代艷艷　廖秋萍　賈桂珍　等

摘要：為了克隆及鑒定新疆南疆地區(qū)微小牛蜱Bm86基因，參照GenBank登錄的微小牛蜱Bm86基因序列，設(shè)計了可以擴增Bm86基因完整閱讀框架的引物，對微小牛蜱進行總RNA提取、RT-PCR、克隆、測序、序列分析。結(jié)果表明，獲得的Bm86基因長1 953 bp，與GenBank中登錄號為M29321、HQ014398的微小牛蜱Bm86基因核苷酸同源性分別為99%、97%，且為一個完整的開放閱讀框架。本研究獲得的微小牛蜱Bm86基因，為獲得基因工程疫苗的候選抗原及中國抗微小牛蜱疫苗制備奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：南疆；微小牛蜱；Bm86基因；克隆

中圖分類號： S852.74+6文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）01-0024-03

收稿日期：2014-02-21

基金項目：新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團博士資金（編號：2012BB023）；塔里木大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃（編號：2013107570030）。

作者簡介：代艷艷（1994—），女，河南鹿邑人，研究方向為動物傳染病與免疫病理學(xué)。E-mail：2275781936@qq.com。

通信作者：趙麗，博士，副教授，主要從事動物疫病研究。E-mail：zhaolidky@126.com。微小牛蜱為典型的一宿主蜱，是我國分布最廣的一個種[1]，屬于蜱類最常見、危害最大的硬蜱科扇頭蜱亞科扇頭蜱屬[2]。該蜱主要生活于農(nóng)區(qū)，在新疆喀什及周邊地區(qū)多見。該蜱主要寄生于牛，也常寄生于其他家畜和野生動物，也侵襲人類?？梢饎游镓氀?、消瘦、發(fā)育不良、產(chǎn)乳量下降或肢體麻痹，更重要的是感染動物免疫抑制，使蜱更易于存活或傳播疾病。在我國，微小牛蜱是其他許多寄生蟲的傳播媒介和傳播者，也能自然感染一些人畜共患病等[3]。因此做好微小牛蜱及其蜱傳病的防治工作，對新疆乃至全國畜牧業(yè)健康發(fā)展意義重大。

微小牛蜱Bm86是Willadsen等[4-5]從半飽血微小牛蜱雌蜱腸道分離的一種膜結(jié)合糖蛋白，是一種較好的保護性抗原。Penichet等證實，Bm86抗原在不同株的微小牛蜱腸道細胞膜上均存在，重組Bm86表達產(chǎn)物對抗藥性微小牛蜱也有免疫抵抗作用[6]。García-García等研究發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌中Bm86基因表達的產(chǎn)物為融合蛋白包涵體，用該包涵體免疫的牛對微小牛蜱具有明顯的抵抗力[7]。李文卉等將Bm86基因進行真核表達獲得了其重組蛋白[8]；樊瑞泉等[9]、馬米玲等[10]將Bm86基因克隆到原核表達載體pGEX-4T-1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后得到能被兔抗微小牛蜱全蜱陽性血清所識別的包涵體。

蜱的防治已成為國內(nèi)外畜牧業(yè)發(fā)展迫切須要解決的課題，傳統(tǒng)蜱防治方法造成的環(huán)境污染、食品安全、藥物殘留、抗藥性等問題日趨嚴重。免疫防治可使宿主增強免疫力，針對性地消滅特定蜱種，污染極低，有利于環(huán)境保護和人類健康，最主要的是可使易感動物具有一定抵抗力，有助于蜱種群和蜱傳病的控制[11-12]，是有效防治蜱及蜱傳病的一個研究方向。抗蜱疫苗在蜱類防治中具有很大的潛力，比傳統(tǒng)化學(xué)防治更有應(yīng)用前景。目前，以基因工程手段研制疫苗是抗蜱疫苗的主要方向[13]?？跪缫呙绲某晒ρ兄?，首先在于調(diào)節(jié)其生理作用的有效功能性抗原的鑒定、識別及作為高效重組體的表達。本研究針對新疆南疆地區(qū)優(yōu)勢蜱種微小牛蜱，對其Bm86基因完整閱讀框架進行克隆，以期為后續(xù)該基因的表達、免疫抗原制備和抗微小牛蜱疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1微小牛蜱采自喀什地區(qū)牛和阿克蘇地區(qū)羊。

1.1.2菌種和主要試劑宿主菌E.coli DH5α由筆者所在實驗室保存。Trizol invitrogenTM（Code No.：15596-026），購自Invitrogen生物工程有限公司；TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0（Code No.：DRR019A），Premix TaqTM Version 2.0（Code No.：D331A）購自寶生物工程（大連）有限公司；TIANgel Midi Purification Kit（Code No.：DP209）、TIANprep Mini Plasmid Kit（Code No.：DP103）、pGM-T克隆試劑盒（Code No.：VT202）、D2000 DNA Marker（Code No.：MD114）均購自天根生化科技（北京）有限公司；IPTG、X-Gal、Gold view、6×Loading Buffer、氨芐青霉素、無水氯化鈣、氯仿、無水乙醇等試劑，均購自北京金泰博達生物科技有限公司。

