劉文玲，陳 晨，*，張瑞東，胡文忠，何煜波，林昱汐

（1.大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧省食源性病原微生物快速檢測與控制工程技術(shù)研究中心，遼寧大連116600；2.大窯灣出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧大連116600）

儲藏溫度對侵入鮮切胡蘿卜、黃瓜內(nèi)部大腸桿菌生長的影響

劉文玲1，陳 晨1，*，張瑞東2，胡文忠1，何煜波1，林昱汐1

（1.大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧省食源性病原微生物快速檢測與控制工程技術(shù)研究中心，遼寧大連116600；2.大窯灣出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧大連116600）

為研究儲藏溫度對侵入鮮切蔬菜內(nèi)部大腸桿菌生長的影響，以鮮切胡蘿卜、黃瓜為原料浸泡接種大腸桿菌，分別置于4、12、24℃的條件下儲藏，測定分析大腸桿菌在兩種鮮切蔬菜中的侵入能力以及在儲藏過程中的生長情況。結(jié)果表明，大腸桿菌能夠侵入到鮮切胡蘿卜、黃瓜內(nèi)部。在4、12℃儲藏過程中，侵入鮮切蔬菜內(nèi)部的大腸桿菌數(shù)量隨著儲藏時(shí)間延長而逐漸降低（p＜0.05）。當(dāng)儲藏溫度升高至24℃時(shí)，隨著儲藏時(shí)間的延長，侵入鮮切胡蘿卜5～8 mm處的大腸桿菌緩慢下降，而侵入鮮切黃瓜內(nèi)部不同深度大腸桿菌在儲藏1～3 d無顯著變化（p＞0.05），在第5 d時(shí)略有下降。通過比較兩種鮮切蔬菜中大腸桿菌的生長情況發(fā)現(xiàn)，在三種溫度條件下儲藏過程中，侵入鮮切黃瓜內(nèi)部大腸桿菌的生長情況均優(yōu)于侵入鮮切胡蘿卜中的大腸桿菌。

大腸桿菌，鮮切胡蘿卜，鮮切黃瓜，侵入，儲藏溫度

鮮切果蔬作為食品工業(yè)中一種新興產(chǎn)品，因具有品質(zhì)新鮮、食用方便和營養(yǎng)衛(wèi)生等優(yōu)點(diǎn)，自20世紀(jì)50年代問世后得到較快發(fā)展[1]。但鮮切加工操作（如去皮、切割及切片等）使果蔬失去了天然保護(hù)防御機(jī)制，提高病原微生物的附著和入侵幾率，給產(chǎn)品的安全帶來隱患[2]。研究表明大腸桿菌O157∶H7更易于附著在鮮切萵苣的切割傷口處，并且會從切割處侵入到萵苣葉片內(nèi)部[3-4]。大腸桿菌、沙門氏菌等多種病原微生物均可以通過切割傷口侵入香瓜、青椒等果蔬內(nèi)部[5-8]，一旦病原微生物侵入鮮切果蔬內(nèi)部，一般的殺菌處理很難將其去除[9-11]。而侵入鮮切果蔬內(nèi)部的病原微生物的生長會受鮮切產(chǎn)品的種類、儲藏溫度及氣體環(huán)境等因素影響[4，12-13]。目前對于病原微生物在鮮切果蔬中侵入情況的研究較少，大腸桿菌（Escherichia coli）是目前世界公認(rèn)引起食源性疾病的重要致病菌之一，主要通過進(jìn)食和飲水傳播，近年來在鮮切果蔬中常檢測出大腸桿菌的存在[14-15]。本文以鮮切胡蘿卜和鮮切黃瓜為材料，研究大腸桿菌在兩種鮮切蔬菜中的侵入能力，并考察在4、12、24℃的溫度條件下儲藏過程中，侵入鮮切胡蘿卜和鮮切黃瓜內(nèi)部的大腸桿菌的生長情況。為探索病原微生物侵入鮮切果蔬的機(jī)理，開發(fā)高效控制鮮切果蔬質(zhì)量安全的方法提供理論依據(jù)。

1 材料方法

1.1 材料與儀器

胡蘿卜和黃瓜 購于大連開發(fā)區(qū)新瑪特超市；大腸桿菌（含氨芐青霉素抗性基因） 由大連民族學(xué)院生命科學(xué)院生物技術(shù)基礎(chǔ)中心實(shí)驗(yàn)室提供；LB培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；蛋白胨 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；氨芐青霉素 上海穎心實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司。

