朱伯強(qiáng) 符林春 張苗苗廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所，廣東 廣州 510405

中藥復(fù)方艾可清加味對艾滋病模型猴不同組織CD4分子表達(dá)量的干預(yù)作用

朱伯強(qiáng) 符林春*張苗苗
廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所，廣東 廣州 510405

目的:以艾滋病模型猴不同組織的CD4分子表達(dá)為靶點(diǎn)，比較艾滋病模型猴不同組織中CD4分子的表達(dá)，探討中藥復(fù)方艾可清加味對艾滋病模型猴不同組織CD4分子表達(dá)的影響。方法:通過標(biāo)準(zhǔn)方法建立艾滋病猴模型，分別設(shè)立正常對照組、模型對照組、中藥組和陽性藥物組。正常組不作任何處理，模型組給予生理鹽水灌胃，中藥組給予中藥復(fù)方煎劑灌胃，陽性藥物組給予替諾福韋皮下注射治療。治療結(jié)束后取材相關(guān)組織，用Western blot分析模型猴不同組織的CD4分子的表達(dá)。結(jié)果:艾滋病模型猴的胃、十二指腸、回腸、結(jié)腸、直腸、腸系膜淋巴結(jié)、脾、淺表淋巴結(jié)織組中CD4表達(dá)水平中藥組均數(shù)值與模型組比較分別高出11.69%、10.67%、54.55%、15.31%、27.36%、22.68%、2.11%、10.75%。結(jié)論:中藥復(fù)方可以有效調(diào)節(jié)艾滋病模型猴中不同組織的免疫情況，提升CD4的表達(dá)，改善免疫功能，對猴艾滋病有一定治療作用。

艾滋??；CD4分子；中國恒河猴；免疫印跡；中藥復(fù)方

艾滋病(AIDS)全稱為獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrome)，是人體感染人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)后，造成CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行性減少，引起細(xì)胞免疫功能嚴(yán)重缺陷，最后導(dǎo)致各種機(jī)會(huì)性感染、惡性腫瘤及中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性變的臨床綜合征，嚴(yán)重者可導(dǎo)致患者死亡，嚴(yán)重威脅人類健康[1-2]。人類免疫缺陷病毒(HIV)感染人體的機(jī)制中， HIV外膜gp120的第1受體是CD4分子，為HIV侵入CD4+T細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞等的關(guān)鍵。CD4分子與gp120結(jié)合后，gp120構(gòu)象發(fā)生變化，然后暴露第2受體CCR5、CXCR4的結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)而激活HI外膜gp41，并插入細(xì)胞膜，最終完成病毒包膜與宿主細(xì)胞膜的融合[3]。本文通過建立中國恒河猴艾滋病模型，在中醫(yī)理論指導(dǎo)下采用中藥復(fù)方艾可清加味進(jìn)行治療，研究不同組織中的CD4分子表達(dá)的情況及中藥干預(yù)情況下不同組織中CD4分子表達(dá)變化情況，以探討中藥改善艾滋病免疫功能的可能靶點(diǎn)和機(jī)制，為艾滋病的防治提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 動(dòng)物 中國產(chǎn)恒河猴16只，全部為雄性。體重4～7kg，猴齡3～5歲之間，由廣東靈長類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證編號：SCXK粵2009-0025。試驗(yàn)前經(jīng)血清學(xué)檢測SIV、猴逆轉(zhuǎn)錄D型病毒(SRV)、猴T淋巴細(xì)胞I型病毒(STLV-I)和B病毒抗體陰性，結(jié)核菌素陰性，痢疾菌素陰性。以蒸餾水及標(biāo)準(zhǔn)猴飼料喂飼于GLP認(rèn)證的靈長類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣東省靈長類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(文件編號: K09004-IACUC)，實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照廣東省靈長類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心標(biāo)準(zhǔn)操作/作業(yè)流程執(zhí)行，并按照K09004-IACUC文件中內(nèi)容給予相應(yīng)的動(dòng)物福利。

