肝缺血再灌注對膽管細(xì)胞凋亡及膽汁淤積的影響

Effects of liver ischemia reperfusion on the apoptosis of bile duct cell and the cholestasis

劉小帥1，2，張萬星2，郭懷斌2(1.河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，河北 石家莊050017；2.河北省人民醫(yī)院普外三科，河北 石家莊050051)

[關(guān)鍵詞]肝缺血再灌注損傷；細(xì)胞凋亡；膽汁淤積；綜述

缺血再灌注損傷是指缺血后的再灌注不僅不能使組織、器官功能恢復(fù)，反而加重了組織、器官功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷的一種

病理生理過程，是影響移植肝存活率的一個重要因素。肝再灌注時不僅對肝細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用，同時對肝內(nèi)膽道的膽管細(xì)胞也有損傷，從而使膽道發(fā)生病變[1]。本文旨在討論缺血再灌注損傷中Bcl-2通過對膽管細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，從而進(jìn)一步探討肝缺血再灌注對膽汁淤積的影響。

1肝缺血再灌注與膽管細(xì)胞凋亡

1.1缺血再灌注中膽管的損傷

肝缺血再灌注對膽管的損傷機(jī)制主要包括鈣超載、氧自由基損傷、炎性損傷、血液循環(huán)障礙、ATP耗竭、膽汁和疏水性膽鹽加重?fù)p傷、細(xì)胞的凋亡等機(jī)制[2]。而膽管細(xì)胞的凋亡與肝缺血再灌注損傷有著密切的關(guān)系，抑制細(xì)胞凋亡可以有效減輕移植肝缺血再灌注損傷。目前已證明肝在遭受缺血再灌注打擊時，組織的損傷不僅來自缺血再灌注的直接作用，同時凋亡機(jī)制的啟動與放大后造成的組織壞死同樣也參與了肝組織的損傷過程[3]。Zhu等[4]在研究肝缺血再灌注損傷的動物實驗時也發(fā)現(xiàn)，熱缺血時可使大鼠膽道細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而對其產(chǎn)生損傷作用。因此通過探討肝缺血再灌注時膽管細(xì)胞細(xì)胞凋亡機(jī)制，可以更好地為我們提供IR的保護(hù)機(jī)制，減少肝缺血再灌注的膽道損傷。

1.2缺血再灌注中Bcl-2對膽管細(xì)胞凋亡的影響

膽管細(xì)胞的凋亡過程受許多蛋白因子的影響，而Bcl-2蛋白家族是膽管細(xì)胞凋亡中重要的調(diào)控蛋白，在膽管細(xì)胞凋亡中起到了關(guān)鍵的作用。Bcl-2是一種膜整合蛋白，能防止多種原因引起的凋亡 ，從而抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。目前國內(nèi)外已有大量實驗證實，通過調(diào)控基因Bcl-2蛋白的表達(dá)可以抑制膽管上皮細(xì)胞的凋亡[5-7]。因此從Bcl-2蛋白方向?qū)δ懝芗?xì)胞的凋亡進(jìn)行研究，將更有利于我們對于膽管細(xì)胞凋亡機(jī)制的了解，從而為臨床工作提供更好的預(yù)防及保護(hù)措施。

