唐探　姜永雷　張瑛　等

摘要：選擇原生長(zhǎng)狀況基本相同的云南樟半年生實(shí)生幼苗為研究材料，進(jìn)行在不同濃度的鉛、鎘溶液澆灌下云南樟幼苗各項(xiàng)生理指標(biāo)（丙二醛含量、葉片抗氧化酶活性、可溶性蛋白及游離脯氨酸含量）的測(cè)定。結(jié)果表明：在不同濃度的Pb2+、Cd2+脅迫下，MDA的含量略高于或顯著高于對(duì)照，且總體呈上升的趨勢(shì)；隨著Pb2+、Cd2+處理濃度的增加，與對(duì)照組相比，SOD活性變化不顯著，POD活性表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì)；低濃度的Pb2+脅迫使得云南樟幼苗葉片內(nèi)的可溶性蛋白含量明顯減少，而在Cd2+脅迫下，其可溶性蛋白含量下降不明顯；脯氨酸含量總體呈上升趨勢(shì)；Pb2+、Cd2+對(duì)云南樟幼苗的毒害作用強(qiáng)度不同，在10 mmol/L的濃度下，Cd2+脅迫表現(xiàn)出更強(qiáng)的毒害作用。

關(guān)鍵詞：云南樟；鉛鎘；脅迫；生理特性

中圖分類(lèi)號(hào)： Q945.78文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）01-0199-03

收稿日期：2014-02-15

基金項(xiàng)目：“省部級(jí)重點(diǎn)學(xué)科、省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室及校實(shí)驗(yàn)室共享平臺(tái)”資助項(xiàng)目；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)面上項(xiàng)目（編號(hào)：2010ZC264）。

作者簡(jiǎn)介：唐探（1991—），男，江蘇句容人，碩士研究生，研究方向?yàn)椴铇?shù)資源。E-mail：tantan_1991@126.com。

通信作者：程小毛，博士，副教授，主要從事園林植物分子生物學(xué)研究。E-mail：30375713@qq.com。隨著全球經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，重金屬污染已經(jīng)成為一個(gè)嚴(yán)重的問(wèn)題。在植物方面，重金屬通過(guò)對(duì)植物生理生化過(guò)程的影響，如抑制葉綠素的生物合成，抑制各種參與植物生理生化過(guò)程的酶（如根系還原酶、各種氧化酶）以及影響蛋白質(zhì)的生物合成等[1]，導(dǎo)致植物生長(zhǎng)發(fā)育不良，甚至引起死亡。

云南樟有凈化有毒空氣的能力，有抗癌功效，能吸煙滯塵、涵養(yǎng)水源、固土防沙和美化環(huán)境，過(guò)濾出清新干凈的空氣，具有較大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和觀賞價(jià)值，因此云南樟成為南方許多城市和地區(qū)園林綠化的首選良木。但是目前關(guān)于云南樟在重金屬方面的研究，尤其在鉛、鎘脅迫方面的研究較少。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)健康、原生長(zhǎng)狀況基本相同的2年生云南樟實(shí)生幼苗進(jìn)行不同濃度的鉛、鎘溶液的處理，研究重金屬鉛、鎘處理下云南樟幼苗生理特性（包括其丙二醛含量、可溶性滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)變化及抗氧化酶活性等方面）的變化，以便更好地了解云南樟幼苗對(duì)重金屬脅迫的響應(yīng)機(jī)制，為云南樟的擴(kuò)大栽培及園林應(yīng)用提供理論依據(jù)和科學(xué)指導(dǎo)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)選取云南樟（Cinnamomum glanduliferum）2年生實(shí)生苗為研究材料，選取健康并生長(zhǎng)一致的苗木于2012年8月15日移栽到5L塑料盆中，基質(zhì)為“紅土 ∶珍珠巖 ∶腐殖土=3 ∶3 ∶2”的混合基質(zhì)。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)共設(shè)5個(gè)組：對(duì)照CK，Pb2+處理A組，Pb2+處理B組，Cd2+處理A組，Cd2+處理B組。每組6盆，每盆1株。試驗(yàn)大棚內(nèi)白天溫度范圍為20～30 ℃，夜間溫度范圍為9～18 ℃，相對(duì)濕度為35%～80%。處理時(shí)間從2012年9月10日至10月10日，共1個(gè)月時(shí)間。所有指標(biāo)測(cè)定在處理結(jié)束時(shí)進(jìn)行，每株選取從上到下的第三至第五片完全展開(kāi)的葉作為生理生化指標(biāo)的測(cè)定樣品，每處理至少5株重復(fù)。

