張 健 綜述,林一民 審校

(重慶市腫瘤研究所臨床檢驗科 400030)

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·綜 述·

生物被膜的抗菌藥物耐藥機制及研究進展

張 健 綜述,林一民△審校

(重慶市腫瘤研究所臨床檢驗科 400030)

生物被膜； 感染； 耐藥機制

細菌生物被膜(BBF)常形成于導尿管、靜脈插管、腹膜透析插管、整形外科裝置、假肢、人工心臟瓣膜等植入性醫(yī)用器械表面和牙齒、壞死骨片、囊性纖維化的肺葉等場所。因為BBF其細菌對抗菌藥物及其他化學殺菌劑有比離散的細菌更強大的抵抗能力,故BBF的形成被認為是醫(yī)院院內感染的重要原因[1]。臨床上對BBF形成的本質原因及耐藥機制現(xiàn)還處在研究之中,越來越多的新技術，如分子生物學技術、電鏡掃描技術、激光顯微鏡及流式細胞技術的廣泛應用,這些新技術的發(fā)展應用使BBF的研究技術逐漸深入并變得更加成熟，對怎樣阻止BBF的形成及找到更合理應用的抗菌藥物是醫(yī)學面臨的重要課題。今對目前BBF的結構特點和對抗菌藥物耐藥機制的形成特征及機制研究綜述如下，為相關研究提供參考。

1 BBF的概念及結構特點

1.1 BBF的概念 BBF又稱為菌膜,是一些微小細菌為了適應外在生成環(huán)境,形成于其固體表面并不可逆地黏附于固相物質表面形成的一種特殊存在方式[2]。是細菌之間相互協(xié)調極其復雜的構成形式，是微菌落聚集物，蛋白質及多糖組成的復合物是其主要構成，是多細菌組成的膜狀結構，廣泛存在自然環(huán)境中，無論哪種細菌在成熟條件下都可形成BBF。細菌在一些惰性物質表面吸附，如輔助的醫(yī)學材料，當細菌在表面黏附后,被細胞分泌的基質成分包被,其細胞分泌的物質，如糖、蛋白、脂肪等多糖成分組成的復合物逐漸將細菌粘連起來，并形成膜狀物質。

1.2 BBF的結構特點 BBF是細菌在自然環(huán)境中出于本能而采取的一種存在方式，是一種功能特異生物群落，表多糖分子聚合物支持、保護BBF表面，內含水成分高達97%。有研究表明，BBF存在于各種主要的生物大分子，如糖、蛋白質、脂肪、DNA及RNA等。其突出的是具有特性的細胞功能，對營養(yǎng)物質廢物的運輸，可使遺傳上一致的細菌個體表現(xiàn)不同的特征。其復雜的空間構成，如起伏的群山一樣隆起的單體形成，單個獨立構成單位被劃分為3個部分，包括體、底和尾[3]。主要構建成分是由密度極高的表多糖組成，水氧分子及營養(yǎng)物質從最底層的管路通道進入BBF，細菌就位于其空間結構內部[4]。高密度表多糖分子起到了骨架和表面保護層的作用，能有效抵抗外界物質的壓力，幫助細菌群落進一步整合，在營養(yǎng)物質和氧集中的區(qū)域，有較多細菌存在[5-6]。除了表多糖，BBF中還存在有極大數(shù)量的人血清中蛋白質和細菌的代謝產(chǎn)物等，當遇上較強的外部壓力干擾，BBF形同蝌蚪樣的尾部形狀，這時從該處就會釋放出細菌，逐漸進入血液循環(huán)散布開來，導致菌血癥[3]。

2 BBF的形成和臨床鑒定方法

2.1 BBF的形成 BBF的形成全過程是一系列包括物理、生物及化學演變的進程過程，各個階段的形成因素與外界環(huán)境及力學流體等條件是緊密相連的。

2.1.1 細菌的黏附 細菌黏附是其獨特的黏附素蛋白能夠識別宿主的受體，它具有很強的特異性、選擇性。這種過程循環(huán)往復持續(xù)進行，呈動態(tài)變化。由蛋白質及糖類形成的膜狀結構形成于生物材料上，這里有很多蛋白定植于哺乳動物或細菌細胞受體所結合形成配體，當表面化學分子結構發(fā)生變化時，一些高分子材料就立即吸附在其表面[7];隨后，經(jīng)過特異受體所結合的配體黏附機制，細菌的細胞就在這些培養(yǎng)基表面進行黏附。