1.1.3引物按照引物設(shè)計原則，利用Primer Premier 5.0分子生物學(xué)軟件，以GenBank數(shù)據(jù)庫中微小牛蜱Bm86基因全序列為模板，設(shè)計擴增Bm86基因完整閱讀框架的特異性引物，P1：5′-ATGCGTGGCATCGCTTTGTTCG-3′，P2：5′-TTACAACGATGCTGCGGTGACTG-3′，預(yù)期擴增大小為1 953 bp，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.1.4儀器PCR儀（TC-5000，Bibby scientific Ltd）、小型高速冷凍離心機（R134a，Hermetically sealed refigeration system）、電泳儀（DYY-12，北京市六一儀器廠）、紫外分析儀（JY02S，北京君意東方電泳儀設(shè)備有限公司）等。

1.2方法

1.2.1總RNA提取以微小牛蜱為材料，按Trizol invitrogenTM試劑盒說明書提取總RNA。

1.2.2RT-PCR反應(yīng)總RNA按照TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0試劑盒，利用已設(shè)計的特異性引物P1、P2擴增Bm86基因，退火溫度58 ℃。

1.2.3PCR產(chǎn)物純化回收取Bm86基因RT-PCR擴增產(chǎn)物電泳切膠后，按照TIANgel Midi Purification Kit試劑盒說明進行回收純化。

1.2.4純化產(chǎn)物連接T載體膠回收純化的目的Bm86基因產(chǎn)物，按照pGM-T克隆試劑盒說明操作與pGM-T載體連接。

1.2.5DH5α感受態(tài)細胞制備DH5α受體菌，37 ℃培養(yǎng)收集菌液，采用CaCl2法制備DH5α感受態(tài)細胞，新鮮即可使用，或-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞、鑒定、搖菌提取質(zhì)粒及測序?qū)⑦B接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化自制的DH5α感受態(tài)細胞進行藍白斑篩選。白色菌落按照Premix TaqTM Version 2.0試劑盒說明，利用自行設(shè)計的P1、P2引物進行菌落PCR鑒定；挑取PCR陽性菌落接種液體培養(yǎng)基搖菌，按照TIANprep Mini Plasmid Kit試劑盒說明提取質(zhì)粒DNA，標記后送生工生物工程（上海）有限公司測序，測序引物為T7。保存陽性菌和質(zhì)粒。

1.2.7序列分析測序結(jié)果用BLAST在線平臺分析與其核苷酸同源性最高的序列。

2結(jié)果與分析

2.1Bm86基因RT-PCR擴增

以微小牛蜱為材料提取總RNA，一步法RT-PCR反應(yīng)，擴增出大小約1 953 bp的特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（圖1）。

2.2菌落PCR鑒定

挑取7個白色菌落，利用P1、P2引物進行PCR鑒定，結(jié)果均為陽性（圖2）。

2.3測序分析

將微小牛蜱經(jīng)RT-PCR、克隆、測序所得Bm86基因序列，長度為1 953 bp。利用BLAST在線平臺分析，顯示與其核苷酸同源性較高的前2個序列GenBank登錄號為M29321、HQ014398，核苷酸同源性分別是99%（1 926/1 953 bp）、97%（1 901 bp/1 953 bp），已登錄的這2個序列基因均來源于微小牛蜱。本研究測序得到的序列為一個完整開放閱讀框架。測得Bm86基因序列見圖3。

3結(jié)論與討論

微小牛蜱Bm86是Willadsen等[4-5]從半飽血微小牛蜱雌蜱腸道分離的一種膜結(jié)合糖蛋白，是一種較好的保護性抗原。當微小牛蜱吸食用其免疫的牛血液時，血液中的抗體與蜱腸道表面相應(yīng)糖蛋白結(jié)合，從而使蜱腸道受到嚴重損傷，當牛血

液滲入蜱血淋巴后，能進一步引起蜱的大規(guī)模死亡以及繁殖、生存能力下降等。本研究從新疆南疆地區(qū)微小牛蜱體內(nèi)成功克隆了Bm86基因，長度為1 953 bp，與預(yù)期一致，為一個完整的開放閱讀框架，其核苷酸序列與GenBank中登錄號為M29321、HQ014398的微小牛蜱Bm86基因核苷酸同源性分別為99%、97%，說明該基因也存在于我國微小牛蜱體內(nèi)。

雖然已證實Bm86基因?qū)ξ⑿∨ｒ缑庖弑Ｗo作用良好，但天然Bm86基因抗原在微小牛蜱體內(nèi)含量少，難以獲得，所以Bm86基因重組蛋白的獲得及其是否具備免疫原性至關(guān)重要。國內(nèi)外許多學(xué)者利用原核表達和真核表達系統(tǒng)對其進行了表達[7-10]。但基因表達水平與許多因素有關(guān)，筆者擬用含有CMV強啟動子和增強子的pVAXl高效真核表達載體對其進行表達，構(gòu)建DNA疫苗。因此，獲得一個完整閱讀框架的Bm86基因至關(guān)重要，本研究中Bm86基因的獲得、測序、鑒定工作已完成，且基因變異小，序列保守，適合作為基因工程疫苗的候選抗原，對制備抗微小牛蜱疫苗具有重要價值。

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