王 飛，魏紅芳，胡成棟，張恩錄，高愛芹，王 瑞，李東風

(河北省邯鄲市中心醫(yī)院:1.骨二科;2.麻醉科 056001)

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·臨床研究·

平滑肌細胞與小腸黏膜下層體外復合培養(yǎng)分析*

王 飛1，魏紅芳2，胡成棟1，張恩錄1，高愛芹1，王 瑞1，李東風1

(河北省邯鄲市中心醫(yī)院:1.骨二科;2.麻醉科 056001)

目的 對平滑肌細胞與小腸黏膜下層體外復合培養(yǎng)進行分析研究。方法 將平滑肌細胞與小腸黏膜下層培養(yǎng)方式作為實驗組，將傳統(tǒng)平滑肌細胞培養(yǎng)方式作為對照組，通過內(nèi)皮細胞與平滑肌細胞分離與培養(yǎng)、種植與擬生態(tài)環(huán)境下培養(yǎng)以及組織工程化血管的自體移植等步驟，對比分析兩組培養(yǎng)出的細胞數(shù)量情況。結果 實驗組培養(yǎng)細胞的數(shù)量為(36.42±11.01)×105，明顯高于對照組中培養(yǎng)細胞的數(shù)量(28.16±10.14)×105，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論 應用平滑肌細胞與小腸黏膜下層體外復合培養(yǎng)技術對平滑肌細胞進行培養(yǎng)后，其細胞數(shù)量明顯高于常規(guī)培養(yǎng)方法，可以在臨床上廣泛應用。

平滑肌細胞； 小腸黏膜下層； 外復合培養(yǎng)

目前全世界每年大約有20萬例周圍血管移植，自體血管移植是迄今最理想的替代物，但其應用受到一定限制[1]。小腸黏膜下層(SIS)是天然細胞外基質(zhì)類生物衍生材料，通常由豬小腸制備，人工處理后的SIS主要由Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白及少量Ⅴ、Ⅵ膠原構成，制備的SIS厚度約80 μm，具有無免疫原性、抗微生物活性、優(yōu)良的生物力學性能，并能促進組織再生，是組織工程細胞外基質(zhì)很有前途的生物材料[2-3]。以異種SIS為細胞外基質(zhì)預構成三維管道，將內(nèi)皮細胞與平滑肌細胞在三維管道上聯(lián)合培養(yǎng)，復合構建組織工程化血管的設想，其可行性值得探索。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 本研究中采用的胎牛血清、高糖DMEM培養(yǎng)基及胰蛋白酶等材料均由美國Gibco公司生產(chǎn)，北京中杉金橋生物技術有限公司生產(chǎn)的鼠抗人A-肌動蛋白單克隆抗體，日本Sanyo公司生產(chǎn)的CO2培養(yǎng)箱，日本Olympus公司生產(chǎn)的倒置相差顯微鏡，日本Hitach公司生產(chǎn)的透射電鏡等儀器。

1.2 方法

1.2.1 豬SIS的制備與檢測 (1)制備：取健康豬的空腸長約10 cm，沖凈，機械法去除外面的漿膜層與肌層，翻轉后去除黏膜層，縱向切開黏膜下層基質(zhì)，浸泡于100 mmol/L乙二胺四乙酸與10 mmol/L氫氧化鈉(pH11～12)溶液中，去離子水沖凈，再浸泡于1 mol/L鹽酸與1 mol/L氯化鈉(NaCl)溶液中6～8 h，去離子水沖凈，在含1 mol/L NaCl的磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH7.0～7.4)中浸泡16 h，去離子水沖凈，在PBS中浸泡2 h，去離子水沖洗2 h，0.2%過氧乙酸(含5%無水乙醇)消毒30 min，在含0.05%疊氮化鈉的PBS溶液清洗2 h，用2.5×10-1Gyγ射線照射。(2)光化學交聯(lián)劑固定處理后[3]，進行光鏡、掃描電鏡及免疫組化檢測，驗證其脫細胞情況。(3)由于SIS黏膜面較漿膜面有更低的孔隙率，因此將SIS黏膜面朝內(nèi)包繞在細玻璃棒上，于顯微鏡下應用9/0無創(chuàng)線縫合出直徑為2 mm長約20 mm管狀基質(zhì)，在體外檢測其生物力學性能，包括平均破裂壓、彈性模量及縱向的屈服應力。處理后的管狀脫細胞基質(zhì)以玻璃化法保存。

