牛艷君，李 瑩，白仲添，呂青芳，嚴(yán) 祥*

(蘭州大學(xué) 第一醫(yī)院 1.老年病科; 2.甘肅省生物治療與再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室; 3.腫瘤內(nèi)科, 甘肅 蘭州 740000)

?

短篇綜述

干細(xì)胞標(biāo)記及示蹤技術(shù)的應(yīng)用研究

牛艷君1，李 瑩2，白仲添2，呂青芳3，嚴(yán) 祥1*

(蘭州大學(xué) 第一醫(yī)院 1.老年病科; 2.甘肅省生物治療與再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室; 3.腫瘤內(nèi)科, 甘肅 蘭州 740000)

在基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用中，對干細(xì)胞遷徙路徑的標(biāo)記及在靶病灶的作用研究已成為重點(diǎn)。采用創(chuàng)新性、突破性的干細(xì)胞標(biāo)記及示蹤技術(shù)，了解干細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)的遷徙途徑，監(jiān)測和追蹤干細(xì)胞移植治療后的效果，對其在動物實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用方面都起到良好的促進(jìn)作用。

干細(xì)胞標(biāo)記；示蹤；遷徙途徑

近年來，隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)方法只能使許多器官損傷疾病減輕其并發(fā)癥，不能從根本上解決疾病的根本問題，患者的健康水平和生活質(zhì)量、精神狀態(tài)都遭受嚴(yán)重的威脅。醫(yī)學(xué)的進(jìn)步需要研究新的臨床治療手段，干細(xì)胞應(yīng)用于疾病的治療研究，為臨床事業(yè)帶來良好的應(yīng)用前景，并且得到了越來越多研究的證實(shí)，動物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)已取得令人鼓舞的研究成果。但是，干細(xì)胞在疾病治療用途中真正起作用的機(jī)制至今不明，干細(xì)胞的標(biāo)記方法及示蹤技術(shù)沒有明顯的突破性是其原因之一，為了更好地了解干細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)的遷徙途徑，本文對國內(nèi)外干細(xì)胞的發(fā)展、標(biāo)記及示蹤技術(shù)進(jìn)行了回顧和總結(jié)，為干細(xì)胞的基礎(chǔ)研究及作用機(jī)制的揭示起一定的支撐作用。

1 干細(xì)胞的標(biāo)記及示蹤技術(shù)

1.1 基因轉(zhuǎn)染標(biāo)記法

在干細(xì)胞上標(biāo)記轉(zhuǎn)染基因，檢測干細(xì)胞移植后的生物學(xué)特性。綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)標(biāo)記干細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)中尤為常見。GFP不需要與其他物質(zhì)合作，只需要用藍(lán)光照射，就能自我發(fā)光。GFP的熒光穩(wěn)定，易于構(gòu)建載體、可進(jìn)行活細(xì)胞定時(shí)定位觀察、在許多動植物中都能夠表達(dá)成功并發(fā)出熒光，可用顯微鏡呈像技術(shù)方便地在活細(xì)胞中檢測，適用與其他熒光試劑同時(shí)進(jìn)行雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)。GFP對干細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記最明顯的優(yōu)勢是無需底物或輔因子參與，即可在活細(xì)胞或動物中進(jìn)行有效地標(biāo)記，GFP已成功地靶入了大部分細(xì)胞器中[1]。目前，GFP的具體半衰期還未知，不利于在實(shí)驗(yàn)中對時(shí)間的掌控，并且一些物理因素如高溫等；化學(xué)因素有強(qiáng)酸等可以破壞它水化層或雙電層，對其進(jìn)行降解。

