史 輝，唐俊妮，陳 娟，龍 虎，蔣 梅，王文婭

（西南民族大學生命科學與技術(shù)學院，四川成都610041）

成都市武侯區(qū)肉類食品大腸桿菌污染狀況及毒力基因調(diào)查

史 輝，唐俊妮，陳 娟*，龍 虎，蔣 梅，王文婭

（西南民族大學生命科學與技術(shù)學院，四川成都610041）

了解成都市武侯區(qū)肉類食品中大腸桿菌污染情況和分離菌株的毒力特征，以預防和控制食品污染，保證食品安全。2011～2013年間采集成都市武侯區(qū)超市和菜市場的肉類食品，經(jīng)選擇性培養(yǎng)與分離鑒定，采用PCR方法檢測8種相關毒力基因（eaeA、stx1A、stx2A、hlyA、aggR、est、eltA和bfpA）的流行情況。結(jié)果表明生肉類中大腸桿菌的檢出率為81.07%，熟肉類中大腸桿菌的檢出率為40%；在分離的324株大腸桿菌中有49株檢測到一種及以上毒力基因；主要流行的毒力基因是eaeA和aggR，未檢測到est和bfpA基因。通過本研究發(fā)現(xiàn)成都市武侯區(qū)肉類食品中大腸桿菌污染比較嚴重，大腸桿菌攜帶毒力基因以eaeA和aggR為主，該結(jié)果反映本市肉類產(chǎn)品的衛(wèi)生安全狀況，可為成都地區(qū)食品源大腸桿菌控制及毒力基因流行提供科學數(shù)據(jù)。

肉類食品，大腸桿菌，污染狀況，毒力基因

肉類產(chǎn)品是人們?nèi)粘Ｉ畹闹饕秤孟M品。隨著人們對食品安全意識不斷提升，肉類產(chǎn)品的安全性也越來越受到關注。肉類產(chǎn)品被微生物污染后可能會引起腐敗變質(zhì)和食源性疾病，從而影響肉類質(zhì)量與安全。畜體在屠宰、運輸和貯藏過程中，因為污染微生物的生長繁殖導致產(chǎn)品的腐敗，一直是困擾生產(chǎn)者的一個重要問題，同時引發(fā)的肉品安全問題也是消費者最為關注的核心[1-3]。大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）作為食品衛(wèi)生程度的重要指示菌，在肉類產(chǎn)品中污染現(xiàn)狀嚴峻。近年來對食品中大腸桿菌的監(jiān)測與分析表明肉類產(chǎn)品是受大腸桿菌污染的主要食品品種，并且污染率高[4-6]。部分研究顯示大腸桿菌不僅污染程度大，而且菌株具有多樣性，其攜帶的毒力基因存在一定流行特征[7-9]。

本研究針對2011年～2013年間成都市武侯區(qū)的超市和菜市場的肉類食品大腸桿菌污染情況和毒力基因進行調(diào)查與分析，為有關部門的監(jiān)測和管理提供參考；同時，所獲得的信息將對預防和控制大腸桿菌在食品中的流行和傳播具有重要的公共衛(wèi)生意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

425份動物性食品 2011年～2013年間從成都市武侯區(qū)的超市、菜市場和燒烤店共采集，其中生肉類食品375份（包括生豬肉、生牛肉、生羊肉、生雞肉和生鴨肉），熟肉類食品50份（包括菜市場零售熟食肉品和超市售賣包裝肉品）；EC肉湯、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）和腸桿菌科細菌生化微量鑒定管 購于杭州微生物試劑有限公司；麥康凱培養(yǎng)基和伊紅美藍培養(yǎng)基 購于青島海博生物技術(shù)有限公司；PCR試劑（Buffer、Mg2＋、dNTP、Taq酶）、Loading Buffer和DNA Marker 購于寶生物工程（大連）有限公司；Greenview

購于bioBRK公司；G-10葡萄糖凝膠 購于biowest公司；其他 均為國產(chǎn)分析純試劑。

ALS1296 PCR儀、UNIVERSAL HOODⅡ照膠儀購于美國BIO-RAD公司；DYCP-31DN電泳儀 北京市六一儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 大腸桿菌的分離 采集不同的肉類食品，無菌操作稱取樣品25 g放入225 mL EC增菌肉湯中，均質(zhì)5 min。分別稀釋至10-6～10-7涂布于麥康凱瓊脂平板和伊紅美藍瓊脂平板中，在37℃下培養(yǎng)24 h，選取在伊紅美藍培養(yǎng)基上呈紫黑色帶金屬光澤且在麥康凱培養(yǎng)基上呈紅色的菌落，進一步劃線分離，直至得到單菌落，用于后續(xù)實驗。所有菌株經(jīng)腸桿菌科生理生化鑒定實驗，確定為大腸桿菌屬。