1.1.2 感染毒株與途徑 SIVmac239(中國科學(xué)院昆明動(dòng)物所鄭永唐博士饋贈(zèng))，5MID100(5個(gè)100%猴感染劑量)1ml靜脈注射。

1.1.3 藥物 在臨床觀察和艾滋病模型猴實(shí)驗(yàn)證實(shí)有效的艾可清復(fù)方[4-5]基礎(chǔ)上加味，具體組成如下：紅參10g，黃芪20g，白術(shù)15g，茯苓10g，當(dāng)歸10g，藿香10g，木香6g，葛根6g，虎杖15g，毛冬青15g，黃芩10g，紫草10g，淫羊藿15g，骨碎補(bǔ)10g，丹參15g，炮附子6 g，甘草6g，制成浸膏，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。替諾福韋注射夜(國藥準(zhǔn)字批號：GS-1278，吉利德科學(xué)公司)，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4 試劑 蛋白提取液(碧云天生物)；十二羥硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS，廣州浩瑪)；二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT，Sigma)；甘油(glycerol，廣州浩瑪)；丙烯酰胺(Acrylamide，Sigma)；N,N′-亞甲基丙烯酰胺(Bis-Acrylamide，Sigma)；四甲基乙二胺(tetramethylethylenediamine，TEMED，廣州浩瑪)；過硫酸銨(ammomium persulfate，AP，廣州化學(xué)試劑廠)；甘氨酸(Glycine，廣州浩瑪)；Tris堿(Trisbase，Sigma)；甲醇(methanol，廣州化學(xué)試劑廠)；吐溫-20(Tween-20，Sigma)；脫脂奶粉(BD)；PVDF膜(BIO RAD);內(nèi)參抗體(廣州浩瑪生物)；CD4分子一抗(Abcam公司)；HRP標(biāo)記二抗(武漢博士德)。

1.1.5 實(shí)驗(yàn)儀器 超聲細(xì)胞破碎儀(上海天呈科技有限公司)；垂直電泳儀及轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(BIO RAD)；射線攝影暗匣(5X7英寸，富士X光片，發(fā)光暗盒，廣州浩瑪生物)；脫色搖床(Rotomix 公司);SW-CJ-IFD 型單人單面凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；5810R型低溫超速離心機(jī)(德國EPPENDORE 公司)；JA1203 型電子天平(上海天平儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 艾滋病猴模型制作及分組給藥 健康中國恒河猴16 只，隨機(jī)分為正常對照組4只，艾滋病模型組12只。其中健康對照組不做任何處理，僅作為健康對照使用；艾滋病模型組以氯胺酮7mg/kg麻醉后經(jīng)靜脈接種SIVmac239病毒株5MID100(5個(gè)100%感染劑量)1ml制作模型，通過外周圍血病毒裁量和CD4+T淋巴細(xì)胞檢測確定造模是否成功。艾滋病模型組12只再分為3個(gè)亞組，其中模型組4只，給予生理鹽水灌胃；中藥組4 只，給予中藥制成懸浮液灌胃，給藥劑量為1g/(kg·d)(1g=13g生藥)；陽性藥物組4只，替諾福韋按照30mg/kg的劑量，1次/d，皮下注射于動(dòng)物背部；造模71d之后開始給藥，連續(xù)給藥8周，停藥觀察2周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，全部動(dòng)物以氯胺酮7mg/kg 麻醉后股動(dòng)脈放血處死，解剖后取胃、十二指腸、回腸、結(jié)腸、直腸、腸系膜淋巴結(jié)、脾、淺表淋巴結(jié)組織分管裝好，放入液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 Western 印跡分析 將組織加入組織裂解液，進(jìn)行組織蛋白定量；將定量裂解后的細(xì)胞樣品取100μl加入5X蛋白上樣緩沖液25μl,總上樣量為25μg總蛋白;將樣品放入沸水中8min使蛋白變性然后10000rpm離心5min;樣品處理好后即可進(jìn)行上樣，加樣量25μl；繼續(xù)電泳直至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部上方約0.5cm；將電泳結(jié)束后的膠片放入轉(zhuǎn)印緩沖液中，將轉(zhuǎn)印膜也放入轉(zhuǎn)印緩沖液中浸潤，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜；封閉完畢后用PBST洗膜5次，每次間隔5min；加一抗，反應(yīng)1.5h，洗膜5次每次間隔5min；加辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，按說明書要求的稀釋比例加入，反應(yīng)1h，洗膜5次每次間隔5min；取ECL熒光底物(貨號：37071，Pierce公司)A液和B液各1ml，混勻后，將PVDF膜浸泡其中，室溫孵育3～5min后，用濾紙將PVDF膜表面液體擦干，并將其置于暗室，取醫(yī)用X光底片覆蓋，曝光1min后，依次顯影、定影即可。以GAPDH (甘油醛-3-磷酸脫氫酶)作為內(nèi)參。電泳條帶經(jīng)Image J 軟件處理，分析各實(shí)驗(yàn)組條帶與對照組條帶面積、灰度比值。