2.1.2 BBF的發(fā)展 細菌黏附后不久，調節(jié)其基因，分泌大量胞外多糖，通過正向調節(jié)，貼壁細胞的活動，在密度感應系統(tǒng)里，通過特定細胞的信號傳感作用，這些細胞分子與其他可感應的周圍細菌或細菌群落相結合[8]。這種正向調節(jié)的反應是由有毒力的因子引起，也包括細胞外一些聚合形成的物質進行分泌調節(jié)作用[9-10]。細胞外多糖分子的存在對BBF的構成起非常關鍵的作用，此時細菌對抗菌藥物及紫外線的抵抗力增強。

2.1.3 BBF的成熟 BBF通過消耗可溶性養(yǎng)分，吸收其他營養(yǎng)物質而成熟，這些營養(yǎng)物質來源包括一些細菌或哺乳動物的血小板等細胞，成熟BBF上的細菌可從黏附的血小板上脫落下來，這些脫落下來的細菌可分泌形成薄膜的糖蛋白類物質[11-13]。對不同環(huán)境和不同的菌種，在細菌進行增殖時，可逐步形成松緊不一和厚薄程度不一致的BBF構建體系。

2.2 BBF的鑒定 因為微小細菌菌落逐漸形成的BBF用肉眼不易直接觀察，需要經(jīng)過特殊的染色及放大過程處理才可以對BBF進行鑒定。從國內外的研究可以看出，銀染法成為目前最常用的染色方法。銀染法是將待測標本用硝酸銀溶液經(jīng)過浸泡處理,在普通光學顯微鏡下觀察和鑒定已經(jīng)著色的BBF的一種方法，它是一種快速染色法，能夠證明多糖蛋白類物質和BBF的存在[14]。相比電子顯微鏡和其他激光顯微鏡的鑒定方法更實用、方便、價廉，已經(jīng)得到廣泛的臨床應用[15]。

2.3 BBF的調控 BBF的形成過程受多種因素控制，BBF中的細胞相連密切，胞外信號濃度逐漸增高，使基因得到進一步調控，使BBF中形成了不同的多細胞克隆，并構成了具有結構性獨特的群體集合。其中革蘭陰性菌和陽性菌落群體感應系統(tǒng)的信號分子不同，這些有利于細菌適應環(huán)境壓力，是細菌基因調節(jié)的組成部分。

3 BBF的感染特征和耐藥機制

對疫苗及抗菌藥物的廣泛應用，加上各級干預措施的進行,由單一細菌引起的絕大多數(shù)具有感染性的疾病已能夠快速得到控制(除外多重耐藥細菌),現(xiàn)今人類由條件致病菌所致的感染日漸增多,特別是在抵抗力低下的情況下加上各種插入性醫(yī)用器械裝置的不斷應用。使各種感染頻繁出現(xiàn)并常與BBF的形成相關。病原微生物，如球菌、桿菌和念珠菌等最為常見。一旦形成BBF,就對抗菌藥物的抵抗力增強,使用常用抗菌藥物將很難徹底消滅，只能殺滅BBF表面或血液中引起感染產(chǎn)生的游離病原細菌。在環(huán)境改變和人體自身抵抗力降低時，BBF中還活著的細菌趁機得到釋放，引起新一輪感染發(fā)生。

3.1 BBF引起感染的特征 (1) 相對靜止和發(fā)作階段的相互轉化過程，使病情反復，轉為慢性;(2) 由于耐藥出現(xiàn)，抗菌藥物剛開始用時治療效果顯著,隨后其療效明顯下降;(3)導致疾病的微生物主要來自皮膚表面和所處環(huán)境,主要病原微生物包括葡萄球菌、腸道菌、假單胞菌屬等[16]。

