相似度計(jì)算。以相關(guān)系數(shù)表征相似度，結(jié)果見表3、表4。

表2 三個(gè)產(chǎn)地(十堰、恩施、黃岡)葛根純化物共有峰相對(duì)面積

表3 湖北三個(gè)產(chǎn)地葛根提取物相似度比較

注：R為對(duì)照?qǐng)D譜，S1、S2、S3為十堰、恩施和黃岡的葛根樣品。

表4 湖北三個(gè)產(chǎn)地葛根純化物相似度比較

注：R為對(duì)照?qǐng)D譜，S1、S2、S3為十堰、恩施和黃岡的葛根樣品。

表3和表4表明，湖北省十堰、恩施和黃岡三個(gè)產(chǎn)地野葛藥材的提取物和純化物都很匹配，與對(duì)照指紋圖譜的相似度均能達(dá)到90% 以上。

6 結(jié)語

湖北省葛根資源豐富，本實(shí)驗(yàn)首次對(duì)湖北產(chǎn)葛根藥材進(jìn)行了指紋圖譜研究，對(duì)流動(dòng)相的篩選考察了甲醇—水(22∶78)，甲醇-水(梯度洗脫)，甲醇-1%醋酸(22∶78)，甲醇-1%醋酸(25∶75)，甲醇-1%醋酸(梯度洗脫)等，最終確定了流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為1%醋酸溶液，流速1.0mL·min-1,檢測(cè)波長(zhǎng)250nm，柱溫為35℃。梯度洗脫程序：0～10min 22%A，10～40min 22%～45%A， 40～45min 45%A的色譜分離條件，得到了分離度較好的指紋圖譜。

圖3 湖北三個(gè)產(chǎn)地葛根提取物HPLC圖譜

注：R為對(duì)照?qǐng)D譜， S1、S2、S3為十堰、恩施和黃岡的葛根樣品。

圖4 湖北三個(gè)產(chǎn)地葛根純化物HPLC圖譜

注：R為對(duì)照?qǐng)D譜， S1、S2、S3為十堰、恩施和黃岡的葛根樣品。

通過對(duì)比湖北三個(gè)主要產(chǎn)地十堰、恩施和黃岡的葛根藥材及提取物的指紋圖譜，結(jié)果表明三個(gè)產(chǎn)地的葛根藥材提取物共有峰有 19個(gè)，三個(gè)產(chǎn)地葛根藥材純化物的共有峰有11個(gè)，各個(gè)峰的信噪比都在10 以上且共有峰面積之和大于總峰面積的90%，表明這三個(gè)產(chǎn)地葛根藥材的活性成分種類含量基本一致。

不同產(chǎn)地的葛根藥材在相同的工藝條件下進(jìn)行提取和純化處理，得到的葛根素和總黃酮含量基本一致，且相同工藝條件下不同產(chǎn)地的葛根提取物和純化物的指紋圖譜相似度均能達(dá)到90%以上，說明該制備工藝對(duì)湖北省三個(gè)主要產(chǎn)地的葛根藥材均適用，可以作為葛根藥材及其制劑質(zhì)量檢測(cè)的依據(jù)。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典 [M].一部. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010.

[2] 鄒清波.葛根素對(duì)心血管系統(tǒng)的藥用價(jià)值[J].中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用,2010，4(12):124-125.

[3] 王文亮，杜方嶺，祝清俊.葛根素提純方法研究新進(jìn)展[J].中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng),2009(8):40-42.

[4] 徐軼爾，李秋紅，楊菲菲.中藥葛根的藥理藥效研究[J].吉林中醫(yī)藥,2010，30(11):993-994.

[5] CHEN X, CAI F, GUO S, et al. Protective effect of Flos puerariae extract following acute alcohol intoxication in mice[J]. Alcohol Clin Exp Res,2014,38(7):1839-1846.

[6] SOOK KY, SOO LI, SOOK KJ. Protective effects of puerariae radix extract and its single compounds on methylglyoxal-induced apoptosis in human retinal pigment epithelial cells[J]. J Ethnopharmacol,2014,152(3):594-598.