3 結(jié)果

與正常對照組比較，模型組各組織的CD4 表達(dá)量均有下降，下降最多的是腸淋巴結(jié)組織25.33%，下降最少的為十二指腸組織5.06%，其中回腸組織下降23.26%；與模型組比較，中藥組CD4 表達(dá)量均有不同程度升高，升高最多為回腸組織，升高54.55%；同時(shí)陽性藥物組CD4表達(dá)量也有一定升高。說明中藥復(fù)方可以增加CD4的表達(dá)量，調(diào)理免疫功能，對艾滋病猴有一定治療作用。詳見表1。

表1 艾滋病模型猴不同組織中CD4分子表達(dá)情況(單位：灰度比值)

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，*P<0.05，與中藥組比較，ΔP<0.05。

4 討論

CD4分子是一類相對分子質(zhì)量約為55000的單鏈跨膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族，主要表達(dá)于部分T細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、某些B細(xì)胞和EB病毒轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞以及特定區(qū)域的腦細(xì)胞表面[3]。CD4分子能協(xié)助機(jī)體免疫系統(tǒng)進(jìn)行免疫防御、免疫自穩(wěn)和免疫監(jiān)視,與眾多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。CD4作為一種共受體分子，通過其胞外段與MHCⅡ、TCR相互作用，形成CD4-MHCⅡ-TCR復(fù)合物，介導(dǎo)特異性抗原呈遞；而其胞質(zhì)段則通過與酪氨酸激酶P56Lck的相互作用，介導(dǎo)抗原信號傳遞，最終激活CD4+T細(xì)胞，引發(fā)一系列的免疫應(yīng)答。另外，CD4自身的多聚化不僅促進(jìn)與MHCⅡ、TCR的相互作用，而且增強(qiáng)T細(xì)胞抗原識別的特異性和敏感性[6]。HIV病毒通過以CD4分子為第一受體，進(jìn)入細(xì)胞表面表達(dá)CD4分子的T細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、某些B細(xì)胞和EB病毒轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞以及特定區(qū)域的腦細(xì)胞，進(jìn)而破壞細(xì)胞，造成胞免疫功能嚴(yán)重缺陷，導(dǎo)致各種機(jī)會(huì)性感染、惡性腫瘤及中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性變的臨床綜合征。