1.2.2 大腸桿菌毒力基因的檢測

1.2.2.1 DNA模板的制備 將分離鑒定得到的菌株經(jīng)TSB增菌，然后提取樣品的總DNA，DNA提取方法參照文獻[10]采用微波加熱的方式進行提取。

1.2.2.2 擴增引物 在GenBank上搜索大腸桿菌8種毒力基因的序列（eaeA、stx1A、stx2A、hlyA、aggR、est、eltA和bfpA）設計引物，引物設計采用Primer 6.0軟件，設計的引物用BLAST進行特異性比對。引物具體信息見表1。引物合成由生工生物工程技術(shù)（上海）有限公司完成。

1.2.2.3 PCR檢測 PCR擴增反應體系為：25 mmol/L MgCl21.6 μL，10×PCR Buffer（無Mg2＋）2 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L each）1.2 μL，20 μ mol/L上下游引物各0.5 μL，模板1 μL，TaKaRa Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，用無菌超純水補足體系至20 μL。PCR擴增條件為：在95℃下預變性5 min；然后進入PCR循環(huán)，在95℃下變性40 s，在相應溫度下退火50 s，在72℃下延伸40 s，經(jīng)歷35個循環(huán)；在72℃下延伸7 min，最后在4℃保存。配制1%的瓊脂糖凝膠，取8 μL擴增產(chǎn)物點樣，在85 V電壓下電泳40 min，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。從檢測出的陽性擴增條帶中選一個樣本，送去測序驗證，以保證PCR擴增的準確性。

表1 引物信息Table 1 Primer information

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株分離結(jié)果

菌株分離結(jié)果詳見表2，從表2中可以看出，2011年7月～11月間，從170份樣品中分離得到大腸桿菌105株，檢出率為61.76%；2012年9月～12月間，從159份樣品中分離得到大腸桿菌145株，檢出率為91.19%；2013年3月～5月間，從96份樣品中分離得到大腸桿菌74株，檢出率為77.08%。對這三年的結(jié)果進行統(tǒng)計，生肉類食品中大腸桿菌檢出率為81.07%，熟肉類食品中大腸桿菌檢出率為40%。因采樣數(shù)量和采樣時間的不同，生熟肉中大腸桿菌的檢出率具有明顯的差異性。

周建平[11]從襄樊市大型農(nóng)貿(mào)市場隨機抽檢的肉類食品中，得出生肉類食品大腸桿菌檢出率為生豬肉50%、生牛肉20%，生雞肉30%，熟肉類大腸桿菌檢出率為20%。只帥等[12]對2006～2009年陜西西安市和楊凌示范區(qū)市場零售肉及涼拌菜中大腸桿菌進行了調(diào)查，零售肉中大腸桿菌陽性樣品檢出率為87.5%。鄒立扣等[13]對2009～2010年四川省各市縣的鮮豬肉中大腸桿菌污染情況進行了調(diào)查，大腸桿菌檢出率為83.33%。史秋梅等[7]對2010年河北省的農(nóng)貿(mào)市場和超市抽檢的肉類食品進行了大腸桿菌的檢測，生雞肉和生豬肉的大腸桿菌陽性檢出率為35.3%和23.8%。另外，Iyer等[14]從沙特阿拉伯吉達市的大型超市和零售肉店采集60份生肉樣，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的污染率為65%。Momtaz等[8]對印度的生肉類食品進行了大腸桿菌的調(diào)查，得出生肉樣中大腸桿菌的污染率為29.20%（238/820）。本實驗結(jié)果表明，生鮮肉類食品中大腸桿菌的檢出率為81.07%，與鄒立扣和只帥等報道的結(jié)果相近，高于周建平、史秋梅和國外等報道的數(shù)據(jù)；熟肉類食品中大腸桿菌的檢出率為40%，高于周建平報道的數(shù)據(jù)。