3.2 BBF的耐藥機制

3.2.1 BBF的滲透屏障保護作用 BBF是阻止抗菌藥物進入細菌內部的天然屏障。其細胞外的糖蛋白分子形成屏障作用，能夠很好地阻礙酶、補體等大分子和抗菌藥物肽類等小分子物質的侵入[17]。滲透作用不僅可以降低BBF內抗菌藥物的濃度,也能幫助內酰胺酶使抗菌藥物作用失去活性。這種屏障作用和酶的降解效應共同發(fā)揮效應,使BBF耐藥性得到增強。不同的BBF對藥物的滲透阻止作用不盡相同，如銅綠假單胞菌形成的BBF對環(huán)丙沙星類藥物和對過氧化氫有屏障阻止作用，某些藥物能透過肺炎克雷伯菌形成BBF，如氨芐西林和環(huán)丙沙星。細胞外的多糖分子帶有正電離子，氨基糖苷類抗菌藥物也帶有正電離子，這種同種電荷效應加強了電荷屏障作用的強度，使抗菌藥物的滲透作用難以進行。

3.2.2 BBF內環(huán)境的影響 BBF突出特點是呈階梯梯度增加的營養(yǎng)物濃度,此種特征同藥物的抗藥性能力緊密相關。有研究表明,BBF 內營養(yǎng)物質缺乏或供應受限是細菌耐藥產(chǎn)生的重要因素之一[18]。由于細菌膜內部營養(yǎng)物質缺乏,致細菌緩慢生長;氧氣在BBF內很快被耗盡,使被膜內部形成厭氧環(huán)境,氨基糖苷類抗菌藥物,如氨基糖苷類藥物在厭氧情況下對細菌的抗菌作用不如有氧環(huán)境強;在局部積聚的細菌酸性代謝產(chǎn)物可致膜內外pH值形成顯著差異;致細菌滲透壓的變化，由于抗菌藥物對生長停滯細菌作用不顯著，一旦停用抗菌藥物，細菌繁殖力增強，造成感染復發(fā)，使BBF對抗菌藥物的滲透能力降低,綜合作用使BBF的生長情況受阻,進而產(chǎn)生耐藥[19-20]。

3.2.3 BBF表達的基因 已經(jīng)知道許多與BBF耐藥性相關的基因,如hipA B、mar、vlzcS、relA及sulA等基因。銅綠假單胞菌被Drenkard發(fā)現(xiàn)有一種能調節(jié)細菌變異的蛋白質(PvrR),PvrR能調控銅綠假單胞菌對抗菌藥物的敏感度,其對應基因PvrR在有生物膜的細菌里轉錄積極，它能抑制或激活PvrR對銅綠假單胞菌形成的BBF耐藥[21]。Whiteley等學者也發(fā)現(xiàn),銅綠假單胞菌的BBF中tolA基因有高表達效果，脂多糖的構造受tolA基因產(chǎn)物的影響,降低了氨基糖苷類抗菌藥物結合細菌細胞外膜的能力。進一步研究表明，這些調控基因的研究,有助于人們更深入認識BBF的耐藥機制，對預防生物被膜引起的疾病具有很重要的臨床價值[22-23]。

3.2.4 傳感效應的表達 細菌的傳感調控效應(QS)是相同或不同種類細菌對細菌目前所處環(huán)境、對群體感知、信息相互交流及發(fā)生各種反應的表現(xiàn)形式。不同種類的細菌及所用抗菌藥物的種類不同，QS在抗菌藥物耐藥性中的表現(xiàn)機制不盡相同。Davies等發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌中的突變株lasR、lasIQS無法形成正常的BBF結構。有研究結果表明，銅綠假單胞菌的突變株如QS對抗菌藥物和清潔劑無明確影響;新近報道對利福平敏感的金黃色葡萄球菌QS突變株,對苯唑西林卻不敏感，該突變株對利福平的敏感特性與之親代相比并無明顯差異[24-25]。所以，密度感應系統(tǒng)的耐藥機制還需更深入的研究。

