柴孟龍，魏 巍，何長(zhǎng)久，王 軍，衛(wèi)喜明，張洪濤，陳 洋，劉大森，呂文發(fā)* ，劉國(guó)世*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130118;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，北京100193;3.黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，黑龍江 哈爾濱150090;4.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150030)

原核胚顯微注射是當(dāng)前生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物最可靠、最常用的方法。有研究表明，原核胚期進(jìn)行外源DNA 注射的融合效率要顯著高于2 ～4 細(xì)胞期胚胎［1］。因此，應(yīng)用原核胚顯微注射生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物就需要大量同步發(fā)育的原核胚，如果單靠動(dòng)物自身排卵，不但產(chǎn)生的胚胎少、質(zhì)量不穩(wěn)定且難以保持同步性。因而開(kāi)展胚胎移植，探索建立高效的原核胚生產(chǎn)技術(shù)體系就顯得尤為重要。

黑薩?？司d羊具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益，開(kāi)展轉(zhuǎn)基因定向培育可充分發(fā)揮優(yōu)秀母羊在品種改良和群體擴(kuò)繁中的潛力，使優(yōu)秀基因高效地保留和遺傳下去［2，3］，有效縮短繁殖時(shí)間，快速擴(kuò)大種群規(guī)模。為了提高黑薩?？司d羊體內(nèi)原核胚生產(chǎn)效率，本試驗(yàn)研究了不同F(xiàn)SH 劑量、不同超排方法、不同授精方式及不同季節(jié)對(duì)超排效果的影響，以期為生產(chǎn)足夠數(shù)量的高質(zhì)量原核胚摸索出一套切實(shí)可行的方案。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及藥品

1.1.1 試驗(yàn)用羊

無(wú)繁殖疾病、體重在65 ～82 kg 的經(jīng)產(chǎn)母羊作供體;膘情良好、無(wú)繁殖疾病的1 ～5 歲母羊作受體。采精用純種公羊，精液品質(zhì)檢測(cè)優(yōu)良。

1.1.2 藥品與試劑

促卵泡素(FSH)、促黃體素(LH)、孕馬血清促性腺激素(PMSG):寧波三生藥業(yè)有限公司生產(chǎn);陰道栓(CIDR):新西蘭產(chǎn)EAZI- BREED-CIDR，20 個(gè)/袋;氯前列烯醇(PG):上海計(jì)劃生育研究所產(chǎn);Holding 培養(yǎng)液:新西蘭生產(chǎn)，50 mL/袋;酒精、碘酒、新潔爾滅、抗生素、生理鹽水、青霉素、鏈霉素等為國(guó)產(chǎn)。

1.1.3 設(shè)備及器械

沖卵管、細(xì)菌濾器、移植槍、實(shí)體顯微鏡、恒溫臺(tái)等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 供體羊超排處理和配種

CIDR+FSH+PMSG 4 天8 針注射法:黑薩?？斯w羊發(fā)情周期內(nèi)任意一天陰道植入CIDR，至第10 天注射FSH，劑量遞減，第13 天時(shí)取出CIDR，注射PMSG。供體羊在停止注射激素后48 h內(nèi)發(fā)情，公羊試情至不接受交配為止，并注射LH 110 IU/只。

CIDR+FSH+PG 4 天8 針注射法:方法同上，只將注射PMSG 改為注射PG。

采用兩種輸精方式，第1 組:開(kāi)膣器輸精輔以自然交配;第2 組:腹腔內(nèi)窺鏡輸精。人工采集種公羊精液，鏡檢，活力達(dá)0.6 以上方可用于人工輸精。

1.2.2 胚胎質(zhì)量鑒定

配種后第5 天手術(shù)法從子宮角沖卵，在40 倍體式顯微鏡下根據(jù)受精卵的形態(tài)、色澤、分裂球的大小和數(shù)量、均勻度、細(xì)胞的密度等，及變化情況確定受精卵發(fā)育期、未受精卵以及胚胎發(fā)育階段。