1.3Bcl-2抑制膽管細(xì)胞凋亡的機(jī)制

目前關(guān)于Bcl-2在抑制膽管細(xì)胞的凋亡的機(jī)制尚未完全明確，可能與以下因素相關(guān)[5]：①通過調(diào)節(jié)抗氧化途徑來抑制膽管細(xì)胞凋亡。在組織嚴(yán)重缺氧時，會導(dǎo)致ATP的減少，引起其分解產(chǎn)物次黃嘌呤在缺氧組織中大量堆積。另外氧自由基既可以直接導(dǎo)致DNA的損傷，從而誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，也可以誘發(fā)細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，影響信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，使相關(guān)促凋亡基因激活，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。而Bcl-2蛋白位于氧自由基產(chǎn)生的部位,即線粒體等亞細(xì)胞器膜上，可以抑制氧自由基，也可以起到一種抗氧化劑的作用[8]。在細(xì)胞凋亡中，線粒體的巰基可能組成了胞內(nèi)氧化還原電位的傳感器， Bcl-2可能是通過抑制谷胱甘肽(GSH)的外泄，降低胞內(nèi)的氧化還原電位，來抑制膽管細(xì)胞的凋亡[9]。②維持細(xì)胞內(nèi)鈣離子(Ca2+)穩(wěn)態(tài)，細(xì)胞凋亡的始動因素是細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的升高， Ca2+在促進(jìn)細(xì)胞凋亡中可以激活 Ca2+依賴性的核酸內(nèi)切酶，從而使雙鏈 DNA在核小體之間的連接區(qū)裂解，形成 DNA斷片，而 Bcl-2可以抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2+，使依賴于Ca2+的核酸內(nèi)切酶活性降低，從而阻斷細(xì)胞凋亡。研究證實通過Bcl-2能夠抑制鈣泵特異性抑制劑Thapsigargin(TG)誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，因為Bcl-2能抑制Ca2+的跨膜流動。因此Bcl-2可以通過對Ca2+的影響來抑制膽管細(xì)胞的凋亡[10]。③通過調(diào)節(jié)線粒體膜上通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)，從而調(diào)節(jié)線粒體膜通透性來抑制膽管細(xì)胞凋亡， Bcl-2與 Bax是定位于線粒體膜上的一對主要的抑凋亡成員和促凋亡成員。Bcl-2為凋亡抑制基因，而Bax則可拮抗Bcl-2的功能，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Bcl-2與Bax可形成同源二聚體或異源二聚體來改變線粒體的通透性，從而決定細(xì)胞的生存與死亡[11-13]。兩者在線粒體外膜上的濃度比例，調(diào)節(jié)著線粒體MPTP的開閉，這與細(xì)胞的存亡有著密切的關(guān)系。Bcl-2/Bax比值高抑制細(xì)胞凋亡，Bcl-2/Bax比值低促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]。MPTP開放而引發(fā)的線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換(mitochondrial permeability transition，MPT)作用可能是膽管細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[15-17]。 MPT作為死亡的閘門，可以造成線粒體基質(zhì)蛋白的滲透壓升高，從而導(dǎo)致基質(zhì)水腫、線粒體外膜損傷和線粒體雙膜間隙中的細(xì)胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子釋放到胞質(zhì)，細(xì)胞色素C進(jìn)入胞質(zhì)后，可水解Caspase-9酶原成Caspase-9，又進(jìn)一步水解Caspase-3酶原，最終引發(fā)Caspase-3的激活，從而導(dǎo)致DNA修復(fù)蛋白、細(xì)胞骨架蛋白及其他Caspase相關(guān)蛋白的裂解等一系列瀑布式級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[18]。而Bcl-2表達(dá)增加時，可以通過蛋白與蛋白作用，增強(qiáng)線粒體膜穩(wěn)定性，可減少細(xì)胞色素C等線粒體內(nèi)容物釋放入胞質(zhì)，從而避免Caspase-9活化以及Caspase-3的激活，以達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡的目的。④Bcl-2蛋白與線粒體內(nèi)ATP產(chǎn)量正相關(guān)，提示Bcl-2蛋白可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的能量代謝狀態(tài)，降低細(xì)胞凋亡的敏感性。有研究證實，Bcl-2的表達(dá)可阻止ATP下降時導(dǎo)致的細(xì)胞死亡。這可能也是Bcl-2抑制膽管細(xì)胞凋亡的一個方面[19]。

