Progress research on intracellular pathway and main barriers of cationic polymer－mediated gene therapy

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

［文章編號(hào)］1671－587Ⅹ（2015）01－0199－04

DOI：10.13481／j.1671－587x.20150139

［收稿日期］2014－03－29

［基金項(xiàng)目］國(guó)家自然科學(xué)基金資助課題（51201110）

［作者簡(jiǎn)介］王茹燕（1987－），女，寧夏回族自治區(qū)銀川市人，醫(yī)學(xué)碩士，主要從事陽(yáng)離子聚合物介導(dǎo)的基因治療方面的研究。

［通信作者］彭　琳，副教授，碩士研究生導(dǎo)師（Tel：028－85503571，E－mail：gaoendo＠163.com）

選擇合適的基因傳遞載體，使目的基因靶向、可控并有效地表達(dá)，是基因治療成功的關(guān)鍵。非病毒載體具有合成簡(jiǎn)單、可以攜帶大容量的遺傳物質(zhì)和無(wú)免疫原性等優(yōu)點(diǎn)而愈來(lái)愈受到研究者的重視 ［1－2］。其中陽(yáng)離子聚合物由于具有安全性高，免疫原性低，易于對(duì)DNA進(jìn)行操作，價(jià)格低，特別是其結(jié)構(gòu)易于改造等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基因治療研究 ［3－4］。但是較低的轉(zhuǎn)染效率和瞬時(shí)蛋白表達(dá)是此類(lèi)載體應(yīng)用的最大障礙。因此如何提高陽(yáng)離子聚合物的基因轉(zhuǎn)染效率成為目前非病毒基因傳遞體系研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一 ［5］。治療基因作用的發(fā)揮需要克服基因傳遞過(guò)程的各種障礙，才能獲得較高的轉(zhuǎn)染效率 ［6］。因此理解陽(yáng)離子聚合物傳遞DNA的途徑以及聚合復(fù)合物傳遞DNA過(guò)程中的主要障礙，有助于合理設(shè)計(jì)高分子基因傳遞載體，使其化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)符合基因傳遞過(guò)程中的不同要求 ［7］。

1　陽(yáng)離子聚合物介導(dǎo)的基因傳遞的胞外屏障

聚合復(fù)合物在達(dá)到靶器官或靶細(xì)胞之前必須經(jīng)歷和克服能夠使復(fù)合物轉(zhuǎn)染效率降低、復(fù)合物解離、引起DNA降解或復(fù)合物被清除的各種胞外屏障，包括血液循環(huán)過(guò)程中的屏障、組織中的屏障和其他屏障 ［8－9］。

1.1　血液循環(huán)中的屏障　在基因治療靜脈給藥時(shí)，聚合復(fù)合物首先必須經(jīng)過(guò)血液循環(huán)才能達(dá)到靶器官或靶細(xì)胞。血液中的成分主要引起聚合復(fù)合物的聚集和導(dǎo)致DNA提前從復(fù)合物中釋放出來(lái)，此外血漿中的核酸酶也能引起DNA的降解。這2個(gè)方面的作用均能使聚合復(fù)合物阻留或者使其轉(zhuǎn)染能力下降 ［6］。

聚合復(fù)合物的穩(wěn)定性取決于陽(yáng)離子聚合物的結(jié)構(gòu)和其與DNA的正負(fù)電荷的比。已知血漿中的紅細(xì)胞、白蛋白和纖維蛋白原等易與聚合復(fù)合物發(fā)生非特異性結(jié)合，使復(fù)合物的表面電位降低，減少粒子之間的靜電排斥力，最終導(dǎo)致復(fù)合物的聚集。過(guò)多的聚集還會(huì)引起復(fù)合物在血管壁上的沉積，血管組織內(nèi)包含的高濃度富含陰離子的黏多糖也能結(jié)合富含陽(yáng)離子的聚合復(fù)合物。有研究 ［10］發(fā)現(xiàn)：小鼠頸動(dòng)脈壁可結(jié)合相對(duì)分子質(zhì)量為84　000的聚賴(lài)氨酸（PLL）和聚酰胺胺樹(shù)狀物濃度達(dá)10g·L －1，且經(jīng)過(guò)4h的動(dòng)脈灌注也不會(huì)被洗脫。聚合復(fù)合物的聚集使聚合物不容易分散，降低了聚合物的轉(zhuǎn)染能力，另一方面這些聚合復(fù)合物聚集的結(jié)果是容易被巨噬細(xì)胞和網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)（reticuloendothelial system，RES）迅速清除，因而大大減少了聚合復(fù)合物進(jìn)入靶器官和接觸靶細(xì)胞的量。

