陳毅挺，李艷霞，黃 露，林如婷

（閩江學(xué)院化學(xué)與化學(xué)工程系，福建省綠色功能材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州350108）

響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取翻白草中的三萜類物質(zhì)

陳毅挺，李艷霞，黃 露，林如婷

（閩江學(xué)院化學(xué)與化學(xué)工程系，福建省綠色功能材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州350108）

利用響應(yīng)面法對微波輔助提取翻白草中的總?cè)乒に囘M(jìn)行研究。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取提取時間、液料比和提取功率作為考察因素，以總?cè)铺崛〉寐首鳛樵u價(jià)指標(biāo)，利用Box-Behnken中心組合方法設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面分析法，建立數(shù)學(xué)模型，從而確定最佳提取工藝為使用無水乙醇作為提取劑，液料比控制為20 mL/g，以381 W的微波功率提取116 s，此條件下，翻白草中總?cè)频奶崛〉寐蔬_(dá)到1.305%，與理論預(yù)測值（1.252%）基本相符。此方法具有提取時間短、控制方便、節(jié)能環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，有望用于翻白草中三萜類物質(zhì)的提取。

翻白草，微波提取，響應(yīng)面分析，總?cè)?/p>

翻白草又名白頭翁、天青地白等，臨床上多以翻白草的水煎劑用作內(nèi)服藥，主治吐血、咳血、下血、婦女血崩、痢疾、瘧疾、高血脂等[1]，其含有黃酮、鞣質(zhì)、三萜、多酚等物質(zhì)。三萜類化合物是由數(shù)個異戊二烯去掉羥基后相連構(gòu)成的物質(zhì)，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌、抗?jié)?、降血糖等效?yīng)[2]。天然產(chǎn)物中三萜類化合物的提取方法主要有回流提取[3]、超聲提取[4]、微波提取[5]、超臨界流體萃取[6]、沉淀吸附[7]等。微波提取熱效率高、升溫速度均勻，可以大幅縮短提取時間，因此被廣泛用于天然產(chǎn)物有效成分的提取[8]。目前，翻白草中三萜類物質(zhì)的提取多集中于回流提取、超聲提取等，尚未有利用微波技術(shù)對其進(jìn)行提取的報(bào)道。本論文利用響應(yīng)面法優(yōu)化探索微波提取翻白草中三萜類化合物的最佳條件。首先通過對乙醇濃度、微波施加方式（含控制溫度和控制微波功率兩種形式，分別對應(yīng)提取溫度和微波時間、微波功率和微波時間）、料液比進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)確定響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的考察范圍，然后通過Box-Behnken模式進(jìn)行組合分析，對翻白草中三萜類化合物的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。此外，還初步考察了翻白草的不同部位中三萜類化合物的大致分布，以期為翻白草的進(jìn)一步開發(fā)利用提供一定的依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

翻白草（全草） 亳州中藥材交易市場，采自安徽鳳陽周邊地區(qū)；熊果酸 上海阿拉丁試劑有限公司（對照品，98.5%）；高氯酸、香草醛 分析純，廣東汕頭新宇化工廠；無水乙醇、乙酸乙酯、石油醚 分析純，上海成海化學(xué)工業(yè)有限公司；鹽酸均 分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠。

MCR-35型常壓微波合成萃取儀 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；722型可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；IKA-A11 basic型分析用研磨機(jī) 廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司；RE-52C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鞏義市予華儀器有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 翻白草的預(yù)處理 除去翻白草干草上的泥土等雜質(zhì)，并用清水洗凈后置于烘箱中50℃烘干，然后將翻白草用研磨機(jī)研碎，并將粉末混合均勻，以保證每次實(shí)驗(yàn)所用翻白草的均一性，裝入塑料容器中密封待用。

1.2.2 翻白草中三萜類化合物的提取 取5 g翻白草，按一定固液比加入適量的無水乙醇，微波提取后趁熱抽濾，旋干濾液，得到黃綠色浸膏。室溫下以石油醚浸提至無色后用無水乙醇溶解，加適量NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為8～9，抽濾；濾液用適量的活性炭粉末在80℃回流30 min脫色；再加入稀鹽酸調(diào)節(jié)濾液pH至3～4，所得渾濁液用90 mL的乙酸乙酯萃取，取澄清液于100 mL的容量瓶，并用乙酸乙酯定容到刻度。

