李 強，靳書濱，陳 晶，王 杰，霍韶軍，張瑞剛

(1.邯鄲市中心醫(yī)院泌尿外科，河北 邯鄲 056001；2.河北聯(lián)合大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 唐山 063015)

刺五加注射液預(yù)處理在大鼠腎缺血再灌注損傷中的抗氧化作用及其對腫瘤壞死因子-α的影響

李 強1，靳書濱1，陳 晶2，王 杰1，霍韶軍1，張瑞剛1

(1.邯鄲市中心醫(yī)院泌尿外科，河北 邯鄲 056001；2.河北聯(lián)合大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 唐山 063015)

目的 探討刺五加注射液(Aeanthopanax senticosus，AS)預(yù)處理對大鼠腎缺血再灌注損傷(Ischemia reperfusion injury，IRI)的保護作用及其機制。方法本實驗于2014年3～6月選用36只健康雄性SD大鼠隨機分為對照組(Control組)、缺血再灌注組(IRI組)和刺五加注射液組(AS組)，每組12只，三組組內(nèi)再按5 h、10 h 2個時間點分為兩組，共6組，每組6只。采用單動脈夾閉法構(gòu)建大鼠急性腎IRI模型。Control組術(shù)中僅切除右腎，不夾閉左腎動脈，IRI組和AS組切除大鼠右腎，夾閉左側(cè)腎動脈45 min后解除夾閉。AS組于術(shù)前5 d及術(shù)前0.5 h給予1次AS(100 mg/kg)腹腔注射，Control組及IRI組則給予同等劑量的生理鹽水。檢測各組大鼠血清肌酐(Scr)、超氧化物岐化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的含量。結(jié)果AS組、IRI組與對照組比較，Scr水平均明顯升高(P＜0.05)，血清SOD活性降低，血清MDA、TNF-α水平增加(P＜0.05)。AS組的Scr、MDA、TNF-α均比IRI組低(P＜0.05)，而SOD水平升高(P＜0.05)。結(jié)論AS對腎臟缺血再灌注損傷具有保護作用，其機制可能是通過抗氧化、抑制炎癥反應(yīng)作用實現(xiàn)的。

刺五加注射液；腎缺血再灌注損傷；超氧化物歧化酶；丙二醛；腫瘤壞死因子-α

實驗表明[1-2]，腎缺血后組織血液再灌注引起的氧化損傷及炎癥級聯(lián)反應(yīng)是導(dǎo)致?lián)p傷的重要因素，其中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)在其中起著重要的作用。本實驗通過成功構(gòu)建大鼠腎IRI模型，觀察AS預(yù)處理對大鼠腎IRI后靜脈血中TNF-α、丙二醛(MDA)、超氧化物岐化酶(SOD)及血清肌酐(Scr)的影響，以探討其抗腎IRI的機理。

1 材料與方法

1.1 動物 選用普通級健康SD大鼠36只，8～10周齡，體重210～220 g。實驗時動物的飼養(yǎng)和取材嚴(yán)格按照實驗動物管理和保護的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

1.2 藥品與試劑 刺五加注射液，黑龍江烏蘇里江制藥廠生產(chǎn)，每支100 ml，含總黃酮300 mg。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒，由南京建成生物工程研究所提供；大鼠腫瘤壞死因子(TNF)-αELISA試劑盒由武漢博士德生物公司提供。

1.3 方法

1.3.1 動物分組 普通級健康雄性SD大鼠36只，實驗分六組，把36只SD大鼠按體重編號后，由隨機數(shù)字表產(chǎn)生36個隨機數(shù)字，將其除以6，將動物根據(jù)余數(shù)的不同平均分在6個組中(Control 5 h組、Control 10 h組、IRI 5 h組、IRI 10 h組、AS 5 h組、AS 10 h組)。