鉛脅迫處理：分別用5 mmol/L Pb（NO3）2溶液（Pb2+A組）和10 mmol/L Pb（NO3）2溶液（Pb2+B組）進(jìn)行處理，每處理10株，每株隔天均勻澆灌10 mL處理溶液，對(duì)照組用清水代替，再補(bǔ)充至水分充足。

鎘脅迫處理：分別用10 mmol/L CdCl2溶液（Cd2+A組）和20 mmol/L CdCl2溶液（Cd2+B組）進(jìn)行處理，每處理10株，每株隔天均勻澆灌10 mL處理溶液，對(duì)照組用清水代替，再補(bǔ)充至水分充足。

1.3測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1丙二醛含量的測(cè)定[2]葉片測(cè)定樣品約0.2 g，在 6 mL 10%三氯乙酸中研磨，然后以12 000 r/min離心10 min。取上清液2mL，再加入2 mL 0.6%硫代巴比妥酸，充分反應(yīng)后將裝有反應(yīng)液的試管置沸水浴30 min，然后在冰浴中迅速冷卻。然后在10 000 r/min下離10 min，取上清液用分光光度計(jì)（Unicam UV-330，USA）測(cè)定其在440、532、600 nm處的吸光度。

1.3.2抗氧化酶活性的測(cè)定取約0.2g材料于5mL提取緩沖溶液（50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液，pH值70，含1 mmol/L EDTA，體積分?jǐn)?shù)0.05% Triton X-100，20 g/L 不溶性聚乙烯吡咯烷酮）中研磨成勻漿。經(jīng)過(guò) 8 000 r/min 離心20 min，取上清液進(jìn)行酶活性測(cè)定。過(guò)氧化物酶（POD）：取約含100 μL的酶提取液加入3 mL酶反應(yīng)液中（50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4 緩沖溶液，pH值6.0，含 3 mmol/L 愈創(chuàng)木酚和2.5 mmol/L H2O2）中，充分混勻。于紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)上讀取470 nm處吸光光度值在 2 min 內(nèi)每2 s中的變化[3]。根據(jù)摩爾消光系數(shù) 39.4 mL/（mmol·cm），計(jì)算酶活性。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，EC1.15.1.1，SOD）：本試驗(yàn)依據(jù)超氧化物歧化酶抑制氮藍(lán)思唑（NBT）在光下的還原作用來(lái)確定酶活性大小[4]。在有氧化物質(zhì)存在下，核黃素可被光還原，被還原的核黃素在有氧條件下極易再氧化而產(chǎn)生氧負(fù)離子，氧負(fù)離子可將氮藍(lán)四唑還原為藍(lán)色的甲腙，后者在560 nm處有最大吸收。而SOD可清除氧負(fù)離子，從而抑制甲腙的形成。于是光還原反應(yīng)后，反應(yīng)液藍(lán)色愈深，說(shuō)明酶活性愈低，反之亦然。據(jù)此可以計(jì)算出酶活性大小。

1.3.3可溶性蛋白含量的測(cè)定以50 mmol/L磷酸緩沖溶液（pH值7.8）為提取液[其中含0.1 mmol/L EDTA及 20 g/L PVP]。稱(chēng)取0.2 g葉片，用液氮研磨后，加入5mL提取液，進(jìn)一步研磨成勻漿，離心10 min取上清液，加入G-250反應(yīng)后在595 nm處測(cè)吸光值，方法參照Bradford等的方法[5]。

1.3.4游離性脯氨酸含量的測(cè)定游離脯氨酸的測(cè)定采用Bates等的方法[6]。葉片樣品用3%的磺基水楊酸提取，勻漿在 8 000 r/min 離心10 min，上清液用于游離脯氨酸的測(cè)定。測(cè)定反應(yīng)液包括2 mL提取液、2 mL冰醋酸和2 mL茚三酮，沸水浴60 min后在冰盒中終止反應(yīng)。然后加入4 mL甲苯劇烈振蕩以提取生成的有色產(chǎn)物，取上層有機(jī)層測(cè)定其在 520 nm 處的吸光度。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)用L-脯氨酸制作。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

所有的數(shù)據(jù)分析都利用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行一元方差分析（one-way ANOVA），平均數(shù)間的多重比較采用Ducans檢驗(yàn)方法。P<0.05時(shí)差異顯著。