1.2.3 三萜類化合物的測定

1.2.3.1 熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 準(zhǔn)確稱取干燥恒重的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)樣品2.5 mg，溶于無水乙醇，再定容至25 mL的容量瓶中，搖勻，得到濃度0.1 mg/mL的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于7個10 mL容量瓶中，80℃水浴加熱揮去溶劑，分別加入2.0 mL 5%香草醛-冰醋酸和6.0 mL的高氯酸進(jìn)行顯色反應(yīng)，并在60℃水浴下加熱20 min，冷卻后用冰醋酸定容至刻度，在548 nm波長處測其吸光度，繪制熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.2 樣品測定 取1.2.2中獲得的溶液1 mL于100 mL容量瓶，在80℃水浴下蒸干。加入2.0 mL 5%香草醛-冰醋酸和6.0 mL的高氯酸進(jìn)行顯色反應(yīng)，并在60℃水浴下加熱20 min，冷卻后用冰醋酸定容至刻度，在548 nm波長處測其吸光度。由三萜類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總?cè)苹衔锏暮?，按下式?jì)算總?cè)频奶崛〉寐省?/p>

式中：C為通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的總?cè)苹衔锏馁|(zhì)量濃度，mg/L；V為測試液的體積，mL；n為提取液稀釋的倍數(shù)；W為翻白草粉末的質(zhì)量，g。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 對乙醇濃度、微波施加方式（含控制溫度和控制微波功率兩種形式，分別對應(yīng)提取溫度和微波時間、微波功率和微波時間）、料液比進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，以確定各因素影響程度和適宜范圍。單因素實(shí)驗(yàn)只變更單因素項(xiàng)，其余因素不變，具體提取過程參照1.2.2，測定過程參照1.2.3。

1.2.4.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總?cè)铺崛〉寐实挠绊?取5份翻白草，按20 mL/g的液料比分別加入濃度為60%、70%、80%、90%、100%的乙醇，在320 W的功率下微波提取120 s，測定不同濃度乙醇作為提取溶劑時總?cè)频奶崛〉寐省?/p>

1.2.4.2 微波施加方式對總?cè)铺崛〉寐实挠绊?實(shí)驗(yàn)選用的微波合成萃取儀具有兩種微波施加模式，一是控制溫度提取，即維持溶液溫度不變，另一種是控制微波功率提取。

a.控制溫度提取模式：以無水乙醇為提取溶劑，液料比為20∶1 mL/g，改變提取溫度分別為50、60、70、80、90℃，均微波提取10 min，確實(shí)不同提取溫度對三萜類提取得率的影響。同樣使用無水乙醇為提取劑，固定液料比為20 mL/g，提取溫度為80℃，分別提取3、5、10、15、20 min，研究固定溫度下微波萃取時間對提取得率的影響。

b.控制微波功率提取模式：使用無水乙醇為提取劑，液料比為20∶1 mL/g，固定提取時間為120 s、改變微波功率分別為160、320、480、640、800 W，測定不同微波功率下總?cè)频奶崛〉寐省９潭ㄒ掖嫉臐舛葹?00%，液料比為20 mL/g，提取功率為320 W，改變提取時間分別為60、90、120、150、180 s，測定不同提取時間三萜類物質(zhì)的提取得率。

1.2.4.3 液料比對總?cè)铺崛〉寐实挠绊?以無水乙醇為提取劑，在320 W微波提取120 s，改變液料比分別為10、15、20、25、30 mL/g，以考察不同液料比對三萜類提取得率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化翻白草中三萜類化合物提取工藝 結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以總?cè)铺崛〉寐首鳛樵u價(jià)指標(biāo)，利用Box-Behnken中心組合方法[9]，選取提取時間（A）、液料比（B）、微波功率（C）對翻白草中三萜類物質(zhì)的微波提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiment design