[7] ZHANG Y, YUAN J, WANG Y, et al. LC-MS/MS determination and pharmacokinetics study of puerarin and daidzein in rat plasma after oral administration of Gegenqinlian decoction and Radix Puerariae extract[J]. Pharmacogn Mag,2014,10(39):241-248.

[8] 溫切木·吐爾，伊麗米古麗·阿布杜扎伊爾.葛根素臨床應(yīng)用進(jìn)展[J].臨床合理用藥雜志,2011，4(12):121-122.

[9] 陳玉，鄭萍.川產(chǎn)葛根藥材的HPLC指紋圖譜[J].華西藥學(xué)雜志,2008，23(2):217-218.

[10] 王黎，高蘇亞，李華.不同產(chǎn)地葛根的HPLC指紋圖譜及質(zhì)量評(píng)價(jià)研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011(18):10782-10784.

[11] 陳添福，楊玉琴，張麗艷，等. 貴州葛根高效液相色譜指紋圖譜研究[J]. 中國(guó)藥業(yè),2008(3):10-11.

[12] 冷紅瓊，張郴，秦智彬，等.云南產(chǎn)葛根HPLC指紋圖譜研究[J].昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2012(6):39-42.

[13] 郭艷艷，成春燕，黃靜麗，等.不同來源葛根遺傳多樣性ISSR分析[J].大眾科技,2013(4):134-136.

[14] 張雷紅，沈小鐘，張現(xiàn)濤，等.葛根藥材指紋圖譜分析方法研究[J].廣東微量元素科學(xué),2010(7):29-33.

[15] 沈夢(mèng)潔，馮昕韡，朱仲良.葛根HPLC指紋圖譜及模式識(shí)別研究[J].內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2012(1):73-76.

[16] 陳樹和，陳荔炟，巴賽，等.葛根總黃酮的HPCE指紋圖譜研究[J].中國(guó)藥房,2010(39):3709-3711.

[17] 趙晨曦，袁大林，Christy Chan，等.葛根異黃酮色譜指紋圖譜-抗氧化活性關(guān)系研究[C].全國(guó)計(jì)算機(jī)化學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集，2009.

[18] 方從兵，宛曉春，江昌俊，等.葛根藥用成分異黃酮的HPLC指紋圖譜分析[J].熱帶作物學(xué)報(bào),2005(2):39-44.

[19] 何春年，李敏，曹志高，等.葛根藥材HPLC指紋圖譜研究[J].中國(guó)中藥雜志,2003(12):41-45.

[20] 陳麗.葛根與葛根提取物及葛根注射液指紋圖譜研究[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2010(8):1153-1155.

(責(zé)任編輯：魏 曉)

Study on Fingerprints of Radix Puerariae and its Extract in Hubei Province

Liu Huimin1,Xu Huifang1,Shao Beibei2
(1.Wuhan hospital of traditional chinese medicine, Department of pharmacy, Wuhan 430010, China；
2.Wuhan united Pharmacy,Wuhan 430011, China)

Objective:To establish the fingerprints of Radix Puerariae and its extract in Hubei Province for the quality control.Methods:The fingerprints of Radix Puerariae and its extract were established by HP LC. The chromatographic separation was perfermed on a TIANHE Kormasil C18column(4.6 mm×150 mm, 5μm). The mobile phase consisted of methanol and 1% acetic acid with gradient elution. The f low-rate was 1.0mL·min-1, the column temperature was at 35℃ and the UV absorbance detection was at 250nm.Results:Under the selected chromate graphic conditions, a good fingerprint of Radix Puerariae and its extract were obtained. The fingerprint of Radix Puerariae from Zhuxi Shiyan, Enshi and Luotian Huanggang were basically identical.Conclusion:The quality of Radix Puerariae and its extract can be controlled effectively by HPLC-UV fingerprint. The Preparation process of the extract from Radix Puerariae is stable and feasible.

Radix Puerariae; Radix Extract； Fingerprint; Quality Control

2015-01-20

劉慧敏(1987-)，女，武漢市中醫(yī)醫(yī)院中藥師，研究方向?yàn)橹兴幮轮苿┡c新技術(shù)。

R284

A

1673-2197(2015)11-0025-05

10.11954/ytctyy.201511011