2肝缺血再灌注與膽汁淤積

2.1膽汁淤積原因

在復(fù)雜的肝臟外科手術(shù)中(如肝葉切除、肝移植等)，不可避免地要遭受肝臟缺血再灌注損傷，而這常常會導(dǎo)致膽汁淤積，術(shù)后產(chǎn)生高膽紅素血癥，肝功能衰竭等后果，成為影響疾病預(yù)后、手術(shù)成功率和患者存活率的主要原因。各種原因引起膽汁的形成、分泌和排泄障礙時均可導(dǎo)致膽汁淤積。膽汁淤積主要是指膽汁酸在肝臟或者血液中的濃度異常升高。而導(dǎo)致膽汁淤積的因素有很多方面，主要包括：①肝細(xì)胞性膽汁淤積，主要是由于肝細(xì)胞形成膽汁的功能性缺陷所導(dǎo)致的；②膽管性膽汁淤積，其最終成因是膽汁流動障礙，主要由于肝內(nèi)膽管或肝外膽管因結(jié)石或腫瘤閉阻導(dǎo)致膽汁淤積；③其他原因,如與細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑損傷、膜流動性降低細(xì)胞骨架、囊泡運(yùn)輸損傷緊密連接的缺陷有關(guān)[20]。

2.2缺血再灌注中膽管動力對膽汁淤積的影響

從膽管動力學(xué)對膽汁影響方面來看，膽汁主要由肝細(xì)胞形成后，首先排入毛細(xì)膽管，再由小葉間膽管進(jìn)入膽總管，其中膽小管是膽汁排泄的最小管道，在膽汁分泌過程中起著重要作用，膽汁在肝內(nèi)的排泄依賴于膽小管的收縮。黎一鳴等[21]現(xiàn)已證明膽小管微絨毛包含的纖維形肌動蛋白(Factin)微絲是促進(jìn)膽汁的排泄重要組織。Factin微絲連續(xù)地聚合與解聚作用能夠?qū)崿F(xiàn)膽小管的收縮，進(jìn)而促進(jìn)膽汁排泄。并且他們發(fā)現(xiàn)再灌注時可造成膽小管Factin微絲破壞、微絨毛喪失，導(dǎo)致膽小管收縮減弱，膽汁排泄功能受損。這可能導(dǎo)致肝臟缺血再灌注后膽汁淤積的發(fā)生。因此肝缺血再灌注時因膽小管的損傷可導(dǎo)致膽汁分泌減少、發(fā)生膽汁淤積。并且在肝臟缺血時，可以破壞膽道上皮細(xì)胞的膜性結(jié)構(gòu)；而再灌注產(chǎn)生的大量超氧陰離子，可以生成大量的氧自由基，造成線粒體損傷，從而導(dǎo)致膽道上皮的損傷，包括小膽管直徑變小，內(nèi)皮平均面積、微絨毛數(shù)量減少，這種形態(tài)學(xué)改變是肝移植術(shù)后早期發(fā)生膽管炎的原因，能導(dǎo)致膽管的狹窄，從而導(dǎo)致膽汁的淤積。

2.3缺血再灌注時膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)對膽汁淤積的影響

肝細(xì)胞和膽小管細(xì)胞膜上具有許多膽汁成分轉(zhuǎn)運(yùn)功能的蛋白質(zhì)分子，共同完成膽汁的形成和分泌，這些蛋白質(zhì)分子對抑制膽汁的淤積有著重要的作用。其中膽鹽輸出泵蛋白(bile salt export pump,BSEP)和多耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance-associated protein,MRP)是膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)過程中重要的兩個蛋白分子。這兩種蛋白表達(dá)異常是臨床上多種膽汁淤積性疾病的根本原因。