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用F檢驗(yàn)對響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析以評價(jià)模型的統(tǒng)計(jì)意義，采用Design-Expert 8.0.進(jìn)行響應(yīng)曲面分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以熊果酸作為三萜類物質(zhì)的代表物，按照1.2.3.1中的方法進(jìn)行處理后，以熊果酸濃度為橫坐標(biāo)，548 nm處的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制散點(diǎn)圖（見圖1）?；貧w方程為A=0.0756C+0.0115，相關(guān)系數(shù)r為0.9978。

圖1 熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of ursolic acid

2.2 單因素分析

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總?cè)铺崛〉寐实挠绊?由圖2可知，顯示總?cè)铺崛〉寐孰S著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增大。估計(jì)是由于游離三萜類和三萜皂苷類化合物都易溶于乙醇，因此選用無水乙醇（100%）作為提取溶劑，可以使各種三萜類化合物可以最大限度地溶出，該因素不作為響應(yīng)面優(yōu)化的自變量。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總?cè)铺崛〉寐实挠绊慒ig.2 Effect of ethanol content on extraction yield of total triterpenoids

2.2.2 微波施加方式對總?cè)铺崛〉寐实挠绊?/p>

2.2.2.1 控制溫度提取模式 不同提取溫度對三萜類提取得率的影響如圖3所示。由圖3可見，提取溫度低于80℃時提取得率隨著溫度上升而增大，由于溫度的升高將增加分子內(nèi)能，加速溶劑分子運(yùn)動，使溶劑更容易進(jìn)入植物細(xì)胞，提高了得率；但是過高的溫度也可能造成三萜類化合物的結(jié)構(gòu)遭到破壞，所以當(dāng)溫度超過80℃后總?cè)频奶崛〉寐史炊兴档蚚10]。因此選擇最佳提取溫度為80℃。

圖3 提取溫度對總?cè)铺崛〉寐实挠绊慒ig.3 Effect of extraction temperature on extraction yield of total triterpenoids

考察了固定溫度下微波萃取時間對提取得率的影響，結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出，隨著提取時間的增加，三萜類的得率逐漸增大，當(dāng)提取10 min時提取得率達(dá)到最大值。這可能是因?yàn)槲⒉▽?xì)胞膜的破壞作用較大，從而得到較高的總?cè)铺崛〉寐蔥11]。但長時間的微波加熱會使提取物中部分三萜的結(jié)構(gòu)受破壞，當(dāng)提取時間超過10 min后，得率有所下降。因此溫度控制模式下提取時間以10 min為宜。

圖4 提取時間對總?cè)铺崛〉寐实挠绊懀?0℃）Fig.4 Effect of extraction time on extraction yield of total triterpenoids with 80℃

2.2.2.2 控制微波功率模式 微波功率對提取得率的影響見圖5。由圖5可知，微波功率低于320 W時，三萜類的提取得率隨功率增大而有所增大，但高于480 W之后三萜得率反而下降，原因可能在于微波功率過大，導(dǎo)致體系升溫過快，使部分三萜皂苷結(jié)構(gòu)被破壞。而320 W和480 W時三萜類的提取得率相近，從節(jié)約能源的角度出發(fā)，最佳微波功率選用320 W。

圖5 微波功率對總?cè)铺崛〉寐实挠绊慒ig.5 Effect of microwave power on extraction yield of total triterpenoids

改變提取時間，測定恒定微波功率下提取時間對總?cè)祁愄崛〉寐实挠绊?，其結(jié)果如圖6所示。當(dāng)提取時間低于120 s時，三萜類物質(zhì)提取得率隨微波處理時間的增加而提高；但是當(dāng)提取時間超過120 s后，隨著提取時間的延長，溶液溫度不斷升高，會造成部分三萜類被分解或者氧化，同時，提取時間過長也會造成其他醇溶性物質(zhì)溶于提取劑中，使得三萜類化合物的得率降低。為了保證有效成分結(jié)構(gòu)完好且提取得率較高，確定控制微波功率模式的最佳提取時間為120 s。