1.2　組織中的屏障　聚合復(fù)合物經(jīng)靜脈應(yīng)用后，在血流中可產(chǎn)生成簇的多聚物，并隨血液循環(huán)到達(dá)全身各主要器官，大部分快速由肺內(nèi)皮細(xì)胞、肝竇中Kupper細(xì)胞及脾中的巨噬細(xì)胞清除。此外，機(jī)體的自然防御機(jī)制如補(bǔ)體系統(tǒng)、網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)都可清除外來(lái)粒子 ［11］。當(dāng)聚合復(fù)合物達(dá)到靶器官或靶細(xì)胞的周?chē)M織時(shí)，將同細(xì)胞外的一些物質(zhì)發(fā)生相互作用，增加的離子強(qiáng)度會(huì)削弱載體與DNA之間的相互作用。這些物質(zhì)包括細(xì)胞外基質(zhì)（如糖蛋白、硫酸軟骨素和膠原等）和黏膜分泌物（如透明質(zhì)酸和黏蛋白等），具體隨給藥方式不同而異。在細(xì)胞外環(huán)境中，聚合復(fù)合物應(yīng)該足夠穩(wěn)定，才能高效運(yùn)送到靶細(xì)胞表面。這就要求陽(yáng)離子聚合物載體具有較低毒性，避免復(fù)合物和細(xì)胞外基質(zhì)中蛋白的相互作用，避免DNA被降解，減少?gòu)?fù)合物和非靶向器官、組織和細(xì)胞的相互作用。細(xì)胞外基質(zhì)指細(xì)胞間具有保護(hù)靶細(xì)胞作用的多聚化蛋白和糖類(lèi)，在這些物質(zhì)的存在區(qū)域，相對(duì)較大的DNA傳遞體系難以逾越 ［12－13］。

1.3　其他屏障　聚合復(fù)合物還會(huì)面臨一些屏障，包括調(diào)理素（opsinnins，如血清抗體、補(bǔ)體等）、吞噬系統(tǒng)和降解酶等。這些屏障在血液循環(huán)和組織中都可能存在。其中調(diào)理素能與載體及其靶基因結(jié)合從而使基因和載體失活，聚合復(fù)合物表面多余的陽(yáng)性電荷在體內(nèi)能激活補(bǔ)體系統(tǒng)，造成目的基因在未到達(dá)效應(yīng)細(xì)胞前被吞噬破壞；吞噬系統(tǒng)則是機(jī)體對(duì)于異物的非特異性防御系統(tǒng)，存在于機(jī)體各部位的單核吞噬細(xì)胞（也有中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的參與）對(duì)入侵的大分子物質(zhì)有吞噬、消化和消除的作用，而肝和脾中的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)則既能捕獲、內(nèi)吞又能消化基因傳遞載體系統(tǒng)；在血液和組織中存在的各種降解酶如血清中和胞周液中的核酸酶能迅速消化未被保護(hù)的DNA分子，從而降低達(dá)到靶細(xì)胞表面的DNA的量。

2　陽(yáng)離子聚合物介導(dǎo)的基因傳遞的細(xì)胞內(nèi)途徑和胞內(nèi)屏障

聚合復(fù)合物經(jīng)歷了從注射部位到達(dá)靶細(xì)胞過(guò)程中的一系列障礙，開(kāi)始轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞。陽(yáng)離子聚合物將質(zhì)粒DNA從細(xì)胞表面?zhèn)鬟f至細(xì)胞核內(nèi)部所遇到的屏障包括細(xì)胞膜、內(nèi)涵體－溶酶體、細(xì)胞質(zhì)、核膜和聚合復(fù)合物的解聚。