艾滋病在中醫(yī)古典醫(yī)籍中并無此病名，根據(jù)其臨床表現(xiàn)的特點(diǎn)，多數(shù)醫(yī)家將其歸于“伏氣溫病”或者“虛勞”的范疇，其病機(jī)特點(diǎn)為本虛標(biāo)實(shí)[7]。本虛即為諸臟腑氣血陰陽虧虛，其中以脾腎虧虛為主，而標(biāo)實(shí)主要是熱毒邪氣互結(jié)。因此我們認(rèn)為，脾虛、腎、疫毒是艾滋病發(fā)病的主要原因，三者之間相互為患，形成邪毒傷正，正不勝邪，本虛標(biāo)實(shí)夾雜證。以此為據(jù)，擬用益氣健脾補(bǔ)腎、清熱解毒中藥復(fù)方治療本病。藥物由本研究所前期研究成果之一的艾可清[4-5]和傳統(tǒng)古方七味白術(shù)散組成。方中人參、黃芪補(bǔ)中益氣健脾，扶正以固本；藿香、木香、葛根斡旋中焦氣機(jī)，恢復(fù)脾胃升清降濁功能；虎杖、毛冬青、黃芩、紫草清熱解毒以治標(biāo)；淫羊藿、骨碎補(bǔ)、炮附子補(bǔ)腎溫命門之火，并且能溫煦脾土；丹參、當(dāng)歸補(bǔ)血活血，預(yù)防久病氣滯血瘀，甘草調(diào)和諸藥。免疫印跡結(jié)果顯示艾滋病模型猴的胃、十二指腸、回腸、結(jié)腸、直腸、腸系膜淋巴結(jié)、脾、淺表淋巴結(jié)織組中CD4表達(dá)水平中藥組均數(shù)值與模型組比較分別升高了11.69%、10.67%、54.55%、15.31%、27.36%、22.68%、2.11%、10.75%，升高最多為回腸組織，升高54.55%。綜上所述，當(dāng)SIV感染恒河猴發(fā)病后，CD4的表達(dá)量顯著減少，導(dǎo)致免疫功能低下。實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步表明，中藥復(fù)方艾可清加味可以提升CD4的表達(dá)，從而改善免疫功能，對猴艾滋病有一定治療作用。

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Intervention of traditional Chinese medicine Viagra flavored clear expre ssion of the CD4 molecule on monkeys with AIDS in different tissues

ZHU Bo-qiang FU Lin-chun*ZHANG Miao-miao

Tropical Medicine Institute;Guangzhou University of TCM，Guang dong Guang zhou 510405

Objective The monkey model of AIDS CD4 molecule expression in different tissues as a target, compare expression monkey model of AIDS CD4 molecules in different tissues to study the effects of traditional Chinese medicine monkey model of AIDS CD4 molecule expression in different tissues. Methods AIDS monkey model by standard methods, namely the establishment of the normal control group, model group, TCM group and positive drug group. Normal group without any treatment, the model group was given normal saline, TCM group were given traditional Chinese medicine decoction, positive drug tenofovir group was given subcutaneous treatment. Minutes after the end of treatment-related organizations drawn expression monkey model of CD4 molecules in different tissues analyzed by Western blot. Results AIDS model monkey stomach, duodenum, ileum, colon, rectum, mesenteric lymph nodes, spleen, lymph node tissue superficial group TCM group CD4 expression levels were higher than the value of the model group were 11.69%, 10.67%, 54.55%, 15.31%, 27.36%, 22.68%, 2.11%, 10.75%. Conclusion The traditional Chinese medicine can effectively regulate the immune monkey model of AIDS cases in different organizations, to enhance the expression of CD4, improve immune function, AIDS monkeys have some therapeutic effect.

AIDS；CD4 molecule；Chinese rhesus；immunoblotting；traditional Chinese medicine

國家自然基金項(xiàng)目(編號：81173436)。

朱伯強(qiáng)(1987-)，男，廣州中醫(yī)藥大學(xué)在讀碩士研究生。E-mail：gdtcm@qq.com

符林春(1957-)，男，研究員，博士生導(dǎo)師。E-mail：fulc01@126.com

R285.5

A

1007-8517(2015)10-0007-03

2015.02.27)