2結(jié)果與分析

2.1鉛、鎘脅迫對(duì)丙二醛（MDA）的影響

MDA是膜脂過(guò)氧化作用的最終產(chǎn)物，其含量是反映膜脂過(guò)氧化作用強(qiáng)弱和質(zhì)膜受破壞程度的重要標(biāo)志。試驗(yàn)顯示（圖1），與對(duì)照組相比，Pb2+處理下的MDA含量總體呈上升趨勢(shì)，且Pb2+A處理組的MDA含量上升顯著；Cd2+脅迫下，云南樟幼苗中MDA含量隨著處理濃度的增加而呈上升的趨勢(shì)，且與對(duì)照組相比，Cd2+B處理組下的MDA含量上升顯著。

2.2鉛、鎘脅迫對(duì)葉片抗氧化酶活性的影響

試驗(yàn)顯示（表1），鉛、鎘脅迫對(duì)云南樟幼苗的葉片抗氧化酶活性的影響存在差異。與對(duì)照組相比，5 mmol/L Pb2+處理下的過(guò)氧化物酶（POD）活性上升了25.0%，隨著Pb2+脅迫濃度的進(jìn)一步增大，POD活性呈下降趨勢(shì)，10 mmol/L Pb2+處理下的POD活性相比5 mmol/L Pb2+處理下的POD活性下降顯著。與對(duì)照組相比，10 mmol/L Cd2+處理下的POD活性上升顯著，隨著Cd2+脅迫濃度的進(jìn)一步增大，POD活性顯著下降，20 mmol/L Cd2+處理下的POD活性相比對(duì)照組和10 mmol/L Cd2+處理下的POD活性分別下降了30.30%和40.92%。重金屬脅迫會(huì)引起超氧化物歧化酶（SOD）活性發(fā)生改變，但在本試驗(yàn)中Pb2+、Cd2+處理的SOD活性變化幅度較小。

表1鉛、鎘脅迫下超氧化物歧化酶和過(guò)氧化物酶活性的變化

處理組超氧化物歧化酶

（U/mg）過(guò)氧化物酶

[μmol/（min·mg）]CK727.46±18.02a1 860.90±101.66bPb2+A733.10±30.54a2 325.61±242.82cPb2+B718.31±26.22a1 771.30±133.53bCd2+A728.87±9.31a2 195.49±401.54bcCd2+B736.15±8.61a1 296.99±220.21aP0.818ns0.002**注：同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著，P<0.05。每個(gè)值代表5個(gè)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；下表同。

2.3鉛、鎘脅迫對(duì)葉片可溶性滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

2.3.1鉛、鎘脅迫對(duì)葉片可溶性蛋白含量的影響可溶性蛋白含量變化可以作為檢測(cè)植物葉片功能和衰老的一個(gè)指標(biāo)[7]。由圖2可以看出，在受到Pb2+脅迫時(shí)，云南樟幼苗葉片內(nèi)的可溶性蛋白含量顯著下降，且Pb2+A和Pb2+B處理組之間的可溶性蛋白含量差異顯著。在受到Cd2+脅迫時(shí)，可溶性蛋白含量下降不明顯。隨著Pb2+、Cd2+濃度的進(jìn)一步增大，云南樟幼苗可溶性蛋白含量變化不明顯。

2.3.2鉛、鎘脅迫對(duì)葉片脯氨酸含量的影響試驗(yàn)顯示（圖3），在Pb2+脅迫下，與對(duì)照組相比，Pb2+處理的云南樟幼苗葉片中脯氨酸含量總體呈上升趨勢(shì)，且Pb2+A處理組脯氨酸含量相比對(duì)照組上升明顯。在Cd2+脅迫下，隨著Cd2+濃度的增加，云南樟幼苗葉片中的脯氨酸含量均顯著上升。表明云南樟幼苗在受到Pb2+、Cd2+脅迫時(shí)，可以通過(guò)自身脯氨酸含量的積累提高細(xì)胞的滲透勢(shì)，并進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)以減少逆境脅迫下細(xì)胞組織的失水。

3結(jié)論與討論

MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物之一，其含量高低可以反映植物遭受逆境傷害的程度，含量越高，植物遭受到的傷害越大[8]。本試驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，不同濃度的Pb2+、Cd2+脅迫下，MDA的含量略高于或顯著高于對(duì)照，且總體呈上升的趨勢(shì)。這在覃勇榮等研究鎘脅迫下的桑樹(shù)幼苗葉片丙二醛含量動(dòng)態(tài)分析中有類(lèi)似報(bào)道[9]。說(shuō)明在Pb2+、Cd2+脅迫下，云南樟幼苗葉片細(xì)胞內(nèi)的活性氧增加，打破活性氧的代謝平衡，導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化嚴(yán)重，膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，使細(xì)胞受到傷害。