MLS-3020型全自動高壓蒸汽滅菌器 日本SANYO公司；1300系列A2型二級生物安全柜 美國THERMO FISHER SCIENTIFIC公司；AB135-S型分析天平 瑞士METTLER TOLEDO公司；BagMixer-400W型均質(zhì)器 法國INTERSCIENCE公司；DNP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HYC-326A型醫(yī)用冷藏箱 青島海爾特種電器有限公司；OL-506型切片器 浙江正龍塑料制品有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 接種菌液的制備 取大腸桿菌37℃、24 h培養(yǎng)物（107cfu/mL），4℃、5000 r/min條件下離心5 min后，棄去上清，沉淀用0.1%蛋白胨水沖洗，重復(fù)兩次后沉淀用0.1%蛋白胨水適當(dāng)稀釋，得到濃度約為107cfu/mL的菌懸液，即接種菌液[16]。

1.2.2 樣品制備與接種 在無菌室內(nèi)，將黃瓜和胡蘿卜用自來水洗凈后，用無菌刀將其切成長約2 cm的小段，置于接種菌液中浸泡接種1 min，在生物安全柜中室溫干燥30 min。采用無菌刀去除接種后鮮切黃瓜和胡蘿卜四周4 mm厚的表皮，以排除表層大腸桿菌對實(shí)驗(yàn)的影響。將處理后的兩種鮮切蔬菜放入無菌保鮮盒中采用保鮮膜封口，分別置于4、12和24℃的條件下儲藏5 d，于1、3、5 d取樣測定大腸桿菌的數(shù)量。

1.2.3 大腸桿菌計(jì)數(shù) 采用切片器對鮮切胡蘿卜和鮮切黃瓜進(jìn)行切片處理，每塊樣品切8片，每片厚度為1 mm，每次切片后采用70%的乙醇對刀片殺菌處理。將切得每片樣品分別置于無菌均質(zhì)袋中，加入0.1%蛋白胨水均質(zhì)1 min，取上清菌懸液選擇合適稀釋度用無菌生理鹽水進(jìn)行稀釋，取100 μL的稀釋液涂布于LB（含氨芐青霉素）平板上，37℃培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)。每個(gè)處理做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 大腸桿菌在鮮切胡蘿卜和鮮切黃瓜中的侵入情況

鮮切果蔬從果蔬采收、鮮切加工、物流過程到終端消費(fèi)整個(gè)過程中，都有可能遭受病原微生物的侵染，鮮切果蔬外皮的去除和切割形成的創(chuàng)傷面使得微生物更易于侵入內(nèi)部[6，17]。表1表示浸泡接種1 min后大腸桿菌在鮮切胡蘿卜和鮮切黃瓜中的侵入情況。由表1可知，大腸桿菌可以侵入鮮切胡蘿卜和鮮切黃瓜內(nèi)部，且在兩種鮮切蔬菜中的侵入能力無顯著差異（p＞0.05）。隨著樣品深度的增加，大腸桿菌侵入的數(shù)量逐漸減少。在鮮切胡蘿卜和鮮切黃瓜表層（0～1 mm），大腸桿菌接種量分別為5.66 lg cfu/g和6.02 lg cfu/g；在7～8 mm處，大腸桿菌侵入量分別比表層降低了1.07 lg cfu/g和1.28 lg cfu/g。

表1 大腸桿菌在鮮切胡蘿卜和鮮切黃瓜中的侵入情況（lg cfu/g）Table 1 Populations of internalized E.coli at different depths in fresh-cut carrots and cucumbers（lg cfu/g）