1.2 熒光染料標(biāo)記法

干細(xì)胞移植前，使用熒光素進(jìn)行預(yù)先標(biāo)記，移植后利用熒光顯微鏡觀察熒光標(biāo)記的干細(xì)胞的遷徙情況，目前以Dil的衍生物CM-Dil的標(biāo)記更為高效。CM-Dil通過與膜結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)分子結(jié)合而標(biāo)記細(xì)胞，有著強(qiáng)而穩(wěn)定的紅色熒光，它容易嵌進(jìn)生物質(zhì)膜內(nèi)并在膜內(nèi)做定向擴(kuò)散運(yùn)動從而標(biāo)記整個(gè)細(xì)胞，是目前最好的熒光染料[2]。CM-Dil標(biāo)記細(xì)胞后再進(jìn)行各種操作都不會影響其熒光，是免疫熒光組化和原位雜交中理想的細(xì)胞熒光標(biāo)記染料。CM-Dil標(biāo)記后熒光在胞內(nèi)表達(dá)穩(wěn)定，陽性標(biāo)記率高，標(biāo)記細(xì)胞形態(tài)良好，能有效地觀察細(xì)胞在體外的誘導(dǎo)分化情況[3]。但是，CM-Dil是通過細(xì)胞膜進(jìn)行標(biāo)記，隨著細(xì)胞的分裂增殖造成熒光的指數(shù)級衰減，使其很難維持長時(shí)間的高標(biāo)記率。

1.3 熒光原位雜交標(biāo)記法

熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)方法，即制備DNA或RNA 探針，通過原位雜交的方法，使特定的DNA或RNA序列在細(xì)胞或染色體上顯示出來，使用熒光顯微鏡檢測，最后對其結(jié)果進(jìn)行分析。FISH技術(shù)[4]使用經(jīng)濟(jì)、增強(qiáng)了安全性，簡化操作流程、效率高和定位準(zhǔn)確。多色FISH通過在同一個(gè)核中顯示不同的顏色可同時(shí)檢測多種序列，既可以在載玻片上顯示中期染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)的變化，也可以在懸液中顯示間期染色體DNA的結(jié)構(gòu)。熒光原位雜交技術(shù)對即時(shí)發(fā)現(xiàn)腫瘤和預(yù)后都有良好的指導(dǎo)作用。但是，該方法不能達(dá)到100%雜交，特別是在應(yīng)用較短的cDNA探針時(shí)效率明顯下降。

1.4 核酸標(biāo)記法

5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Brdu)是一種嘧啶類似物，與內(nèi)源性胸腺嘧啶核苷競爭插入DNA中，經(jīng)過免疫組化染色，跟隨標(biāo)記細(xì)胞增殖傳代，反映細(xì)胞增殖并且跟蹤檢測移植細(xì)胞動態(tài)變化[5]。核素標(biāo)記法避免了放射性污染, 安全性高，并且Brdu抗體不與胸腺嘧啶發(fā)生交叉反應(yīng)，對活體動物進(jìn)行標(biāo)記時(shí)，無任何不良反應(yīng)。在研究干細(xì)胞體內(nèi)移植后的分化時(shí), 更可采用雙標(biāo)法顯示干細(xì)胞的其他特性。但是，Brdu標(biāo)記存在著標(biāo)記率不穩(wěn)定的特點(diǎn)，隨著標(biāo)記時(shí)間的增長，細(xì)胞的凋亡，吞噬細(xì)胞的吞噬作用，周圍細(xì)胞也可能會被Brdu標(biāo)記，移植細(xì)胞標(biāo)記強(qiáng)度降低或丟失，從而很難測定出真正需要檢測觀察的干細(xì)胞。

1.5 磁共振成像技術(shù)

磁共振(Nuclear Magnetic Resonance, NMR)活體示蹤SPIO細(xì)胞已經(jīng)成為新的研究熱點(diǎn)。在體外使用SPIO對干細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，經(jīng)過轉(zhuǎn)染劑修飾后進(jìn)一步提高細(xì)胞的有效磁標(biāo)記率，含鐵顆粒即可進(jìn)入移植細(xì)胞內(nèi)，標(biāo)記率可達(dá)到99%[6]。在一定的濃度范圍內(nèi)，鐵顆粒對細(xì)胞的活性沒有明顯的影響，然后利用磁共振成像對干細(xì)胞進(jìn)行追蹤，根據(jù)其位置的改變和信號的衰減從而判斷干細(xì)胞的增殖、移行和空間分布情況，SPIO納米顆粒標(biāo)記技術(shù)逐漸成熟[7]。但是，實(shí)驗(yàn)過程中，細(xì)胞增生分裂死亡，氧化鐵微粒會殘留在死亡的組織內(nèi)或者被巨噬細(xì)胞吞噬，會導(dǎo)致標(biāo)記敏感性下降，造成假陽性結(jié)果，同時(shí)，需要考慮氧化鐵造影劑顆粒對機(jī)體所產(chǎn)生的長期影響。