2.1　細(xì)胞內(nèi)吞（endocytosis）　陽(yáng)離子聚合復(fù)合物必須通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞才能進(jìn)入細(xì)胞。聚合復(fù)合物的細(xì)胞內(nèi)吞機(jī)制有2種 ［8，14］：①非特異性吸附內(nèi)吞（adsorptive endocytosis）。復(fù)合物表面帶正電荷，通過(guò)與細(xì)胞膜表面帶負(fù)電荷的硫酸蛋白多糖發(fā)生靜電相互作用而被細(xì)胞吸附，從而發(fā)生細(xì)胞內(nèi)吞。細(xì)胞攝取復(fù)合物的主要機(jī)制為胞吞機(jī)制的激活，當(dāng)將轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞內(nèi)吞抑制劑（如松胞菌素B及去氧葡糖）或細(xì)胞代謝抑制劑（如疊氮化鈉）共孵育后，其復(fù)合物攝取率及相應(yīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的表達(dá)率均顯著降低 ［15］。②特異性受體介導(dǎo)攝取。細(xì)胞膜表面含有很多特定的受體分子，可在陽(yáng)離子聚合物表面連接上特異性的配體，通過(guò)配體與細(xì)胞上的受體結(jié)合，提高聚合復(fù)合物的靶向性，即所謂的受體介導(dǎo)內(nèi)吞 ［16］。偶聯(lián)陽(yáng)離子聚合物的配體有許多，如半乳糖、甘露糖、葉酸、上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)鐵蛋白和CD3等。

2.2　內(nèi)涵體的釋放　聚合復(fù)合物經(jīng)細(xì)胞內(nèi)吞后進(jìn)入內(nèi)涵體（endosome），正常情況下大分子或異物被細(xì)胞內(nèi)吞后，與胞膜形成內(nèi)涵體，內(nèi)涵體被溶酶體迅速吞噬后二者融合形成內(nèi)涵體－溶酶體復(fù)合物。在內(nèi)涵體－溶酶體內(nèi)DNA如果不能被保護(hù)，并及時(shí)有效地被釋放，則會(huì)被溶酶體內(nèi)的酶降解，因此聚合復(fù)合物能否從內(nèi)涵體－溶酶體中逃逸，是決定轉(zhuǎn)染成功與否的關(guān)鍵之一。

對(duì)于結(jié)構(gòu)中含有氨基的陽(yáng)離子聚合物，聚乙烯亞胺（PEI）和聚酰胺胺樹(shù)形分子 ［17］，在其介導(dǎo)的基因傳遞過(guò)程中，聚合復(fù)合物采用一種被稱(chēng)為質(zhì)子海綿陽(yáng)吸附作用的方式從內(nèi)涵體－溶酶體中逃逸。這類(lèi)分子結(jié)構(gòu)中含有氨基的陽(yáng)離子聚合物可以在溶酶體內(nèi)的酸性條件下離子化，在pH　5～7時(shí)具有極強(qiáng)的緩沖能力，能夠吸附大量的質(zhì)子H ＋，成為“質(zhì)子海綿”。這類(lèi)高緩沖能力的陽(yáng)離子載體隨著內(nèi)涵體的酸化而使內(nèi)部氨基質(zhì)子化，可作為弱堿基對(duì)抗內(nèi)涵體的酸化作用，因此能夠抑制晚期內(nèi)涵體的酸化，從而隨著H ＋和C1 －的內(nèi)流，內(nèi)涵體發(fā)生滲透性膨脹、最終破裂，釋放聚合復(fù)合物 ［11］。

2.3　細(xì)胞質(zhì)中的傳遞　聚合復(fù)合物從內(nèi)涵體逸出后，能否在胞質(zhì)內(nèi)不被降解，從細(xì)胞質(zhì)移動(dòng)到核周?chē)臻g也同樣影響著基因的表達(dá)和功能。細(xì)胞質(zhì)由微絲和微管的復(fù)雜網(wǎng)、高濃度蛋白質(zhì)和各種亞細(xì)胞器組成，是具有高黏度的及尺寸在300～400的篩狀網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，只有小于250個(gè)堿基對(duì)的DNA分子在細(xì)胞質(zhì)中是自由擴(kuò)散的，大于54nm的分子的被動(dòng)擴(kuò)散會(huì)受到細(xì)胞質(zhì)的限制 ［18］。細(xì)胞質(zhì)的各種蛋白、微管和其他細(xì)胞器都會(huì)阻礙聚合復(fù)合物的運(yùn)動(dòng)。有絲分裂期間，聚合復(fù)合物可以通過(guò)胞質(zhì)的分離而重新在細(xì)胞內(nèi)分配，從而使一些復(fù)合物能到達(dá)細(xì)胞核附近。有證據(jù) ［19］表明：帶有正電荷的納米聚合復(fù)合物能夠通過(guò)非特異性地與負(fù)電性的微管或肌動(dòng)蛋白作用而沿著細(xì)胞骨架網(wǎng)移動(dòng)到核膜。陽(yáng)離子聚合物作為DNA從胞質(zhì)移動(dòng)到核膜周?chē)膫鬟f介質(zhì)，可保護(hù)DNA免于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)核酸酶的降解，延長(zhǎng)DNA在胞質(zhì)內(nèi)的存活時(shí)間，從而增加DNA入核的機(jī)會(huì)。