2.2 4℃儲藏對侵入鮮切胡蘿卜和鮮切黃瓜內(nèi)部大腸桿菌生長的影響

表2為4℃儲藏過程中侵入鮮切胡蘿卜和鮮切黃瓜內(nèi)部大腸桿菌的生長情況。如表2所示，在4℃條件儲藏過程中，隨著儲藏時(shí)間的延長，侵入鮮切胡蘿卜和鮮切黃瓜內(nèi)部不同深度的大腸桿菌數(shù)量呈現(xiàn)不同程度的降低，且侵入越深大腸桿菌數(shù)量下降越快。這與O’Beirnea等[18]研究大腸桿菌O157∶H7在鮮切胡蘿卜中的生長情況一致。當(dāng)儲藏至第5 d時(shí)，鮮切黃瓜7～8 mm處大腸桿菌的數(shù)量為2.49 lg cfu/g，比第0 d（接種后）下降了2.25 lg cfu/g，而此時(shí)，在鮮切胡蘿卜中7～8 mm處的大腸桿菌的數(shù)量已小于1 lg cfu/g，即低于檢測限。儲藏溫度是影響鮮切果蔬中病原微生物生長的重要因素，一般情況下，低溫能夠有效控制微生物的生長繁殖[19]。Francis等[20]報(bào)道，當(dāng)儲藏溫度從8℃降低至4℃時(shí)，能有效降低大腸桿菌O157∶H7在萵苣、大頭菜、豆芽等蔬菜中的生長。同樣，在5℃儲藏過程中，萵苣、黃瓜和胡蘿卜中的大腸桿菌O157∶H7的數(shù)量逐漸下降，而在12、21℃儲藏過程中，大腸桿菌O157∶H7的數(shù)量逐漸上升[21]。由此可見，低溫能夠有效控制侵入鮮切胡蘿卜和鮮切黃瓜內(nèi)部大腸桿菌的生長。

表2 4℃儲藏對侵入鮮切胡蘿卜和鮮切黃瓜內(nèi)部大腸桿菌生長的影響Table 2 Fate of E.coli at different depths in fresh-cut carrots and cucumbers stored at 4℃

表3 12℃儲藏對侵入鮮切胡蘿卜和鮮切黃瓜內(nèi)部大腸桿菌生長的影響Table 3 Fate of E.coli at different depths in fresh-cut carrots and cucumbers stored at 12℃

表4 24℃儲藏對侵入鮮切胡蘿卜和鮮切黃瓜內(nèi)部大腸桿菌生長的影響Table 4 Fate of E.coli at different depths in fresh-cut carrots and cucumbers stored at 24℃

2.3 12℃儲藏對侵入鮮切胡蘿卜和鮮切黃瓜內(nèi)部大腸桿菌生長的影響

在12℃條件下儲藏過程中，侵入鮮切胡蘿卜和鮮切黃瓜內(nèi)部大腸桿菌的數(shù)量變化如表3所示。從表3中可以看出，隨著儲藏時(shí)間的延長，侵入鮮切胡蘿卜內(nèi)部的大腸桿菌的數(shù)量顯著降低（p＜0.05），但其下降幅度要明顯低于4℃條件下儲藏。而O’Beirnea等[18]報(bào)道侵入鮮切胡蘿卜內(nèi)部的大腸桿菌O157∶H7的數(shù)量在10℃條件儲藏過程中顯著上升，這可能因?yàn)閮身?xiàng)研究中采用的包裝材料不同，或鮮切產(chǎn)品中內(nèi)源性微生物種類和數(shù)量存在差異，進(jìn)而影響大腸桿菌的生長。此外與4℃變化趨勢相同的是，在12℃條件儲藏過程中侵入越深大腸桿菌數(shù)量下降越快，當(dāng)儲藏至第5 d時(shí)，侵入鮮切胡蘿卜7～8 mm處大腸桿菌數(shù)量與第0 d相比下降了2.53 lg cfu/g。而侵入鮮切黃瓜中大腸桿菌的數(shù)量在儲藏的1～3 d無顯著變化（p＞0.05），當(dāng)儲藏至第5 d時(shí)大腸桿菌的數(shù)量開始顯著降低（p＜0.05），下降幅度在0.66～1.01 lg cfu/g之間。