1.2.2 豬SIS基質(zhì)抗原性檢測 將處理后的豬小腸黏膜細胞基質(zhì)，切取1 cm2植入家兔皮下組織，7 d后取材，于光鏡、免疫組化檢測脫細胞基質(zhì)在家兔體內(nèi)的免疫反應情況。如有條件可行單克隆抗體檢測家兔單核淋巴細胞黏附蛋白(CD18)。

1.2.3 內(nèi)皮細胞與平滑肌細胞分離與培養(yǎng) (1)無菌條件下取家兔自體大隱靜脈，去污，膠原酶灌流消化，采集內(nèi)皮細胞進行傳代培養(yǎng)，應用熒光顯微鏡或細胞流式儀進行細胞鑒定；(2)類似方法對平滑肌細胞進行分離、培養(yǎng)與鑒定。

1.2.4 內(nèi)皮細胞與平滑肌細胞種植與擬生態(tài)環(huán)境下培養(yǎng) (1) 取傳代培養(yǎng)2～3代的內(nèi)皮細胞，胰蛋白酶消化、離心漂洗后，種植內(nèi)皮細胞于1 cm2的豬SIS基質(zhì)上，培養(yǎng)鑒定內(nèi)皮細胞能否在此基質(zhì)上成活。(2)擬生態(tài)環(huán)境動態(tài)旋轉反應器的制備：血管細胞在生理條件下，受到流體切變應力、管壁舒縮產(chǎn)生的牽張應力及靜水壓等應力，這些應力環(huán)境對于血管細胞的形態(tài)、增殖、極性及基質(zhì)構成與結構有重要影響。參考相關資料，制備簡便有效、適于血管灌注培養(yǎng)的動態(tài)旋轉反應器。(3)內(nèi)皮細胞與平滑肌細胞種植：取2 cm制備好的直徑為2 mm的管狀SIS基質(zhì)置于反應器內(nèi)，接種內(nèi)皮細胞，在37 ℃與5% CO2條件下孵化，動態(tài)培養(yǎng)液灌注，第2天用微型注射器將平滑肌細胞多點隨機注射入管狀脫細胞基質(zhì)內(nèi)，繼續(xù)動態(tài)培養(yǎng)四周。培養(yǎng)期間定期進行細胞計數(shù)器計數(shù)、光鏡、電鏡及免疫組化檢測基質(zhì)內(nèi)細胞量及活性。

1.2.5 組織工程化血管生物學及生物力學性能檢測 (1)應用乙酰膽堿、氯化鉀、硝普鈉等藥物，比較正常股動脈與工程化血管間生物學方面的差別。(2)檢測正常股動脈與工程化血管平均破裂壓、彈性模量及縱向的屈服應力，比較SIS基質(zhì)、正常股動脈、工程化血管三者間生物力學方面的差別。(3)通過光鏡、電鏡及免疫組化檢測，比較正常股動脈與工程化血管二者形態(tài)學方面的差別。