表2 肉類樣品中大腸桿菌分離結(jié)果Table 2 The isolation results of E.coli from meat samples

2.2 分離菌株的毒力基因調(diào)查結(jié)果

大腸桿菌8種毒力基因的PCR結(jié)果統(tǒng)計見表3?？偣?24株大腸桿菌中，275株未檢測到所調(diào)查的毒力基因，只有49株菌株中檢測到一種及以上的毒力基因。檢測的主要流行的毒力基因是eaeA（27株）和aggR（26株），est和bfpA基因未檢測出。統(tǒng)計結(jié)果表明，攜帶一個毒力基因的菌株占總菌株的11.42%，攜帶兩個毒力基因的菌株占3.09%，攜帶三個毒力基因的菌株占0.62%。

表3 分離菌株中毒力基因檢出結(jié)果Table 3 The detection results of virulence genes of isolated strains

白莉等[6]對中國2005～2007年食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)21個省監(jiān)測點不同類型食品（主要包括生羊肉、生牛肉、生豬肉、生雞肉等生肉食品）中分離得到的大腸桿菌O157的毒力基因攜帶情況進行了分析，結(jié)果表明在89株大腸桿菌O157中，有52株（58.43%）攜帶eaeA基因。Momtaz等[8]對印度生肉類食品進行大腸桿菌的調(diào)查指出，牛肉源、綿羊肉源和山羊肉源大腸桿菌中eaeA基因的檢出率分別為89.13%、82.85%和75%。在本實驗的49株毒力基因陽性菌株中，有27株（55.10%）攜帶eaeA基因。以上結(jié)果說明了肉類食品源大腸桿菌中eaeA基因的流行程度很高。eaeA為緊密素編碼基因，介導細菌與腸上皮細胞的緊密黏附，引起“黏附和抹平”損傷，是腸致病性大腸桿菌（EPEC）和腸出血性大腸桿菌（EHEC）的重要定植因子。

產(chǎn)志賀毒素型大腸桿菌（STEC）廣泛分布于動物畜體上，人類通過食用動物的肉而被STEC感染，導致胃腸道疾病。STEC的致病性基因stx1與stx2分別編碼1型與2型志賀氏毒素，能引起一系列疾病包括水樣腹瀉、出血性腸炎、血小板減少性紫癜和溶血性尿毒綜合征。畢旺來等[15]對武漢市菜場肉類食品中大腸桿菌污染狀況的分析，得出豬肉樣品中stx1檢出率為0.98%（非O157型大腸桿菌）和1.96%（O157型大腸桿菌），stx2檢出率為13.70%（非O157型大腸桿菌）和7.80%（O157型大腸桿菌）；牛肉樣品中stx1檢出率為10.00%（非O157型大腸桿菌）和16.70%（O157型大腸桿菌），stx2檢出率為5.00%（非O157型大腸桿菌）和1.70%（O157型大腸桿菌）。Bai等[9]對采自中國兩個地理區(qū)域的零售生肉進行了STEC的調(diào)查，在853份生肉樣品中有166份被確定為stx陽性，其中豬肉、牛肉、羊肉、雞肉和鴨肉樣品檢出率分別為4.4%、11.0%、20.6%、0.5%和7.7%。調(diào)查結(jié)果則表明，成都市武侯區(qū)肉類食品中stx1檢出率為0.93%（3/324）和stx2檢出率為0.31%（1/324），遠低于畢旺來和Bai等的報道結(jié)果，說明志賀毒素基因stx不是成都市武侯區(qū)肉類食品源大腸桿菌的流行基因。

目前未見關于食品源大腸桿菌aggR基因攜帶情況的調(diào)查報道，而本實驗的研究結(jié)果顯示，在49株毒力基因陽性菌株中，有26株（53.06%）攜帶aggR基因。aggR（轉(zhuǎn)譯激活因子基因）是聚集性大腸桿菌（EAEC）的重要致病基因，被建議為典型EAEC菌株的標志基因[16]。EAEC是一類新發(fā)現(xiàn)的致瀉性大腸桿菌，目前已在世界各發(fā)達、發(fā)展中國家出現(xiàn)散發(fā)或暴發(fā)流行。Dallman等[17]從413例胃腸道疾病散發(fā)案例中收集了88份糞便樣本，發(fā)現(xiàn)其中75%的樣本被檢出aggR基因，預示著EAEC病原的存在?？梢姡珽AEC是一類不容忽視的致瀉性大腸桿菌。結(jié)果表明了聚集性大腸桿菌是近年來成都市肉類食品中高度流行的致病菌株，應給予足夠重視。