1.2.3 受體處理與腹腔內(nèi)窺鏡法胚胎移植

使用CIDR + PMSG 法，與供體羊同步埋植CIDR，在供體羊撤栓前一段時(shí)間撤除CIDR，注射PMSG。公羊試情，記錄發(fā)情時(shí)間。

采用腹部手術(shù)法處理受體羊，腹腔內(nèi)窺鏡觀察，單側(cè)卵巢1 ～3 個(gè)黃體可用于移植。

1.2.4 供受體羊術(shù)后處理

供受體羊術(shù)后在小圈內(nèi)觀察1 ～2 d，圈舍應(yīng)保持清潔干燥以防感染，保證術(shù)后恢復(fù)良好。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

使用Spss18.0 軟件對(duì)超排供體黃體數(shù)、可用胚胎數(shù)分別進(jìn)行x2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 FSH 劑量對(duì)超排效果的影響

CIDR+FSH +PMSG 方案處理的20 只黑薩?？斯w綿羊，在體重相近情況下，按FSH 的注射劑量分為180 ～240 IU 組、260 ～320 IU 組兩組(見(jiàn)表1)。試驗(yàn)結(jié)果表明，180 ～240 IU 組平均黃體數(shù)(15.87 個(gè)/只)、平均獲卵數(shù)(12.78 枚/只)、平均可用胚胎數(shù)(13.88 枚/只)、移植妊娠率(75.00%)均高于另一組(P ＜0.05)。

2.2 不同方法對(duì)超排效果的影響

通過(guò)對(duì)CIDR+FSH+PMSG 4 天8 針注射法和CIDR+FSH + PG 4 天8 針注射法方案比較發(fā)現(xiàn)，前者在平均黃體數(shù)(15.00 個(gè)/只)、平均沖卵數(shù)(14.06 枚/只)、平均可用胚數(shù)(13.80/只)和移植妊娠率(71.43%)方面均高于CIDR + FSH + PG 4天8 針劑法(P ＜0.05)(見(jiàn)表1)。

2.3 不同授精方式對(duì)超排效果的影響

表3 所示，對(duì)黑薩?？斯w采用開(kāi)膣器輸精結(jié)合自然交配、腹腔內(nèi)窺鏡輸精兩種配種方式比較發(fā)現(xiàn)，腹腔內(nèi)窺鏡輸精法供體沖出卵子受精率94.62%、平均可用胚數(shù)(10.66 枚/只)高于開(kāi)膣器輸精+自然交配的配種方式(P ＜0.05)。

2.4 繁殖與非繁殖季節(jié)比較對(duì)超排效果的影響

春季、秋季(間隔6 個(gè)月)兩次超排結(jié)果對(duì)比發(fā)現(xiàn)，繁殖季節(jié)秋季平均黃體數(shù)(12.00 個(gè)/只)、平均沖卵數(shù)(11.35 枚/只)、可用胚數(shù)(10.76 枚/只)高于春季的效果，秋季胚胎移植妊娠率59.15% 極顯著高于春季妊娠率38.15% (P ＜0.01)。

表1 不同F(xiàn)SH 劑量對(duì)黑薩?？司d羊超排效果的影響

表2 黑薩福克不同超排方案的比較

表3 不同授精方式對(duì)黑薩?？司d羊超排效果的影響

表4 不同季節(jié)對(duì)薩?？司d羊超排效果的影響

3 討論

3.1 不同F(xiàn)SH 劑量對(duì)超排效果的影響

FSH 的使用劑量對(duì)綿羊超排效果有很大影響，外源FSH 可以解除優(yōu)勢(shì)卵泡對(duì)其它卵泡發(fā)育的抑制，在合適時(shí)間注射FSH，可獲得更多胚胎［4］。國(guó)內(nèi)有報(bào)道薩?？搜?，F(xiàn)SH 劑量區(qū)間126 ～150 IU。本試驗(yàn)在體重相近的情況下，按FSH 劑量設(shè)定為180 ～240 IU 組、260 ～320 IU 組。結(jié)果表明，180～240 IU 組效果較好，說(shuō)明FSH 注射劑量有一個(gè)相對(duì)固定的參考范圍，在合理區(qū)間內(nèi)相同來(lái)源的激素超排效果隨劑量上升而有增大趨勢(shì)，過(guò)低過(guò)高都不利于超排。

