涂玉蓉 李美娣 武 力*

（廣州華農(nóng)大實驗獸藥有限公司 廣州 510642）

雞大腸桿菌病是嚴重危害養(yǎng)雞業(yè)的重要細菌性傳染病，規(guī)模養(yǎng)雞場細菌性疫病的發(fā)生以大腸桿菌為主。隨著我國養(yǎng)雞業(yè)的持續(xù)發(fā)展,特別是集約化程度的加深,雞大腸桿菌病的流行日趨嚴重,由于區(qū)域性差異較大、防治措施和手段相對薄弱,造成我國雞大腸桿菌病比國外更為復(fù)雜。該病血清型多樣、抗原性復(fù)雜、臨床癥狀和病理變化多變,不同品種、不同日齡的雞群均可發(fā)病,輕者可以引起雞群生產(chǎn)性能下降,重者導(dǎo)致發(fā)病雞大批死亡,尤其對雛雞危害更大。

該病在一些養(yǎng)殖場中仍嚴重發(fā)生，臨床上經(jīng)常使用大量的抗菌藥物，導(dǎo)致不斷出現(xiàn)耐藥大腸桿菌株，從而也不斷擴大了耐藥譜[1-2]；同時還加劇了抗菌藥物在畜禽體內(nèi)的殘留，不僅給養(yǎng)禽業(yè)的持續(xù)發(fā)展帶來潛在危害，還嚴重影響到食品安全，從而危及人類的身體健康。本文在廣東地區(qū)疑似患雞大腸桿菌病的病料中分離到“大腸桿菌”，對其進行分離鑒定和藥敏試驗，在此基礎(chǔ)上進行防治，并對廣東地區(qū)雞大腸桿菌病的綜合防制措施進行了探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源

從疑似發(fā)生雞大腸桿菌病的廣東雞場采集病料，臨床剖檢病死雞，發(fā)現(xiàn)有典型心包炎、肝周炎、氣囊炎或卵黃性腹膜炎等癥狀。

1.1.2 試劑

培養(yǎng)基：麥康凱培養(yǎng)基、LB 肉湯和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基為廣州環(huán)凱生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

葡萄糖、甘露糖、緩慢發(fā)酵蔗糖、果糖、乳糖、麥芽糖和尿素酶等微量細菌生化管均為北京陸橋技術(shù)有限責任公司產(chǎn)品。

藥敏紙片：頭孢他啶（CAZ）、鏈霉素（STR）、環(huán)丙沙星（CIP）、阿莫西林(AMX)、四環(huán)素（TCY）、替米考星(TIL)和氟苯尼考(FFC)均為杭州天和生物制品科技有限公司產(chǎn)品。

其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病原的分離培養(yǎng)

將接種環(huán)在酒精燈上煅燒消毒，待接種環(huán)冷卻后，采集病（死）雞心、肝、脾、肺及卵黃液，無菌操作劃線接種于麥康凱瓊脂平板上，于37℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24h，觀察結(jié)果；挑取疑似大腸桿菌的單個菌落進一步純化培養(yǎng)。

1.2.2 形態(tài)學(xué)鑒定：染色鏡檢

將疑似菌株進行涂片和革蘭氏染色程序染色，并觀察顯微鏡下的細菌形態(tài)。

1.2.3 生化試驗鑒定

選取在麥康凱瓊脂上長出的磚紅色菌落分別作V-P、三糖鐵試驗、各種糖發(fā)酵試驗、吲哚試驗、尿素酶試驗和MR 試驗。

1.2.4 致病性試驗

將分離到的大腸桿菌接種于肉湯培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24h，按比濁計數(shù)法計數(shù)，配制成菌濃度為1×109cfu/mL 的菌液。給每組9 只雛雞進行腹腔注射菌液0.2mL。對照組9 只注射滅菌肉湯0.2mL。攻毒后，觀察雛雞狀態(tài)，記錄精神、行為、健康和死亡情況及數(shù)據(jù)，并及時剖檢死亡雞，分離細菌。判定標準：能使試驗雞在24 h 內(nèi)全部死亡或在48 h 內(nèi)死亡2/3 以上的菌株作為致病菌株。

1.2.5 藥物敏感性試驗

按照國外常用的Kirby－Bauer 法（簡稱K-B 法）進行。在無菌的條件下，將鑒定為雞大腸桿菌的純培養(yǎng)物接種于LB 肉湯中，置于37℃溫箱中培養(yǎng)24 h，稀釋菌液至0.5 標準麥氏比濁管，用滅菌棉簽蘸取稀釋過的菌液并擠去多余的液體，在MHA 平板上均勻涂布，蓋上平板，置室溫數(shù)分鐘至培養(yǎng)基的表面無明顯液體，用無菌小鑷子夾取藥敏紙片平貼于瓊脂平板表面，然后翻轉(zhuǎn)倒置于37℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，測量抑菌環(huán)直徑并判定結(jié)果。