3.2.5 BBF的獨特表型 在與醫(yī)用輔料接觸產(chǎn)生黏附和聚集時，細菌可能被誘導而形成一種膜的獨特表型結構,能夠識別膜內不同表達的基因,以阻止抗菌藥物的殺傷效果[26]。有研究發(fā)現(xiàn)，在低氧氟沙星濃度下,外排泵缺失株的BBF對氧氟沙星的敏感性明顯強于超表達株[27]。在抗菌藥物選擇壓力作用下,細菌可改變外膜蛋白(OmpS)，特別是膜上微孔蛋白的數(shù)量和組成，降低細菌體外膜的通透性,可有效阻止抗菌藥物進入菌體發(fā)揮作用而產(chǎn)生耐藥性。比如,腸道菌如大腸埃希菌的微孔蛋白主要有OmpF和OmpC等,與抗菌藥物通透性相關的是OmpF,假如因為表達水平的變化或缺失,可降低其通透性,使抗菌藥物無法進入細菌細胞內,進而可致細菌耐藥性產(chǎn)生。

4 BBF的防治和控制

4.1 生物被膜前控制 在BBF生成前需要選取足量和敏感的抗菌藥物,為了不因疾病進入慢性而形成BBF;在用醫(yī)用材料上選用低表面能和黏附力低的用品，最好不將這些醫(yī)療器械留于機體內而形成BBF。

4.2 生物被膜形成過程中控制 BBF的形成中浮游菌的調控→阻斷定植過程，從而抑制BBF黏附。可誘導BBF附著在它所需要的鞭毛、菌毛等連接性結構上，能致其細胞突變而不能與BBF黏附聚集?？辜毦じ胶途奂锊牧系氖褂茫梢种萍毦湫纬?，防止細菌黏附。對臨床常用的醫(yī)用導管器材不斷改進能夠極好地防止細菌黏附、復制和定植。亞抑菌藥物濃度的抗菌藥物可抑制最初時段黏附于醫(yī)用器材上的細菌及形成BBF。降解BBF的細胞外基質或通過噬菌體來達到抑制BBF形成。

4.3 阻斷BBF的屏障 比如多黏菌素這樣的抗菌藥物能夠通過破壞BBF的完整性及增大被膜的通透性能來實現(xiàn)抗菌效果。本研究已經(jīng)知曉很多種可增強膜通透性的物質，這些包括常用的抗菌藥物，如大環(huán)內酯類和氨基糖苷類等抗菌藥物。

4.4 其他控制BBF的方案 對抗菌藥物的聯(lián)合使用，如聯(lián)合使用小劑量的大環(huán)內酯類藥物與對BBF通透性較強的藥物，如氟喹諾酮類能治療與BBF相關的感染性疾病,現(xiàn)已取得了明顯效果。有研究表明,氟喹諾酮類加大環(huán)內酯類/磷霉素是目前最有效的治療生物被膜菌感染的方案[28]。

5 展 望

BBF的研究使微生物學發(fā)展邁出了重要一步，隨著抗菌藥物的廣泛使用，細菌的耐藥問題日益嚴重，如何合理利用抗菌藥物、研究BBF耐藥機制，控制細菌耐藥在臨床治療具有重要意義。BBF的臨床研究目前尚處在起步階段，還有很多方面的最基本問題尚需解決。比如BBF內細菌對抗菌藥物的耐藥機制至今都無一個正確清晰的依據(jù)，BBF的形成原因及形成過程、菌落群體如何分工其功能尚待進一步研究。伴隨著醫(yī)學生物技術的不斷進步和開發(fā)利用，對BBF的認識及控制必將進一步深入，最終必然會找到徹底征服生物被膜相關感染的方法。人類將更好地控制細菌感染。

[1]Costerton JW,Stewart PS,Greenberg EP.Bacterial Biofilms:a common cause of persistent infections[J].Science,1999,284(5418):1318-1322.

[2]Cerca N,Martins S,Pier GB.The relationship between inhibition of bacterial adhesion to a solid surface by subMICs of antibiotics and subsequent development of a biofilm[J].Res Microbiol,2005，156(5/6):650-655.

[3]Rodney MD.Biofilms survive almednanisms of chinically relevantm croogan[J].Clin Microbioly Rev，2008，15(2):167-193.

[4]祝劍虹,任建安.生物膜與血管內導管相關感染的機制[J].腸外與腸內營養(yǎng),2010,17(5):297-301.

[5]Cotter JJ,O′Gara JP,Mack D,et al.Oxygen-mediated regulation of biofilm development is controlled by the alternative sigma factor sigma(B) in Staphylococcus epidermidis.[J].Appl Environ Microbiol,2009,75(1):261-264.