1.6 近紅外熒光成像技術(shù)

半導(dǎo)體量子點(diǎn)(Quantum Dots, QDS)為現(xiàn)在廣泛使用的近紅外熒光材料，QDS具有寬而連續(xù)的吸收譜，光漂白性小，可進(jìn)行活體內(nèi)示蹤成像和長時(shí)間觀察；同時(shí)，觀察標(biāo)記的干細(xì)胞不需要注入其他的試劑或酶等，相對要方便許多。采用深紅色熒光(DiR)對移植入動物體內(nèi)干細(xì)胞的狀況進(jìn)行評估，清楚地看到干細(xì)胞從動物的脾臟移行到肝臟[8]。近紅外熒光成像技術(shù)生物穿透能力強(qiáng)、光子量探測域值低、檢測靈敏度高，在干細(xì)胞示蹤標(biāo)記中展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。但是半導(dǎo)體量子點(diǎn)等無機(jī)染料對人類有一定不良反應(yīng)，如何在不降低量子點(diǎn)分辨率的前提下，降低不良反應(yīng)是近紅外熒光成像技術(shù)開發(fā)研究的重點(diǎn)。

1.7 Y染色體標(biāo)記示蹤

Y染色體是屬于XY性別決定系統(tǒng)雄性個(gè)體的特異性基因結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定而持久存在，針對Y染色體上特異的基因序列進(jìn)行標(biāo)記，制備探針，可以對標(biāo)記的干細(xì)胞進(jìn)行長久的示蹤，移植入雌性動物體內(nèi)，利用性別的差異對干細(xì)胞進(jìn)行識別,隨后若檢測雌性受體動物靶區(qū)域含有Y染色體，則證明該細(xì)胞為移植進(jìn)來的外源性供體細(xì)胞，不需要對干細(xì)胞進(jìn)行額外的實(shí)驗(yàn)處理，優(yōu)勢明顯。但Y染色體的穩(wěn)定性和靈敏度還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的研究和驗(yàn)證。

1.8 常染色體標(biāo)記示蹤

標(biāo)記染色體是在腫瘤細(xì)胞內(nèi)常見到結(jié)構(gòu)異常的染色體，具有有特殊的形態(tài)，且便于識別。將干細(xì)胞某一性狀定位于動物染色體的一特定區(qū)域，根據(jù)標(biāo)記染色體的特異性去檢測干細(xì)胞。這種方法尚未在干細(xì)胞移植的動物實(shí)驗(yàn)和臨床研究中使用，還需要完善的理論和大量的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行證實(shí)。

1.9 循環(huán)細(xì)胞(CellSearch)標(biāo)記示蹤

CellSearch系統(tǒng)[9]是目前自動化程度最高的CTCs檢測技術(shù)，受人為因素影響較小，該系統(tǒng)集免疫磁珠富集技術(shù)和免疫熒光技術(shù)于一體，具有較高的特異性和可重復(fù)性，能夠?qū)崟r(shí)反應(yīng)腫瘤的生物狀態(tài)，動態(tài)識別腫瘤分子靶點(diǎn)，為患者個(gè)體化治療提供可靠的理論基礎(chǔ)和臨床證據(jù)[10]。如果使用這項(xiàng)技術(shù)，能夠?qū)?biāo)記干細(xì)胞進(jìn)行動態(tài)示蹤，就能夠?qū)崟r(shí)檢測干細(xì)胞，干細(xì)胞標(biāo)記及示蹤的研究將會出現(xiàn)新的領(lǐng)域。