圖6 提取時間對總?cè)铺崛〉寐实挠绊懀?20W）Fig.6 Effect of extraction time on extraction yield of total triterpenoids with 320W

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，控制溫度提取模式和控制微波功率提取模式獲得的總?cè)铺崛〉寐氏嘟?，但是在微波功率控制下，達(dá)到類似提取得率所需要的時間大大縮短。這估計(jì)是由于為了溫度保持不變，微波的施加是不連續(xù)的，物系得不到持續(xù)的微波能；而在微波功率控制下，微波的持續(xù)施加有利于總?cè)频目焖偃艹觯赃x用固定微波功率提取的方式來進(jìn)行三萜提取，即將微波功率固定于320 W，提取時間確定為120 s。

2.2.3 液料比對總?cè)铺崛〉寐实挠绊?由圖7可見，提取得率先隨著液料比的增大而提高，這是由于溶液容易達(dá)到飽和，總?cè)齐y以提取完全，而液料比增大不僅有利于溶劑向細(xì)胞內(nèi)滲透，還有利于三萜類物質(zhì)向溶液中擴(kuò)散。當(dāng)液料比超過20 mL/g后，溶劑過多，原料中的雜質(zhì)也會溶出，造成提取得率略微下降，而液料比過大，溶劑用量，微波加熱負(fù)荷，提取時間和濃縮步驟的能耗也需要增加。因此實(shí)驗(yàn)選取最佳液料比為20 mL/g。

圖7 液料比對總?cè)铺崛〉寐实挠绊慒ig.7 Effect of ratio of liquid to material on extraction yield of total triterpenoids

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化翻白草中三萜類的微波提取工藝

以提取時間（A）、液料比（B）、微波功率（C）為自變量，總?cè)铺崛〉寐剩╕）為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，共17組，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Design and results of response surface analysis

用Design-Expert 8.0軟件對表2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸擬合，得到的三萜類物質(zhì)提取得率（Y）對提取時間（A）、液料比（B）、微波功率（C）的數(shù)學(xué)模型為：

Y=1.22-0.052A－0.088B＋0.13C－0.032AB－0.15AC－0.052BC－0.46A2－0.44B2－0.20C2

表3 響應(yīng)面二次回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for response surface quadratic regression equation

模擬方差分析結(jié)果和各項(xiàng)系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

從表3可以看出，模型的F=181.77、p＜0.0001，說明本實(shí)驗(yàn)采用的二次模型是極顯著的，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。失擬項(xiàng)的F比模型的F值要小得多，同時p= 0.571＞0.05，沒有顯著意義，說明數(shù)據(jù)中沒有異常點(diǎn)，不需要引入更高次數(shù)的項(xiàng)[12]。校正后的復(fù)相關(guān)系數(shù)Radj=0.9903，表明響應(yīng)值（提取得率）變化的99.03%來自于所選變量，總的來說，該模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合的很好，實(shí)驗(yàn)失擬小[13-14]。從模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)分析，模型的一次項(xiàng)A、B、C和二次項(xiàng)A2、B2、C2均達(dá)到極顯著水平，表明實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的線性效應(yīng)和曲面效應(yīng)顯著；交互項(xiàng)中，AC交互效應(yīng)極顯著。由F值的大小可以判斷各因素對三萜類物質(zhì)提取得率影響的強(qiáng)弱[15]，次序?yàn)槲⒉üβ剩疽毫媳龋咎崛r間。

圖8 交互項(xiàng)對總?cè)铺崛〉寐视绊懙捻憫?yīng)面圖Fig.8 Response surface showing the Effect of interaction terms on total triterpenoids yield