1.2.6 組織工程化血管的自體移植 (1)管狀SIS基質(zhì)種植細胞后2周，經(jīng)鑒定細胞成活后，分別取自體股動脈及管狀SIS基質(zhì)作為對照，行工程化血管移植(均不行全身抗凝藥物治療)，于1、2、4、8周定期取材，應用乙酰膽堿、氯化鉀、硝普鈉等藥物，比較正常股動脈與工程化血管間生物學方面的差別；并行大體、光鏡、電鏡及免疫組化檢測，觀察其血管通暢率、形態(tài)學及免疫相容性，以確定其可行性。(2)取管狀SIS基質(zhì)行血管替代，以自身作為對照(均不行全身抗凝藥物治療)，定期取材檢測，在血管通暢率、形態(tài)學及免疫相容性等方面，與組織工程血管相比較。

1.3 觀察指標 分別觀察兩組培養(yǎng)方式和培養(yǎng)細胞的數(shù)量，并記錄分析。

2 結 果

分別對細胞進行培養(yǎng)，實驗組培養(yǎng)細胞的數(shù)量為(36.42±11.01)×105，明顯高于傳統(tǒng)平滑肌細胞培養(yǎng)方式培養(yǎng)細胞的數(shù)量(28.16±10.14)×105，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討 論

近幾年來，隨著醫(yī)學技術水平的不斷發(fā)展與提高，人們對生物細胞培養(yǎng)技術的要求日益增加，平滑肌細胞是人體十分重要的細胞之一，其臨床上應用十分廣泛，但在平滑肌細胞的培養(yǎng)過程并不是十分簡單[4]。因此，本研究采用的SIS管狀基質(zhì)與平滑肌細胞培養(yǎng)相結合的復合培養(yǎng)過程，是經(jīng)三維擬生理環(huán)境培養(yǎng)，復合構建組織工程化血管，故其臨床效果十分顯著，明顯彌補了傳統(tǒng)平滑肌細胞培養(yǎng)過程中的不足之處，是一種十分有效的細胞培養(yǎng)方法[5-6]。用豬SIS管狀基質(zhì)作為細胞種植與培養(yǎng)的三維支架，其優(yōu)良的組織結構相似性與低廉的價格，是人工材料所難以比擬的，探索其可行性，為小管徑血管支架尋找一種新材料[7]。異種SIS管狀基質(zhì)與自體內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞復合構建組織工程化血管，在動物體內(nèi)、外對其生物學及生物力學特性進行對比研究，探索其作為小血管移植的可行性[8]。尋找口徑小于4 mm小血管的移植替代物，已成為骨科研究的一個難點，通過研究異種SIS管狀基質(zhì)在體外擬生態(tài)環(huán)境下，預內(nèi)皮化培養(yǎng)復合構筑組織工程化血管的可行性，以探索適于小血管移植的替代物[9-10]。臨床上SIS血管較ePTFE有更強的抗感染力，其提取液能夠抑制多種細菌生長，與此同時，SIS有比自體血管更強的再生能力。雖然血管順應性無明顯變化，但相應的時間后SIS移植物壁厚較原來增厚10倍以上，隨著SIS蛻變與吸收的同時，應按照血管生理與力學的要求不斷改造[11-12]。

本研究結果顯示，分別對細胞進行培養(yǎng)，平滑肌細胞與SIS培養(yǎng)方式培養(yǎng)細胞的數(shù)量為(36.42±11.01)×105，明顯高于對照組中培養(yǎng)細胞的數(shù)量(28.16±10.14)×105，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。研究結果表明，在應用平滑肌細胞與SIS培養(yǎng)復合培養(yǎng)的過程中，明顯提高了平滑肌細胞的培養(yǎng)數(shù)量，臨床意義十分重大[13]。

綜上所述，臨床上采用平滑肌細胞與SIS體外復合培養(yǎng)技術對平滑肌細胞進行培養(yǎng)后，其細胞數(shù)量明顯高于常規(guī)培養(yǎng)方法，較大程度地提高了平滑肌細胞的培養(yǎng)數(shù)量，安全可靠，可以在臨床上廣泛應用。

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河北省邯鄲市科技計劃項目(1223108090-3)。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.03.039

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1672-9455(2015)03-0383-02

2014-08-09

2014-10-12)