2.4 24℃儲藏對侵入鮮切胡蘿卜和鮮切黃瓜內(nèi)部大腸桿菌生長的影響

表4為24℃條件下儲藏過程中大腸桿菌在鮮切胡蘿卜和鮮切黃瓜中的生長情況。如表4所示，侵入鮮切胡蘿卜中1～4 mm的大腸桿菌在儲藏1～3 d變化不顯著（p＞0.05），當(dāng)儲藏至第5 d時(shí)，大腸桿菌的數(shù)量顯著低于第0 d（p＜0.05），下降幅度在0.9～1.44 lg cfu/g之間。侵入鮮切胡蘿卜內(nèi)部5～8 mm的大腸桿菌隨著儲藏時(shí)間的延長，數(shù)量逐漸下降。而侵入鮮切黃瓜內(nèi)部不同深度大腸桿菌在儲藏的1～3 d無顯著變化（p＞0.05），在第5 d時(shí)略有下降。Chimbombi等[6]研究表明在室溫（23℃）條件下，侵入鮮切香瓜內(nèi)部的沙門氏菌呈現(xiàn)指數(shù)增長，30 h后在侵染處沙門氏菌的數(shù)量就可達(dá)到感染劑量。這與本研究結(jié)果不同，主要是因?yàn)橐环矫嫔抽T氏菌與大腸桿菌在鮮切果蔬中的附著與侵入能力不同，另一方面香瓜自身含有的營養(yǎng)物質(zhì)以及pH比胡蘿卜和黃瓜更有利于微生物的生長繁殖。此外，在不同的溫度條件下儲藏期間，侵入鮮切黃瓜中的大腸桿菌生長情況均優(yōu)于侵入鮮切胡蘿卜中的大腸桿菌，這可能是由于黃瓜內(nèi)部組織更疏松，使其內(nèi)部的氣體環(huán)境比鮮切胡蘿卜更適合大腸桿菌生存。

3 結(jié)論

大腸桿菌可以侵入到鮮切胡蘿卜和鮮切黃瓜的內(nèi)部，4℃儲藏能夠有效降低侵入鮮切蔬菜內(nèi)部大腸桿菌的數(shù)量，且隨著侵入深度的加深，大腸桿菌數(shù)量降低的越多。此外，在4、12和24℃三種溫度下儲藏過程中侵入鮮切黃瓜中的大腸桿菌生長情況均優(yōu)于侵入鮮切胡蘿卜中的大腸桿菌。為有效控制大腸桿菌在鮮切果蔬中的侵入及生長，在鮮切加工過程中，果蔬處理或清洗用水要保證持續(xù)有效的消毒，同時(shí)采用低溫儲藏來控制侵入鮮切果蔬內(nèi)部大腸桿菌的生長，也可以選擇輻照等穿透力強(qiáng)的殺菌措施來殺死侵入內(nèi)部的大腸桿菌。

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Effect of storage temperature on the fate of internalized E.coli in fresh-cut carrots and cucumbers

LIU Wen-ling1，CHEN Chen1，*，ZHANG Rui-dong2，HU Wen-zhong1，HE Yu-bo1，LIN Yu-xi1
（1.College of Life Science，Dalian Nationalities University，Research Center of Engineering and Technology for Rapid Detection of Foodborne Microorganisms and Control，Dalian 116600，China；2.Dayaowan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Dalian 116600，China）

In order to explore the effect of storage temperature on the fate of internalized E.coli in freshcut vegetables，fresh-cut carrots and cucumbers inoculated with E.coli and the stored at 4，12 and 24℃.The penetration ability of E.coli in these two kind of fresh-cut vegetable and the fate of internalized E.coli during storage were investigated.The results showed that E.coli could penetrate into fesh-cut carrots and cucumbers at varying degrees.During the storage at 4 and 12℃，the number of internalized E.coli was reduced gradually with storage time increased（p＜0.05）.When elevated storage temperature to 24℃，the populations of E.coli penetrated to 5～8 mm in fresh-cut carrots decreased during storage.While the couts of internalized E.coli in fresh-cut cucumbers at different depths did not change significantly（p＞0.05）during 3 d storage and decreased at the 5 d.Furthermore，the internalized E.coli in fresh-cut cucumbers grew better than that in fresh-cut carrots during storaged at 4，12 and 24℃.

Escherichia coli；fresh-cut carrots；fresh-cut cucumbers；penetration；storage temperature

TS201.3

A

1002-0306（2015）22-0330-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.059

2015－03－16

劉文玲（1994-），女，大學(xué)本科，研究方向：食品質(zhì)量與安全，E-mail：775881215@qq.com。

*通訊作者：陳晨（1986-），女，博士，講師，研究方向：食品質(zhì)量與安全，E-mail：chenchen@dlnu.edu.cn。

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD38B05）；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31172009）；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃資助（G201512026010）；遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項(xiàng)目（L2014537）；大連民族學(xué)院博士啟動基金項(xiàng)目（0701-110014）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（DC2013010107）。