為了直觀地表現(xiàn)兩個因素對翻白草三萜類物質(zhì)提取得率的影響，可以令一個因素為固定值，分析另外兩個因素提取得率的影響。圖8直觀地反映了各因素交互作用對響應(yīng)值的影響，等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小，橢圓形表示2個因素交互作用顯著，而圓形則與之相反[16]。因此，由圖可見，微波功率和提取時間的交互作用顯著。同時，3個響應(yīng)面均為開口向下的凸形曲面，說明三萜類物質(zhì)的提取得率存在極高值。3個響應(yīng)曲面的等高線中心均位于水平-1～1之間，說明提取的最優(yōu)條件存在于所設(shè)計(jì)的因素水平范圍之內(nèi)。為確定各因素的最佳取值，用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行數(shù)值優(yōu)化分析，得出回歸模型存在最大值點(diǎn)，即最佳提取條件。其最佳的提取條件為提取時間116.46s、液料比19.41 mL/g、微波功率381.22 W。但考慮到實(shí)際操作的方便，將翻白草中三萜類的提取工藝修正為提取時間116 s、液料比20 mL/g、微波功率381 W。在此條件下，連續(xù)進(jìn)行了5次微波提取，翻白草中三萜類的提取得率為1.305%，與預(yù)測值（1.252%）接近，說明該方程與實(shí)際情況擬合良好。

2.4 翻白草根莖葉中三萜類含量的比較

在實(shí)驗(yàn)最佳條件下對翻白草根、莖、葉的粉末分別進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)根部三萜類物質(zhì)的提取得率為1.594%，莖部的提取得率為0.463%，葉部的提取得率為2.068%，即三萜類物質(zhì)在翻白草中的含量從高到低為：葉＞根＞莖。該結(jié)果有助于了解三萜類物質(zhì)在翻白草中各部位的分布情況，因此在提取翻白草中的三萜類物質(zhì)時可注意其葉部的利用。

3 結(jié)論

利用響應(yīng)面法對翻白草中的三萜類的微波提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到的最佳工藝條件是：乙醇體積分?jǐn)?shù)100%、提取時間116 s、液料比20 mL/g、微波功率381 W，實(shí)驗(yàn)值與響應(yīng)面法預(yù)測值接近。響應(yīng)面優(yōu)化的微波提取法具有提取得率高、提取時間短、控制方便、節(jié)能環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，有望用于翻白草中三萜類物質(zhì)的提取。本研究還發(fā)現(xiàn)翻白草不同部位中總?cè)坪烤哂休^大的差異，這一結(jié)果為對翻白草各部位的有效應(yīng)用提供了參考依據(jù)。

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Microwave assisted extraction of total triterpenes in potentilla discolor by response surface methodology

CHEN Yi-ting，LI Yan-xia，HUANG Lu，LIN Ru-ting
（Department of Chemistry and Chemical Engineering，Minjiang University，F(xiàn)ujian Provincial Key Laboratory of Green Functional Materials，F(xiàn)uzhou 350108，China）

Response surface methodology was applied to optimize the extraction conditions of total triterpenes in potentilla discolor by microwave assisted extraction.Based on the results of the single factor experiments，the effects of three independent variables（extraction time，solid-liquid ratio and extraction power）on the triterpenes yield were investigated by a Box-Behnken experimental design of three factors and three levels.A quadratic polynomial regression equation of the forecasting model was set up.And the optimal extraction parameters to obtain the highest triterpenes yield were as follows：the ratio of liquid to solid was 20 mL/g with ethanol as solvent，microwave power was 381 W，and extraction time was 116 s.The average experimental triterpenes yield under the optimum conditions was found to be 1.305%，which agreed with the predicted value of 1.252%. This method was promising in the extraction of total triterpenes in potentilla discolor，which had advantages of less extraction time，convenient control，energy conservation and environmental protection

potentilla discolor；microwave extraction；response surface method；total triterpenoids

TS255.1

B

1002-0306（2015）22-0236-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.041

2015－03－19

陳毅挺（1978-），男，博士，副教授，主要從事化學(xué)傳感器與現(xiàn)代分離分析方面的研究，E-mail：fjcyt@foxmail.com。

國家自然科學(xué)基金（21405075）；福建省工業(yè)引導(dǎo)性（重點(diǎn)）項(xiàng)目（2014H0040）；福建省自然科學(xué)基金（2013J01052）；閩江學(xué)院科技育苗項(xiàng)目（YKY13013）；閩江學(xué)院精品課程建設(shè)項(xiàng)目（MJW201233108）；閩江學(xué)院教學(xué)研究與改革項(xiàng)目（MJUB2013021）。