[6]Nadell CD,Xavier JB,Foster KR.The sociobiology of biofms[J].FEMS Microbiol Rev,2008,33(1):206-224.

[7]Rosenberg M.Microbial adhesion to hydrocarbons:Twenty-five years of doin MATH[J].FEMS Microbiol Lett,2006，262(2):129-134.

[8]Bjarnsholt T,Givskov M.Quorum-sensing blockade as a strategy for enhancing host defences against bacterial pathogens[J].Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci，2007,362(1483):1213-1222.

[9]Otto M.Bacterial evasion of antimicrobial peptides by biofilm formation[J].Curr Top Microbiol Immunol,2006,306(2):251-258.

[10]Hall-Stoodley L,Stoodley P.Biofilm formation and dispersal and the transmission of human pathogens[J].Trends Microbiol,2005,13(7):7-10.

[11]Brunstedt MR,Sapatnekar S,Rubin KR,et al.Bacteria/blood/material interactions.I.Injected and preseeded slime-forming Staphylococcus epidermid is inflowing blood with biomaterials[J].J Biomed Mater Res,2008，29(4):455-466.

[12]Xavier Jde B,Picioreanu C,van Loosdrecht MC.A general description of detachment for multidimensional modelling of biofilms[J].Biotechnol Bioeng 2005,91(6):651-669.

[13]Wenzel RP.Health care-associated infections:Major issues in the early years of the 21st century[J].Clin Infect Dis,2007,45(1):85-88.

[14]王燕,佟金平，范琳，等.銀染法鑒定表皮葡萄球菌生物被膜[J].實用預防醫(yī)學,2009,16(2):548-549.

[15]佟金平，王鎮(zhèn)山,王燕,等.銀染法觀察葡萄球菌生物被膜[J].大連醫(yī)科大學學報,2009,31(5):613-615.

[16]屈常林,高洪,趙寶洪,等.細菌生物被膜與抗生素耐藥機制研究進展[J].動物醫(yī)學進展,2008,29(3):251-254.

[17]Kuchma SL,O′Toole GA.Surface induced and biofilm induced changes in gene expression[J].Curr Opin Biotechnol,2000,11(5):429-433.

[18]Donalan RM.Biofilms,microbial life on surfaces[J].Emerg Infect Dis,2002,8(9):881-890.

[19]Yao Y,Sturdevant DE,Otto M.Genomewide analysis of gene expression in Staphylococcus epidermids biofilms：insights into the pathophysiology epidermidis biofilms and the role of phenol-soluble modulins in formation of biofilm[J].J Infect Dis,2005,191(2):289-298.

[20]Moons P,Michiels CW,Aertsen A.Bacterial interactions in biofilms[J].Crit Rev Microbiol,2009,35(3):157-168.

[21]Estrela AB,Heck MG,Abraham WR.Novel approaches to control biofilm infections[J].Curr Med Chem,2009,16(12):1512-1530.

[22]Aparna MS,Yadav S.Biofilms:microbes and disease[J].Braz J Infect Dis,2008,12(6):526-530.

[23]Pitts B,Hamilton MA,Zelver N.A microtiter platescreening method for biofilm disinfection and removal[J].J Microbiol Methods,2003,54(2):269-276.

[24]McBain AJ.Chapter 4:In vitro biofilm models:an overview[J].Adv Appl Microbiol,2009,69(4):99-132.

[25]Monds RD,O′Toole GA.The developmental model of microbial biofilms:ten years of a paradigm up for review[J].Trends Microbiol,2009,17(2):73-87.

[26]Jakubovics NS.Talk of the town:interspecies communication in oral biofilms[J].Mol Oral Microbiol,2010,25(1):4-14.

[27]Raaijmakers JM,de Bruijn I,Nybroe O,et al.Natural functions of lipopeptides from Bacillus and Pseudomonas:more than surfactants and antibiotics[J].FEMS Microbiol Rev,2010,23(2):280-287.

[28]Kaplan JB.Biofilm dispersal:mechanisms,clinical implications,and potential the rapeutic uses[J].J Dent Res,2010,89(3):205-218.

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