SOD是植物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)中的主要保護(hù)酶，能減少活性氧自由基對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)的傷害[10-12]。本試驗(yàn)中，隨著Pb2+、Cd2+處理濃度的增加，SOD活性變化不顯著。這在前人研究中有過(guò)類(lèi)似報(bào)道[13]。POD的主要作用是清除氧代謝中產(chǎn)生的H2O2，以及由此產(chǎn)生的有機(jī)過(guò)氧化物ROOH，在植物體內(nèi)抗氧化代謝中起重要作用[14]。本試驗(yàn)中，在Pb2+、Cd2+脅迫下，POD活性表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì)，這說(shuō)明當(dāng)POD活性隨著脅迫濃度的增大而上升時(shí)，植物通過(guò)提高保護(hù)酶的活性來(lái)清除體內(nèi)的自由基，當(dāng)脅迫濃度達(dá)到一定值時(shí)，POD活性開(kāi)始降低，這可能是由于其傷害程度超過(guò)了植株防御反應(yīng)的閾值，酶的結(jié)構(gòu)或合成受到破壞，從而使POD的活性喪失[15]。SOD和POD活性的差異也說(shuō)明了在逆境脅迫下不同抗氧化酶所起的作用及機(jī)制并不相同，而在本試驗(yàn)中，云南樟幼苗主要通過(guò)提高POD的活性來(lái)清除Pb2+、Cd2+脅迫下產(chǎn)生的自由基及緩解其膜脂過(guò)氧化作用。

可溶性蛋白是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。重金屬毒害能夠刺激蛋白酶的水解活性，使可溶性蛋白變性、降解，從而使酶參與的許多生理活動(dòng)紊亂[16]。在本試驗(yàn)中，低濃度的Pb2+脅迫使得云南樟幼苗葉片內(nèi)的可溶性蛋白含量明顯減少，而在Cd2+脅迫下，其可溶性蛋白含量下降不明顯，這可能是不同重金屬脅迫下，可溶性蛋白含量的變化趨勢(shì)不同，其原因有待于進(jìn)一步研究。脯氨酸含量是反映植物受逆境脅迫的重要指標(biāo)，對(duì)維持細(xì)胞水分平衡起著重要的作用，并具有清除活性氧的功能[16-18]。在本試驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，Pb2+、Cd2+脅迫下的脯氨酸含量總體呈上升趨勢(shì)，且Pb2+A、Cd2+A、Cd2+B處理組的脯氨酸含量顯著上升，這與崔大練等的研究結(jié)果[19]一致，說(shuō)明云南樟幼苗通過(guò)提高脯氨酸含量來(lái)提高細(xì)胞滲透勢(shì)，維持細(xì)胞水分平衡。此外，相同濃度下，Cd2+A處理組脯氨酸含量明顯高于Pb2+B處理組的含量，說(shuō)明此時(shí)Cd2+對(duì)植物的傷害更加嚴(yán)重，植物會(huì)產(chǎn)生更多的脯氨酸來(lái)耐受重金屬的傷害。

綜上所述，云南樟幼苗在Pb2+A處理下，所測(cè)的生理指標(biāo)大多數(shù)與對(duì)照差異顯著，而在Pb2+B處理下，所測(cè)的所有生理指標(biāo)與對(duì)照無(wú)明顯差異，分析低濃度的Pb2+脅迫下，是否對(duì)云南樟幼苗的生理指標(biāo)影響較大，而高濃度的Pb2+脅迫下對(duì)其生理指標(biāo)無(wú)明顯影響這一問(wèn)題仍有待進(jìn)一步研究。Cd2+脅迫下，與對(duì)照相比，Cd2+B處理組所測(cè)的生理指標(biāo)相對(duì)于Cd2+A處理組的生理指標(biāo)更加顯著，綜合各項(xiàng)指標(biāo)看出，高濃度的Cd2+脅迫對(duì)云南樟幼苗的傷害程度更大。而同一濃度的重金屬離子Pb2+、Cd2+對(duì)云南樟幼苗的脅迫程度也不同，在10 mmol/L的濃度下，Cd2+脅迫對(duì)云南樟幼苗的傷害更大。

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