2.4　轉(zhuǎn)導(dǎo)入核　經(jīng)過(guò)細(xì)胞質(zhì)的傳遞，DNA必須跨越核膜進(jìn)入細(xì)胞核才能發(fā)揮其作用。核膜由帶有核孔的雙層膜組成，核孔復(fù)合物（nuclear pore complex，NPC）由大約100個(gè)不同的蛋白亞單元構(gòu)成，只允許離子和小分子的自由擴(kuò)散，直徑小于9nm的分子或相對(duì)分子質(zhì)量小于60　000的蛋白質(zhì)可被動(dòng)彌散通過(guò)NPC中間水通道。DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)入核的可能途徑包括：①細(xì)胞分裂時(shí)核膜的破裂，在核膜破裂時(shí)，DNA被重新分配并定位在核內(nèi)。聚合復(fù)合物或DNA因此進(jìn)入細(xì)胞核。有研究 ［20］發(fā)現(xiàn)：在細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂時(shí)加入聚合復(fù)合物后，轉(zhuǎn)染效能比細(xì)胞周期停止時(shí)要高，說(shuō)明有絲分裂有利于轉(zhuǎn)染的進(jìn)行。Brunner等 ［21］的研究發(fā)現(xiàn)：在細(xì)胞分裂前不久進(jìn)行的轉(zhuǎn)染效率比細(xì)胞生長(zhǎng)初期的轉(zhuǎn)染效率高30～500倍，認(rèn)為細(xì)胞周期分布是影響陽(yáng)離子聚合物載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染的重要因素，有絲分裂（包括S期和G 2期）時(shí)的細(xì)胞核膜破裂可以提高轉(zhuǎn)染效率。這也是增殖快的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效能比不分裂或者分裂慢的細(xì)胞高的原因。②經(jīng)核孔進(jìn)入。有研究 ［22］指出：當(dāng)核孔直徑為80nm時(shí)，雖然僅留下9nm的中央水通道，但直徑小于28nm的顆粒仍然可以從核孔中通過(guò)，因此粒徑小于28nm的聚合復(fù)合物有可能通過(guò)核孔進(jìn)入細(xì)胞核。③與核膜融合。一些研究者 ［21］認(rèn)為：聚合復(fù)合物進(jìn)入到胞核會(huì)使復(fù)合物與核膜融合，由帶正電荷的復(fù)合物與帶負(fù)電荷的膜磷脂相互作用所介導(dǎo)。這個(gè)過(guò)程可能與復(fù)合物包裹有一層親脂層有關(guān)，親脂層可能來(lái)自聚合復(fù)合物表面附著的陰離子磷脂分子，或者是內(nèi)涵體裂解后的殘留片斷，聚合復(fù)合物可能是因?yàn)橛H脂層與核膜融合而使復(fù)合物進(jìn)入核內(nèi)。