本試驗所選用的藥敏紙片有：頭孢他啶、鏈霉素、環(huán)丙沙星、阿莫西林、四環(huán)素、替米考星和氟苯尼考。把抑菌圈直徑的大小作為敏感性的高低，采用WHO 質(zhì)控標準菌的敏感性及抑菌圈大小劃分方法報告結(jié)果，即敏感、中度敏感和耐藥。藥敏紙片種類及判定標準見表1。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離培養(yǎng)結(jié)果

在麥康凱瓊脂上形成紅色、圓形隆起、光滑濕潤、邊緣整齊、直徑為1.5～2.5mm 的小菌落。

2.2 染色鏡檢結(jié)果

涂片并染色后顯微鏡下可見大多數(shù)分散排列，偶爾有2～3 個連在一起，兩端鈍圓，兩端濃染的革蘭氏陰性短桿菌。

2.3 生化試驗結(jié)果

分離獲得的4 株疑似大腸桿菌生化試驗結(jié)果顯示:均能發(fā)酵葡萄糖、甘露糖，緩慢發(fā)酵蔗糖果糖、乳糖、麥芽糖,產(chǎn)酸、產(chǎn)氣或是不產(chǎn)氣。MR 試驗陽性，三糖鐵底層產(chǎn)酸，V-P 試驗陰性，尿素酶試驗陰性，產(chǎn)生靛基質(zhì)，詳見表2，其結(jié)果符合大腸桿菌的生化特性。

2.4 致病性試驗結(jié)果

大部分雛雞6h 以后開始出現(xiàn)癥狀，表現(xiàn)精神沉郁，食欲下降，多數(shù)出現(xiàn)腹瀉，有的出現(xiàn)神經(jīng)癥狀。接種12 h 后開始出現(xiàn)死亡。剖檢死亡雞，表現(xiàn)為典型大腸桿菌病病變，并且從死亡雞病變組織均能回收到相應(yīng)接種致病菌株。

2.5 藥敏試驗結(jié)果

試驗結(jié)果顯示，分離菌株對頭孢拉定、環(huán)丙沙星、替米考星和氟苯尼考等藥物敏感，對鏈霉素、阿莫西林和四環(huán)素耐藥，詳見表3。

3 討論

本試驗從廣東地區(qū)疑似患雞大腸桿菌病的病料中分離到疑似細菌，進行了細菌形態(tài)觀察、培養(yǎng)特性和生化特性鑒定，證實為大腸桿菌，且分離的大多數(shù)菌株為致病性大腸桿菌。藥物敏感試驗結(jié)果表明，分離菌株對頭孢拉定、環(huán)丙沙星、替米考星和氟苯尼考等藥物敏感,對鏈霉素、阿莫西林和四環(huán)素耐藥。試驗證明藥敏試驗結(jié)果與臨床治療應(yīng)用效果不盡相同,藥敏試驗可作為臨床治療大腸桿菌病選藥的重要依據(jù),但不能據(jù)此不加選擇地盲目投藥。在生產(chǎn)當中用藥不規(guī)范、療程不當或是長期使用同一類藥物或長期在飼料、飲水中加入預(yù)防性用藥，均可促使細菌產(chǎn)生抗藥性[4-5]。本文雞大腸桿菌的分離和鑒定為廣東地區(qū)大腸桿菌的流行病學(xué)打下了基礎(chǔ)，對分離菌株進行的耐藥性試驗為臨床治療提供了依據(jù)，為廣東地區(qū)雞大腸桿菌病的防治積累了經(jīng)驗，并具有一定的指導(dǎo)意義。

表1 藥敏紙片種類及判定標準（mm）

表2 生化反應(yīng)結(jié)果

表3 藥敏試驗結(jié)果（mm）

另外，尚應(yīng)當注意，即使經(jīng)藥敏試驗篩選出了一些敏感藥物用于臨床雞大腸桿菌的防控，表面上效果并不見得理想，此時，一要考慮是否混合感染雞沙門氏菌等其他病原[6-7]，二要注意藥物體外與體內(nèi)作用環(huán)境不同等問題，在實際用藥選擇上應(yīng)作科學(xué)、全面的考慮。

[1] 張曉紅. 雞大腸桿菌的分離鑒定與藥敏試驗[J]. 中國動物檢疫,2013,30(1):65-66.

[2] 張遂平,楊建奮,邵艷華.雞大腸桿菌分離及藥敏試驗研究[J].中國畜牧業(yè),2013(2):62-63.

[3] 鄒玲,任慧英.雞大腸桿菌病病原的分離鑒定及藥敏試驗[J].中國畜牧獸醫(yī),2007,34(2):119-121.

[4] 劉桂榮. 雞大腸桿菌病的流行狀況與防治[J].家禽科學(xué),2007(6):28-29.

[5] 劉娣琴,楊紅梅,賈志江.雞大腸桿菌病的防制誤區(qū)與對策[J].畜牧獸醫(yī)雜志,2012,31(5):89-89.

[6] 雷崇良.雞沙門菌、大腸桿菌和傳支混合感染的診治[J].中國家禽,2004,26(6):24.

[7] Cabrera R,Ruiz J,Marco F, et al.Mechanism of resisitance to several antimicrobial agents in Salmonella clinnical isolates causing traveler’s diarrhea [J].Antimicrob Agents Chemothe,2004,48(10):3934-3939.