［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

［文章編號］1671－587Ⅹ（2015）01－0110－04

DOI：10.13481／j.1671－587x.20150121

［收稿日期］2014－08－12

［基金項(xiàng)目］吉林省科技廳科技發(fā)展計劃項(xiàng)目資助課題（20130102096JC）；吉林省長春市科技局科技計劃項(xiàng)目資助課題（12SF88）

［作者簡介］李　雯（1989－），女，山西省長治市人，在讀醫(yī)學(xué)碩士，主要從事牙髓生物學(xué)方面的研究。

［通信作者］張穎麗，教授，碩士研究生導(dǎo)師（Tel：0431－88796017，E－mail：zhangyingli1989＠163.com）

Influence of capping agent CCN2in morphology of dental pulp tissue

LI Wen 1，YIN Shuo 2，ZHANG Juan 1，WANG He 1，GAN Kang 3，MA Shanshan 4，ZHANG Yingli　 1

（1.Department of Operative Dentistry and Endodontics，Stomatology Hospital，Jilin University，Changchun　130021，China；2.Department of Prosthodontics，Stomatology Hospital，Jilin University，Changchun　130021，China；3.Department of Comprehensive Treatment，Stomatology Hospital，Jilin University，Changchun　130021，China；4.Department of Implantation，Stomatology Hospital，Jilin University，Changchun　130021，China）

Abstract：Objective To observe the histomorphological changes of dental pulp of the rats with mechanical injury at different time points after treated with connective tissue growth factor（CTGF／CCN2）and to clarify its mechanism.Methods Tweenty Wistar rats were divided into five groups，one group was randomly selected as normal group，each Wistar rat in the other four groups（groups of　3d，7d，14dand　28d）was prepared with a cavity on the occlusal surface of maxillary first molars on both sides.CCN2was applied on the left exposed pulp for the PBS experimental group，and PBS was applied on the right exposed pulp for the control group.Four rats，one in each group，were put to death respectively on the　3rd，7th，14th and　28th day after operation.The teeth of each rat were fixed，decalcified and made to sections，which were stained with HE.The histomorphological changes of dental pulp tissue in each sample were observed.Results In control group，the inflammation under the amputated site was more obvious than the experimental group at　3dand　7d；the inflammatory cells were decreased andscattered reparative dentin was observed in　14d；necrosis was observed at　28d.While in experimental group a large number of inflammatory cells gathered under the amputated site at　3d，as well as the dilatation of blood vessels was observed；7dafter injury the inflammation in experimental group was reduced.Compared with control group，the leukomonocytes were less.After injury for　14dthe calcified bridge was observed and the inflammatory cells disappeared；28 d after injury the reparative dentin was observed.Conclusion CCN2 participates in the reconstruction of the tissue structure after dental pulp injury.It indicates that CCN2is a good pulp capping agent.Keywords：connective growth factor；dental pulp；dental pulp capping；reconstruction