3.2 不同超排方法對(duì)超排效果的影響

孕酮栓埋植天數(shù)會(huì)對(duì)綿羊發(fā)情排卵產(chǎn)生影響［5］，同時(shí)個(gè)體差異導(dǎo)致卵巢對(duì)外源激素也會(huì)產(chǎn)生不同反應(yīng)，誘導(dǎo)分泌的雌激素水平的不同使卵泡群產(chǎn)生多種動(dòng)態(tài)變化［6，7］。孕酮栓中的孕酮會(huì)提高血液孕酮濃度，從而抑制LH 和FSH 的釋放，撤栓后孕酮水平降低刺激卵泡發(fā)育成熟形成了黃體。目前國(guó)內(nèi)羊只胚胎生產(chǎn)中，平均采集可用胚5 ～7枚［8～10］。本研究的兩個(gè)超排方案獲胚數(shù)與此前國(guó)內(nèi)報(bào)道接近，其中CIDR + FSH + PMSG 法較為理想，推測(cè)PMSG 作用平緩，卵巢體積不會(huì)劇烈增大，處理后的卵巢易于恢復(fù)，排卵率高，而注射PG 刺激較大，PG 劑量對(duì)黃體的發(fā)育有著極為重要的影響。

3.3 不同授精方式對(duì)超排效果的影響

Sayre 等(1997)和Ghalsasi 等(1996)對(duì)腹腔鏡與子宮頸輸精的效率進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)前者胚胎受精率高于后者［11］。Fair 等(2005)用內(nèi)窺鏡法對(duì)兩個(gè)品種的綿羊進(jìn)行了輸精，胚胎受精率相近，而用開(kāi)膣器輸精則差異顯著［12］。說(shuō)明品種對(duì)胚胎受精率不會(huì)產(chǎn)生影響。開(kāi)膣器輸精是目前羊場(chǎng)較為常用的方式，可子宮角輸精，易于掌握且精液可較少浪費(fèi)，提高配種效率。而腹腔鏡技術(shù)具有對(duì)母羊生殖器官損傷小、輸精位置精準(zhǔn)創(chuàng)傷小的優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)操作技術(shù)要求較高。內(nèi)窺鏡輸精法能夠提高受精率這一結(jié)論與國(guó)內(nèi)已有報(bào)道一致，在平時(shí)現(xiàn)場(chǎng)操作中，考慮到腹腔鏡技術(shù)要求、對(duì)羊只產(chǎn)生的應(yīng)激效應(yīng)及人工費(fèi)用，開(kāi)膣器輸精配合自然交配的輸精方式不失為一種較為經(jīng)濟(jì)易行的方式，但就超排效果而言，還是應(yīng)該采用腹腔鏡技術(shù)。

3.4 不同季節(jié)對(duì)超排效果的影響

有研究表明，非繁殖季節(jié)，胚胎受精失敗幾率較高［13］。本試驗(yàn)超排效果比較發(fā)現(xiàn)，在綿羊自然發(fā)情季節(jié)秋季的效果明顯好于春季，與張果平等［14］對(duì)無(wú)角陶賽特羊秋冬兩季的回收胚胎數(shù)顯著高于春季結(jié)果一致。但桑潤(rùn)滋等［15］對(duì)波爾山羊在春、夏、秋三個(gè)季節(jié)的超排效果卻沒(méi)有明顯變化，可能與品種間差異有關(guān)。重復(fù)超排可使優(yōu)秀種羊高效重復(fù)使用、提高優(yōu)質(zhì)種羊利用率、有效降低成本。但手術(shù)常造成供體的生殖器官粘連。為保證超排效果，應(yīng)當(dāng)適當(dāng)延長(zhǎng)羊只恢復(fù)時(shí)間，同時(shí)盡量術(shù)中減少出血及加強(qiáng)術(shù)后防粘連藥物的使用和消毒處置。多次重復(fù)超排沖卵，盡管存在生殖器官粘連現(xiàn)象，但如果手術(shù)次數(shù)保證在3 次以內(nèi)并不會(huì)影響正常的繁殖機(jī)能，這對(duì)獲得較好的超排效果，對(duì)充分利用優(yōu)秀種綿羊、降低原核胚生產(chǎn)成本具有十分重要的意義。

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