2.3 分離菌株的毒力基因隨時間變化特征

從毒力基因檢出情況隨時間變化的結(jié)果表4中，可以看出，2011年流行的毒力基因有eaeA、stx1A和hlyA；2012年這三種毒力基因的檢出率比2011年明顯升高，并且另有stx2A、aggR和eltA三種毒力基因被檢出；2013年stx1A和stx2A基因未被檢出，但aggR基因的檢出率上升很高，接近30%。在這三年中，均未檢出est和bfpA基因。從時間分布來看，2011～2013年三年間各種毒力基因的檢出率存在顯著差異，有一定的毒力變化特征。攜帶eaeA毒力基因的大腸桿菌在2012年十分流行，攜帶aggR毒力基因的大腸桿菌在2013年十分突出。另外，2013年分離的大腸桿菌中沒有檢出志賀毒素stx基因。2011年105株大腸桿菌中僅有7株（6.67%）檢出毒力基因，2012年146株大腸桿菌中31株（21.23%）檢出毒力基因，2013年74株大腸桿菌中有25株（33.78%）檢出毒力基因，說明成都市武侯區(qū)肉類食品的安全衛(wèi)生狀況逐年嚴峻，食用風險程度越來越高。

表4 毒力基因檢測情況隨時間變化趨勢Table 4 The variations of virulence genes with time

3 結(jié)論

肉類是微生物滋生的優(yōu)良場所。由于養(yǎng)殖、屠宰、加工、運輸和銷售等環(huán)節(jié)控制不嚴格，常造成肉類產(chǎn)品中細菌總數(shù)增加或出現(xiàn)致病菌，尤其是出現(xiàn)致病性大腸桿菌如O157、O26、O103、O131、O158等血清型[8，18]，引發(fā)人類食源性疾病甚至導致死亡。

本調(diào)查結(jié)果表明，成都市武侯區(qū)生肉類中大腸桿菌的檢出率高達81.07%，熟肉類中大腸桿菌的檢出率為40%左右。在分離的324株大腸桿菌中有49株檢測到一種及以上毒力基因；主要流行的毒力基因是eaeA和aggR，未檢測到est和bfpA基因。2011年檢出毒力基因eaeA、stx1A和hlyA（以eaeA為主），2012年檢出毒力基因eaeA、stx1A、hlyA、stx2A，aggR和eltA（以eaeA和aggR為主），2013年檢出毒力基因eaeA、hlyA、aggR和eltA（以eaeA和aggR為主）。說明成都市武侯區(qū)肉類食品中大腸桿菌的污染水平較高，反映出市場環(huán)境衛(wèi)生和管理較差的現(xiàn)狀。因次，應加大力度重視改善肉類食品的生產(chǎn)、儲存和分銷條件，預防大腸桿菌的污染。

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Investigation of Escherichia coli contamination and virulence genes in meat foods from Wuhou district of Chengdu city

SHI Hui，TANG Jun-ni，CHEN Juan*，LONG Hu，JIANG Mei，WANG Wen-ya
（College of Life Scinece&Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，China）

The contamination of Escherichia coli in meat foods of Chengdu city and virulent characteristics of isolated strains were investigated in this study，which could lay basis for preventing and controlling of E.coli contamination in food and guaranteeing food safety.Meat samples were collected from the supermarkets and retail markets located in Wuhou district of Chengdu city from 2011 to 2013.These samples were enriched and E.coli strains were isolated and identified.DNA of all the isolated strains were extracted and subjected to PCR detection for eight virulence genes（eaeA，stx1A，stx2A，hlyA，aggR，est，eltA and bfpA）.The detection rate of E.coli for raw meat samples was 81.07%，and the detection rate of E.coli for cooked meat samples was 40%. 49 strains were detected to having more than one virulence genes from 324 isolated E.coli strains.The main prevalent virulence genes were eaeA and aggR，while est and bfpA genes could not be detected.The contamination of E.coli in meat samples was found to be very high.These results would provide significant data for the control and survey of foodborne E.coli in meat samples.

meat；Escherichia coli；contamination；virulence gene

TS201.6

A

1002-0306（2015）22-0209-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.035

2015-05-04

史輝（1990-），男，碩士研究生，研究方向：食品質(zhì)量與安全，E-mail：823371756@qq.com。

*通訊作者：陳娟（1980-），女，博士，副研究員，研究方向：食品微生物與食品安全，E-mail：chenj1221@126.com。

2014年度教育部回國留學啟動項目；2014年度國家民委中青年英才培養(yǎng)計劃；西南民族大學研究生創(chuàng)新項目（CX2014SP263）。