1.3.2 造模方法 采用阻斷單一腎動脈法構(gòu)建大鼠腎IRI模型。術(shù)區(qū)消毒鋪巾，取上腹正中直切口打開腹腔，然后應(yīng)用肝素鹽水2 ml(肝素200 U/ml)注入腹腔，大約10 min后便可致全身肝素化，牽開腸管，打開側(cè)腹膜，探及右側(cè)腎臟，顯露并結(jié)扎腎蒂后切除右腎，然后分離左腎蒂，顯露左腎動、靜脈；對照組將腸管復(fù)位，關(guān)閉腹腔，縫合腹壁，計時45 min后再次開腹，觀察左腎，再次關(guān)腹并計時，分別于5 h、10 h后取標(biāo)本。對IRI組及AS組大鼠用無創(chuàng)動脈夾將左腎動脈夾閉，腎臟呈現(xiàn)紫黑色，并記時開始，縫合腹壁，45 min后，再次打開腹腔，松開血管夾恢復(fù)血流，并開始記錄再灌注時間(各組分別于再灌注5 h、10 h后取血)。如腎臟顏色從黑色逐漸變?yōu)榧t色表明模型建立成功，建模過程見圖1，如果5 min后顏色未轉(zhuǎn)變，則造模失敗。

圖1 建模過程

1.3.3 給藥方法 AS組大鼠于術(shù)前5 d，每天1次及術(shù)前30 min給予AS腹腔注射(按大鼠體重100 mg/kg)；Control、IRI組于相同時間腹腔注射與AS等量的生理鹽水。

1.4 檢測指標(biāo)與方法 取各組大鼠血漿離心，取上清，送邯鄲市中心醫(yī)院檢驗科全自動生化分析儀檢測Scr；按試劑盒說明書提供方法檢測大鼠血清MDA含量，SOD活性；取大鼠血漿，離心后取上清液，按ELISA試劑盒自帶說明書進(jìn)行血清TNF-α含量的檢測。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)為計量資料，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示集中和離散趨勢，數(shù)據(jù)建立EXCEL數(shù)據(jù)庫，采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。在5 h、10 h兩個時間點進(jìn)行比較(每個時間點有三個組)，每三組之間比較采用單因素方差分析(ANOA)，三組中每兩組之間比較采用LSD法；IRI 5 h組和IRI 10 h組之間比較采用t檢驗。取α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 不同時間點各組大鼠血清Scr水平比較 (1) IRI組、AS組Scr水平與對照組相比明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；(2)AS組Scr水平均低于IRI組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。(3)IRI 5 h組和IRI 10 h組相比較，IRI 10 h組Scr水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 不同時間點各組大鼠血清Scr水平比較(n=6，±s)

注：a表示與對照組比較，P＜0.05；b表示與IRI組相同時間點比較，P＜0.05；c表示與IRI 5 h組比較，P＜0.05。

組別 例數(shù)Scr(μmol/L) Control 5 h組649.31±5.1 Control 10 h組648.43±4.9 IRI 5 h組6157.40±16.78aIRI 10 h組6225.36±19.75acAS 5 h組6105.41±9.69abAS 10 h組6109.41±9.8ab

2.2 不同時間點各組大鼠血清MDA含量和SOD活性比較 (1)IRI組、AS組與對照組相比，血清SOD活性均明顯降低，而MDA含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；(2)IR I 5 h和IRI 10 h組比較，IRI 10 h組血清SOD活性明顯降低，MDA含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；(3)AS組大鼠血清中SOD活性比IRI組均明顯升高，MDA含量均下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

表2 不同時間點各組大鼠雪晴MDA含量和SOD活性比較（n=6,±s）

表2 不同時間點各組大鼠雪晴MDA含量和SOD活性比較（n=6,±s）

注：a表示與對照組比較，P＜0.05；b表示與IRI組相同時間點比較，P＜0.05；c表示與IRI 5 h組比較，P＜0.05。

組別Control 5 h組Control 10 h組IRI 5 h組IRI 10 h組AS 5 h組AS 10 h組例數(shù)6 6 6 6 6 6 SOD(U/mg) 111.6±9.96 127.45±7.35 58.21±6.15a45.62±5.75ac80.34±5.52ab66.89±6.25abMDA(nmol/mg) 9.07±1.14 8.3±1.24 28.35±3.35a42.41±5.33ac15.25±2.15ab13.45±2.01ab

2.3 不同時間點大鼠血清TNF-α水平比較 (1) IRI組、AS組與對照組相比均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；(2)AS組與IRI組相比，TNF-α均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；(3)IRI 10 h和IRI 5 h組比較，IRI 10 h組TNF-α含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表3。