牙髓組織是疏松的結(jié)締組織，是牙體組織中唯一的軟組織，具有形成牙本質(zhì)、營養(yǎng)、感覺和防御功能及修復(fù)再生能力 ［1］。當(dāng)遇到感染和組織損傷等外源性刺激時，牙髓可產(chǎn)生由各種細(xì)胞因子介導(dǎo)一系列級聯(lián)反應(yīng)。牙髓損傷后的修復(fù)是一個很復(fù)雜的過程，通常認(rèn)為成纖維細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和牙髓干細(xì)胞的遷移、血管再生以及修復(fù)性牙本質(zhì)的形成是牙髓組織在修復(fù)過程中的基本特征 ［2］?；钏柚委熞恢北徽J(rèn)為是牙髓生物學(xué)中最可靠的治療方法。如何促進(jìn)牙髓組織結(jié)構(gòu)的重建和形成牙體硬組織是目前研究的焦點(diǎn)。最近研究 ［3－5］顯示：CCN蛋白由一組具有高度序列同源性的多肽因子組成，在胚胎發(fā)育、炎癥反應(yīng)、損傷修復(fù)、纖維性疾病和腫瘤的發(fā)生中起重要作用。而結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF／CCN2）是CCN家族的重要成員，早期國內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)CCN2在腫瘤細(xì)胞中過度表達(dá)時腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移浸潤的能力更強(qiáng)。Muromachi等 ［6］體外研究證實(shí)：CCN2在基質(zhì)金屬蛋白酶3（matrix metalloproteinases－3，MMP－3）的誘導(dǎo)下可以促進(jìn)牙髓細(xì)胞的增殖、遷移和血管的再生。隨后又有學(xué)者 ［7］發(fā)現(xiàn)：CCN2可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及血管形成。本研究將CCN2用于大鼠牙髓損傷創(chuàng)面，觀察牙髓損傷修復(fù)過程中組織的形態(tài)學(xué)變化，為臨床開發(fā)新的蓋髓劑提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)動物、主要試劑和儀器　清潔級8周齡雄性Wistar大鼠20只，體質(zhì)量180～220g，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物合格證號：SCXK（吉）2013－0001。3%水合氯醛、乙醚均購自長春市永輝化工商貿(mào)有限公司；膠原蛋白海綿，由吉林大學(xué)口腔頜面外科提供；100g·L －1EDTA溶液、4%多聚甲醛和3%生理鹽水均購自北京恒業(yè)中遠(yuǎn)化工有限公司；CCN2購自美國Sigma公司。1／4鎢鋼球鉆和高速渦輪機(jī)購自上海醫(yī)用儀器設(shè)備廠；雙目光學(xué)顯微鏡（BD－45B2）購自德國UBM生物技術(shù)公司；開口器為自制。

1.2　動物標(biāo)本的制備　將20只Wistar大鼠稱體質(zhì)量，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，平均分為5組，隨機(jī)取一組為正常組，其余4組分別為3、7、14和28d組。除正常組外，每組大鼠用3%水合氯醛腹腔注射麻醉，固定四肢成仰臥位。2%碘伏溶液消毒口腔，雙側(cè)上頜第一磨牙用1／4球鉆在頜面中央制洞，見穿髓孔時停止操作，生理鹽水沖洗。無菌棉球干燥牙面，在左側(cè)上頜第一磨牙露髓處放含有CCN2（100g·L －1）的膠原蛋白海綿作為實(shí)驗(yàn)組，在右側(cè)上頜第一磨牙露髓處放含有PBS緩沖液的膠原蛋白海綿作為對照組，用富士Ⅸ玻璃離子充填窩洞。各組大鼠分別于3、7、14和28d心臟灌流處死，待組織變硬立即斷頭取上頜牙齒標(biāo)本，并置于4%多聚甲醛中常溫固定48 h后，再置于100g·L －1　EDTA溶液中脫鈣10周，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，常規(guī)石蠟包埋。將標(biāo)本連續(xù)切片，片厚5μm。

1.3　HE染色方法　將切片放入60℃的烘片機(jī)中過夜將蠟烤化，次日取出依次放入脫蠟二甲苯（Ⅰ）中10min，脫蠟二甲苯（Ⅱ）中10min，再放入無水酒精（Ⅰ）中5 min，無水酒精（Ⅱ）中5 min，90%、85%和80%酒精各1～3min，然后流水沖洗5min左右，觀察切片直至清亮，不成云霧狀即可。沖洗后放入蘇木精中染色6min左右，再移入流水沖洗，去掉大部分浮色后再放入1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，流水沖洗。氨水（pH＝8.0）浸泡約數(shù)秒，流水沖洗。再放入0.5%伊紅溶液中浸染5min。然后依次80%、85%、90%和95%酒精各1～2min，然后分別放入無水酒精（Ⅰ）和無水酒精（Ⅱ）5min，最后二甲苯透明5～10min，用中性樹膠封片。