2 干細(xì)胞標(biāo)記及示蹤技術(shù)的總結(jié)與展望

研究創(chuàng)新性、突破性的干細(xì)胞標(biāo)記示蹤技術(shù)，有助于進(jìn)一步了解干細(xì)胞發(fā)揮功能的機(jī)制，從而使其轉(zhuǎn)化為有效的臨床應(yīng)用治療。理想的干細(xì)胞標(biāo)記方法應(yīng)具有簡單易行、特異性強(qiáng)、靈敏度高、無明顯毒性、受外界干擾因素小和假陽性率低等特點(diǎn)。當(dāng)前，成熟的干細(xì)胞標(biāo)記示蹤技術(shù)方法眾多，但每一種方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)，干細(xì)胞移植后，難以對移植后細(xì)胞的功效做客觀準(zhǔn)確的評價(jià)。目前，一些特異性和標(biāo)志性的標(biāo)記及示蹤技術(shù)需要進(jìn)一步深入研究，這將有助于了解干細(xì)胞在機(jī)體的遷徙途徑、存活時(shí)間、相互作用以及改善組織微環(huán)境的影響因子。

[1] Tang L, Chang J. Effect of GFP-containing lentivirus infection on the expression of octamer transcription factor 4 in human umbilical cord mesenchymal stem cells [J]. Cell Mol Biol, 2013, 29: 292- 296.

[2] Golab K, Kizilel S, Bal T,etal. Improved coating of pancreatic islets with regulatory T cells to create local immunosuppression by using the biotin-polyethylene glycol-succinimidyl valeric acid ester molecule [J]. Transpl Proc, 2014, 46: 1967- 1971.

[3] Li CZ, Xiao JM, Chen LX,etal. Isolation, culture and CM-Dil labeling of rat mesenchymal stem cellsinvitro[J]. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu, 2014, 18: 39- 44.

[4] Terai M, Izumiyama-Shimomura N, Aida J,elal. Arm-specific telomere dynamics of each individual chromosome in induced pluripotent stem cells revealed by quantitative fluorescence in situ hybridization [J]. Tissue Cell, 2014, 46: 470- 476.

[5] Sauerzweig S, Baldauf K, Braun H,etal. Time-dependent segmentation of BrdU-signal leads to late detection problems in studies using BrdU as cell label or proliferation marker [J]. J Neurosci Methods, 2009, 177: 149- 159.

[6] Chickera S, Willert C, Mallet C,etal. Cellular MRI as a suitable, sensitive non-invasive modality for correlatinginvitromigratory efficiencies of different dendritic cell populations with subsequent immunological outcomes [J]. Int Immunol, 2012, 24: 29- 41.

[7] Struys T, Ketkar-Atre A, Gervois P,etal. Magnetic resonance imaging of human dental pulp stem cellsinvitroandinvitro[J]. Cell Transplant, 2013, 22: 1813- 1829.

[8] Ezzat T, Dhar DK, Malago M,etal. Dynamic tracking of stem cells in an acute liver failure model [J]. World J Gastroenterol, 2012, 18: 507- 516.

[9] Sastre J, Maestro ML, Gomez-Espana A,etal. Circulating tumor cell count is a prognostic factor in metastatic colorectal cancer patients receiving first-line chemotherapy plus bevacizumab: a spanish cooperative group for the treatment of digestive tumors study [J]. Oneologist, 2012, 17: 947- 955.

[10] Broersen LH, van Pelt GW, Tollenaar RA,etal.Clinical application of circulating tumor cells in breast cancer [J]. Cell Oncol (Dordr), 2014, 37: 9- 15.

Application research on stem cell marker and cell tracing

NIU Yan-jun1, LI Ying2, BAI Zhong-tian2, Lü Qing-fang3, YAN Xiang1*

(1.Dept. of Geriatrics; 2.Key Laboratory of Biotherapy and Regenerative Medicine; 3.Dept. of Oncology, the First Hospital of Lanzhou University, Lanzhou 740000, China)

In the basic and clinical researches, the tracing methods and its effects of stem cells is targets have been of the focusing issue. Hence, it’s critical to create innovative and breakthrough methods for stem cell marker and cell tracing, to explore the migration routes and its reciprocity with microenvironment targets in the body, to monitor and track the outcome after stem cell transplantation therapy, it will play a good role in promoting animal experiment and clinical applications.

stem cells marker; cell tracing; migratory pathways

2014- 11- 06

2014- 12- 29

甘肅省科技重大專項(xiàng)(2013GS08977)；甘肅省自然科學(xué)研究基金(1208RJZA219)；中央高校自由探索面上項(xiàng)目(lzujbky- 2012- 167)

1001-6325(2015)04-0528-03

R- 331

A

*通信作者(corresponding author)：yanxiang528@suhu.com