2.3.1BSEP對膽汁淤積的影響膽鹽輸出泵(BSEP)蛋白是肝臟特異性的轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白，只在肝細(xì)胞毛細(xì)膽管膜上表達(dá)，毛細(xì)膽管側(cè)細(xì)胞膜上的BSEP可以將被重吸收后的膽汁酸分泌到膽汁中，它在膽汁形成和肝臟功能的正常運(yùn)作中起著非常重要的作用，是膽小管內(nèi)膽汁分泌的主要輸出泵[22-23]，其表達(dá)及功能異常將導(dǎo)致臟膽汁分泌代謝異常，造成肝細(xì)胞內(nèi)膽汁淤積、血清膽汁酸鹽濃度升高等。而BSEP的轉(zhuǎn)錄激活與細(xì)胞內(nèi)法尼醇X受體(farnesoid X receptor,FXR) 含量密切相關(guān)： FXR能反式激活BSEP基因的啟動子，如在膽汁淤積條件下，通過FXR能直接活化人和其他動物BSEP基因，表達(dá)的BSEP可依賴ATP將膽汁酸通過肝細(xì)胞毛細(xì)膽管膜分泌至膽汁中。并且有研究報道[24-25]BSEP啟動子上含有FXR的反應(yīng)元件，這就可以使FXR直接結(jié)合在BSEP的啟動子上。同時通過滅活小鼠FXR將導(dǎo)致BSEP低水平表達(dá)，而這種低水平表達(dá)不能通過喂服膽酸誘導(dǎo)上調(diào)。這也就表明了，BSEP基因表達(dá)的誘導(dǎo)不是所有膽酸所具有的普遍特性，其與FXR配體特異性相關(guān)。作為疏水性膽汁酸和膽汁淤積癥潛在的誘導(dǎo)物石膽酸(lithocholic acid,LCA)是細(xì)胞內(nèi)法尼醇X受體(FXR)的拮抗劑，它能明顯降低BSEP的表達(dá)，使肝膽汁酸分泌減少，這也就導(dǎo)致了肝臟膽汁酸濃度增加，從而引起肝內(nèi)膽汁淤積癥發(fā)生及肝臟受損。這些結(jié)果提示我們作為FXR直接的靶基因的BSEP，只有其啟動子被FXR激活后，才能發(fā)揮膽汁成分的轉(zhuǎn)運(yùn)功能，預(yù)防膽汁的淤積[26-27]。

2.3.2Mrp對膽汁淤積的影響Mrp是位于多種極性細(xì)胞膜表面介導(dǎo)其底物依賴 ATP自細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外的一類膜糖蛋白， 膽紅素主要轉(zhuǎn)運(yùn)子Mrp2與Mrp3都是其中的成員。Mrp2主要表達(dá)在肝細(xì)胞基膜上，對膽汁內(nèi)所含的一些具有生物活性的重要有機(jī)陰離子共扼結(jié)合物的分泌起關(guān)鍵作用，負(fù)責(zé)膽紅素和其他膽汁成分的排泄。Mrp3存在于肝細(xì)胞基側(cè)膜，在正常肝臟中微弱表達(dá)，膽汁淤積時的表達(dá)顯著增高，能夠從肝細(xì)胞中排出結(jié)合膽鹽。目前已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，當(dāng)毛細(xì)膽管膜上Mrp2的轉(zhuǎn)運(yùn)功能缺乏或受限，將導(dǎo)致結(jié)合膽紅素從肝細(xì)胞向毛細(xì)膽管轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)生障礙[28]。此時肝細(xì)胞基底外側(cè)膜上的Mrp3表達(dá)上調(diào)，轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)合膽紅素反流入血，從而減少肝細(xì)胞中膽紅素的累積，但這導(dǎo)致了血中結(jié)合膽紅素水平升高，這在一定程度上會引發(fā)結(jié)合型高膽紅素血癥。并有研究表明，地塞米松在上調(diào)大鼠體內(nèi)Mrp2表達(dá)的同時下調(diào)Mrp3的表達(dá)，從而大大增加結(jié)合膽紅素的膽汁排泄，同時減少血中結(jié)合膽紅素[29]。因此我們認(rèn)為通過對Mrp2的調(diào)控也可以影響Mrp3的表達(dá)，從而促進(jìn)膽汁的排泄和預(yù)防高膽紅素血癥。吳曉平等[30]則證明，人肝組織中Mrp2表達(dá)的減弱使膽汁酸及其他有毒物質(zhì)排出體外的量減少，引起一些相關(guān)疾病的發(fā)生，可能與核受體RXRa、 RARa表達(dá)減弱有密切關(guān)系。這說明Mrp對膽汁的轉(zhuǎn)運(yùn)需要核受體的參與。