1.4　大鼠牙髓組織形態(tài)學(xué)觀察　光鏡下觀察對照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠上頜第一磨牙的炎癥反應(yīng)情況和修復(fù)性牙本質(zhì)形成情況。

2　結(jié)果

2.1　正常組大鼠牙髓形態(tài)學(xué)　光鏡下觀察，正常組大鼠牙髓組織分為成牙本質(zhì)細(xì)胞層、乏細(xì)胞層、多細(xì)胞層和固有層。外層成牙本質(zhì)細(xì)胞呈柵欄狀排列緊密、整齊，內(nèi)側(cè)成纖維細(xì)胞呈星形，間質(zhì)可見少量血管和纖維組織。見圖1（插頁三）。

2.2　對照組大鼠牙髓形態(tài)學(xué)　光鏡下觀察，對照組中3d組大鼠在露髓點(diǎn)下方可見大量炎細(xì)胞浸潤，炎癥較實(shí)驗(yàn)組明顯，血管擴(kuò)張，前期牙本質(zhì)無明顯變化（圖2A，見插頁三）；7d組炎癥細(xì)胞向正常牙髓內(nèi)浸潤，數(shù)量較相對應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組多，成纖維細(xì)胞與牙本質(zhì)之間有少量的前期牙本質(zhì)形成，無骨樣牙本質(zhì)及修復(fù)性牙本質(zhì)生成（圖2B，見插頁三）；14d組仍存在一定范圍的炎細(xì)胞浸潤，但前期牙本質(zhì)不均勻增厚，可見散在修復(fù)性牙本質(zhì)（圖2C，見插頁三）；28d組可見髓室內(nèi)牙髓有變性壞死征兆，但仍可見增厚的前期牙本質(zhì)形成了一定量的修復(fù)性牙本質(zhì)（圖2D，見插頁三）。

2.3　實(shí)驗(yàn)組大鼠牙髓形態(tài)學(xué)　光鏡下觀察，實(shí)驗(yàn)組中3d組大鼠在露髓點(diǎn)下方可見大量炎細(xì)胞聚集，成牙本質(zhì)細(xì)胞排列緊密，可見明顯的血管擴(kuò)張及新生血管（圖3A，見插頁三）；7d組炎癥減輕，大量的成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞聚集，可見成纖維細(xì)胞與牙本質(zhì)之間形成少量前期牙本質(zhì)（圖3B，見插頁三）；14d組形成連續(xù)完整的鈣化橋，成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞增生活躍，排列紊亂，無明顯炎細(xì)胞浸潤（圖3C，見插頁三）；28d組在髓室內(nèi)已形成非常厚的修復(fù)性牙本質(zhì)，成牙本質(zhì)細(xì)胞排列正常，牙髓組織內(nèi)無明顯炎細(xì)胞浸潤（圖3D，見插頁三）。