2.5　陽(yáng)離子聚合物／DNA復(fù)合物的解聚　在DNA轉(zhuǎn)錄目的基因翻譯之前，陽(yáng)離子聚合物／DNA復(fù)合物必須發(fā)生解聚，才能釋放DNA，DNA的釋放是實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄的首要條件。DNA從聚合復(fù)合物中的解聚可能與DNA聚合酶從組蛋白上解離DNA的方式類(lèi)似，也可能是細(xì)胞內(nèi)的多聚陰離子如DNA和RNA取代了復(fù)合物中的質(zhì)粒從而使DNA從復(fù)合物中解離 ［11］。在基因傳遞過(guò)程中，聚合復(fù)合物過(guò)早的解聚會(huì)導(dǎo)致DNA的提前降解影響目的基因的傳遞，而較遲的或者是不完全的分解會(huì)影響基因的有效表達(dá) ［23］。若載體／DNA復(fù)合物的穩(wěn)定性不同，則DNA的釋放有可能發(fā)生在不同階段。聚合復(fù)合物的解聚究竟發(fā)生于入核之前，還是入核之后尚有爭(zhēng)議。多數(shù)研究者 ［24］認(rèn)為：DNA在入核前從聚合復(fù)合物卸載并非必需。有研究 ［25］表明：PEI／DNA復(fù)合物基因傳遞過(guò)程中，DNA從內(nèi)涵體中釋放后，仍然是與PEI緊密結(jié)合的，DNA進(jìn)入細(xì)胞核時(shí)，部分復(fù)合物并未發(fā)生解離。DNA一旦進(jìn)入細(xì)胞核，轉(zhuǎn)染效率主要取決于基因表達(dá)系統(tǒng)，經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯，最終產(chǎn)生目的基因編碼的蛋白質(zhì)。

3　陽(yáng)離子聚合物的設(shè)計(jì)與展望

利用陽(yáng)離子聚合物基因傳遞過(guò)程中的特點(diǎn)，研究者們?cè)O(shè)計(jì)了不同結(jié)構(gòu)的新型聚合物，用以避免上述胞內(nèi)外屏障對(duì)其轉(zhuǎn)染效果的影響。針對(duì)不同靶器官，在陽(yáng)離子聚合物的結(jié)構(gòu)上嫁接特異性受體，增加聚合物靶向定位的能力 ［26－27］。如以半乳糖基團(tuán)對(duì)聚合物進(jìn)行化學(xué)修飾，用以增加聚合物對(duì)肝細(xì)胞的特異性吸附，增加聚合復(fù)合物轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞的效率 ［28－29］。針對(duì)聚合復(fù)合物從內(nèi)涵體－溶酶體中順利逃逸對(duì)轉(zhuǎn)染過(guò)程的重要性這一特點(diǎn)，有研究者在轉(zhuǎn)染過(guò)程中加入抑制溶酶體的藥物（如氯喹），可以提高DNA的轉(zhuǎn)染效率 ［30］。這是因?yàn)槁揉侨鯄A，經(jīng)細(xì)胞攝取后能升高內(nèi)涵體的pH值，從而抑制內(nèi)涵體－溶酶體之間的融合，有助于復(fù)合物從核內(nèi)體中脫離出來(lái)，避免了DNA被核酸酶降解，因而能有效提高轉(zhuǎn)染的效率 ［30］。為了使聚合物跨越核膜這一屏障，研究者在聚合物的結(jié)構(gòu)中設(shè)計(jì)了核定位信號(hào)（nuclear localization signal，NLS）肽，有利于聚合物跨越核膜。研究 ［22］發(fā)現(xiàn)：將單一的NLS肽段與一個(gè)報(bào)告基因共價(jià)結(jié)合，可以使基因的表達(dá)提高1　000倍。NLS不僅可縮短DNA在胞質(zhì)中的逗留時(shí)間，還可以輔助DNA進(jìn)入細(xì)胞核 ［31］。目前研究最多的NLS是來(lái)自SV40的T抗原，其經(jīng)典氨基酸序列為Pro－Lys－Lys－Lys－Arg－Lys－Val （PKKKRKV），這一序列得到了廣泛應(yīng)用。Zanta等 ［32］將環(huán)形CMV－Luc質(zhì)粒線性化，然后在兩端加帽，其中一端含有合成的SV40NLS，用這一質(zhì)粒與PEI混合后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率顯著提高。

由此可見(jiàn)，充分了解陽(yáng)離子聚合物基因傳遞的過(guò)程以及屏障，對(duì)于新型陽(yáng)離子聚合物的設(shè)計(jì)具有重要意義。利用陽(yáng)離子聚合物的結(jié)構(gòu)易于進(jìn)行化學(xué)修飾的優(yōu)點(diǎn)，可以在其表面修飾以靶向特異性配體或抗體；或在基因傳遞過(guò)程中，使用可以促進(jìn)聚合復(fù)合物跨越胞內(nèi)外屏障的藥物，均有望應(yīng)用于聚合物的設(shè)計(jì)之中 ［33－34］。