2.3.3缺血再灌注對BSEP和Mrp的影響B(tài)SEP、Mrp作為毛細(xì)膽管膜上的主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，分別將膽汁主要成分膽鹽膽紅素、葡萄糖醛酸酯轉(zhuǎn)運(yùn)入小膽管內(nèi)，這兩種蛋白表達(dá)異常是多種疾病中膽汁淤積的原發(fā)事件，而其參與的膽汁排泌是肝臟膽汁流形成的主要過程和限速步驟[31-32]。王召華等[33]已證明缺血再灌注損傷術(shù)后BSEP在肝細(xì)胞膜上表達(dá)下調(diào)，引起了膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌的減少，是膽汁淤積的重要機(jī)制；Mrp2蛋白在肝細(xì)胞膜上定位減少，且向胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，這種定位的改變導(dǎo)致了肝缺血再灌注后毛細(xì)膽管膜膽鹽的排泌障礙，也是再灌注后膽汁淤積的發(fā)生的重要原因之一。Donner等[34]也發(fā)現(xiàn)肝臟缺血再灌注后的膽汁淤積與缺血再灌注時導(dǎo)致的BSEP與Mrp2表達(dá)降低有著密切的關(guān)系。這提示我們?nèi)毖俟嘧⒖蓪?dǎo)致BSEP與Mrp表達(dá)異常，二者變化是膽汁淤積的重要原因，因此觀察其肝臟術(shù)后二者的變化情況可以有助于了解缺血再灌注后是否會有膽汁淤積的發(fā)生。

3總結(jié)與展望

肝臟的缺血再灌注可以抑制Bcl-2的表達(dá)，這會造成膽管細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致膽管的損傷，影響膽道的功能。而細(xì)胞內(nèi)膽汁淤積也可進(jìn)一步加強(qiáng)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)膽道的損傷[35]。膽管細(xì)胞凋亡與膽汁淤積之間有著緊密的聯(lián)系，對二者機(jī)制的研究可以使我們在肝臟外科中更好地預(yù)防術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生，從而提高手術(shù)成功率。盡管近年來此領(lǐng)域有不少進(jìn)展但許多問題仍未闡明，這有待于我們進(jìn)一步去研究。從蛋白水平研究膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)的過程能從根本上解釋因循環(huán)紊亂所產(chǎn)生的膽汁淤積性肝損傷，從而更好地為臨床工作提供依據(jù)。而對膽管細(xì)胞凋亡有抑制作用Bcl-2的蛋白是否會對膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有影響呢，需要我們更深入地去研究、探討。

肝臟缺血再灌注中對膽管細(xì)胞凋亡及膽汁淤積方面影響除了上述機(jī)制外，還存在很多我們未曾發(fā)現(xiàn)的機(jī)制，對其更加深入的研究，能更好地使我們在臨床中預(yù)防損傷的發(fā)生。相信通過大量的動物實驗及臨床實踐，我們可以更加深入了解肝臟缺血再灌注時的損傷機(jī)制及其影響因子在這些機(jī)制中的作用，從而更好地促進(jìn)臨床肝臟外科手術(shù)的發(fā)展。

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(編輯：周小林)

[收稿日期]2014-12-18[修回日期] 2015-01-11

doi:10.11659/jjssx.11E014048

[中圖分類號]R575

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1672-5042(2015)05-0568-04