3　討論

牙本質(zhì)構(gòu)成牙體硬組織的主體，而牙髓組織則包含于中央的髓腔中，主要由牙髓成纖維細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞、未分化間充質(zhì)細(xì)胞和防御細(xì)胞組成 ［8］。成牙本質(zhì)細(xì)胞排列在髓腔最外層，當(dāng)牙髓組織受到外界輕微刺激時，成牙本質(zhì)細(xì)胞分泌基質(zhì)形成前期牙本質(zhì)，并與牙髓形成牙髓－牙本質(zhì)復(fù)合體保護(hù)牙髓不受損傷。當(dāng)牙髓受到較強(qiáng)烈的刺激如感染或外傷導(dǎo)致暴露時，其儲備的未分化間充質(zhì)干細(xì)胞遷移至損傷處增殖，分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞，分泌牙本質(zhì)基質(zhì)，最終形成修復(fù)性牙本質(zhì)，這是牙髓自身修復(fù)的潛能，也是活髓保存治療的生物學(xué)基礎(chǔ) ［9］。從傳統(tǒng)的氫氧化鈣蓋髓劑到現(xiàn)在新興的三氧化礦物凝聚體（MTA） ［10］蓋髓劑對牙髓損傷后組織的改建起到了一定的作用。但是氫氧化鈣中高鈣離子濃度常常使牙髓組織凝固性壞死，而MTA價格昂貴，不宜用于基礎(chǔ)研究。許多學(xué)者研究 ［11－13］發(fā)現(xiàn)：CCN家族的成員之一CCN2一直是近幾年來研究的熱點(diǎn)，其廣泛存在于人類各結(jié)締組織，主要由成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和癌細(xì)胞等分泌合成。在胚胎發(fā)育與分化，血管形成與再生，傷口修復(fù)，纖維性病變，炎性病變，腫瘤的發(fā)生發(fā)展，骨的形成與修復(fù)等多種生物學(xué)過程中起重要的作用。早期研究 ［14－15］顯示：CCN2主要在軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中可檢測到，可促進(jìn)軟骨細(xì)胞的分化和細(xì)胞外基質(zhì)的形成。所以本研究中擬設(shè)定CCN2對牙髓組織損傷后的改建會有一定的促進(jìn)作用，并將CCN2用作蓋髓劑，觀察牙髓組織在修復(fù)過程中的形態(tài)學(xué)變化。

本研究結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組中3d組和對照組大鼠牙髓均出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)，細(xì)胞胞體固縮、扁平，血管擴(kuò)張。這就在一定程度上說明了早期階段的炎癥反應(yīng)是牙髓修復(fù)過程中關(guān)鍵的一部分 ［16］。隨著免疫防御系統(tǒng)的免疫應(yīng)答作用增強(qiáng)，本研究中實(shí)驗(yàn)組7d時炎癥逐漸減輕，炎細(xì)胞以淋巴細(xì)胞為主。成牙本質(zhì)細(xì)胞在髓腔內(nèi)細(xì)胞因子的刺激下分泌活動加劇，在損傷的早期階段分泌細(xì)胞外基質(zhì)形成病理性沉積，即前期牙本質(zhì)。由于受到強(qiáng)烈的外傷刺激，原代成牙本質(zhì)細(xì)胞合成分泌基質(zhì)的同時很快凋亡，此時牙髓組織內(nèi)具有分化潛能的牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞將移行到該處，并分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞取代死亡的細(xì)胞 ［17］，然后繼續(xù)合成分泌基質(zhì)形成骨樣牙本質(zhì)；14d時中前期牙本質(zhì)逐漸增厚形成有管狀結(jié)構(gòu)的連續(xù)的鈣化橋，而對照組由于缺少蓋髓劑仍存在一定范圍內(nèi)的炎癥；28d時穿髓孔的下方的成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞分化越來越完善，最終獲得細(xì)胞突。這就使得其分泌的膠原在骨樣牙本質(zhì)周圍逐漸沉積形成具有管狀結(jié)構(gòu)的修復(fù)性牙本質(zhì)。本研究結(jié)果同時顯示：對照組28d時可以看到露髓處下方有明顯的壞死病灶，但由于牙髓－牙本質(zhì)復(fù)合體對外界刺激的防御性反應(yīng)，仍形成了一定范圍的反應(yīng)性牙本質(zhì)。

綜上所述，牙髓損傷后組織的改建過程是一個很復(fù)雜的生物學(xué)過程，可以概括為以下幾個方面 ［18］：初期階段必不可少的炎癥反應(yīng)如炎細(xì)胞大量聚集，血管擴(kuò)張以及新生血管的形成等；成牙本質(zhì)細(xì)胞分泌活動的增強(qiáng)和凋亡；牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞在損傷部位增殖并分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞；成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞向外分泌基質(zhì)形成修復(fù)性牙本質(zhì)。同時本研究結(jié)果表明：CCN2蓋髓劑對牙髓損傷后組織的改建有一定的促進(jìn)作用，是一種良好的蓋髓劑，但其作用機(jī)制需要進(jìn)一步研究。