表3 不同時間點各組大鼠血清TNF-α水平比較(n=6，±s)

表3 不同時間點各組大鼠血清TNF-α水平比較(n=6，±s)

注：a表示與對照組比較，P<0.05；b表示與IRI組相同時間點比較，P<0.05；c表示與IRI5h組比較，P<0.05。

組別Control 5 h組Control 10 h組IRI 5 h組IRI 10 h組AS 5 h組AS 10 h組6 6 6 6 6 6 65.48±5.69 74.96±10.40 107.34±10.48a136.08±9.75ac85.95±6.8ab99.02±11.28ab例數(shù)TNF-α含量(pg/ml)

3 討論

自由基的化學(xué)性質(zhì)極為活潑，易于失去電子(氧化)或獲得電子(還原)，參與體內(nèi)的電子轉(zhuǎn)移和物質(zhì)代謝。生理情況下，細(xì)胞存在的抗氧化物質(zhì)(如SOD等)可及時清除自由基，使自由基的生成與降解處于動態(tài)平衡，對機體并無有害影響。腎IRI后，在缺血期組織含氧量減少，作為電子受體的氧不足，再灌注恢復(fù)組織氧供應(yīng)，也提供了大量電子受體，通過黃嘌呤氧化酶等途徑，使氧自由基在短時間內(nèi)爆發(fā)性增多，由于活性氧生成過多或機體抗氧化能力不足，可引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)。氧自由基一旦生成，即可經(jīng)其中間代謝產(chǎn)物不斷擴展生成新的自由基，形成連鎖反應(yīng)。自由基可與各種細(xì)胞成分，如膜磷脂、蛋白質(zhì)、核酸等發(fā)生反應(yīng)，造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷和功能代謝障礙。自由基引起的脂質(zhì)過氧化過程中可生成多種醛類產(chǎn)物，其中以對MDA的研究最多。MDA可以作為交聯(lián)劑促進(jìn)核酸、蛋白質(zhì)及磷脂的交聯(lián)，改變生物大分子的功能。通過檢測MDA的含量可以反映脂質(zhì)過氧化的程度。體內(nèi)SOD活性增加就會增加對抗氧自由基的作用，使得脂質(zhì)過氧化反應(yīng)減少，常將SOD活力的測定與MDA含量的測定相配和。有研究證實刺五加中含有的多種抗氧化劑可通過不同途徑發(fā)揮作用，顯示出多組分協(xié)同抗氧化的優(yōu)勢[3-6]。本研究結(jié)果顯示，AS預(yù)處理明顯降低了血清MDA含量，增強SOD活性，使Scr水平下降，說明AS對大鼠IRI的腎臟有一定的保護作用，其機制可能與它的有效抗氧化成分有關(guān)。

近年來的研究表明，白細(xì)胞激活介導(dǎo)的微血管損傷在IRI的發(fā)病中起重要作用。IRI可使白細(xì)胞聚集和激活，激活的中性粒細(xì)胞可釋放TNF-α、IL-1和IL-6，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞表面粘附分子暴露，兩者的親和力增強，結(jié)果造成微血管損傷。激活的中性粒細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞可釋放大量的致炎物質(zhì)，使周圍組織細(xì)胞受到損傷，導(dǎo)致局部炎癥反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，腎IRI發(fā)生后在TNF-α等細(xì)胞因子及活性氧代謝產(chǎn)物刺激下，ICAM-1表達(dá)增強，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞在局部集聚，進(jìn)而造成器官功能損傷[7-8]。從本實驗可以看出，當(dāng)大鼠遭遇急性腎IRI后血清TNF-α明顯增加，而且在損傷后初期的一段時間(5 h、10 h)，TNF-α呈逐漸升高趨勢。AS預(yù)處理后血清TNF-α、Scr下降，腎功能得到了好轉(zhuǎn)。

由此我們可以推測AS預(yù)處理起保護作用的機理可能是其具有抗氧化作用，減輕IRI后對組織的過氧化損傷。起保護作用的另一途徑可能是通過抑制其炎癥反應(yīng)的某些環(huán)節(jié)，使得炎性反應(yīng)損傷減輕，炎性因子表達(dá)減少，或者可能有部分直接抑制TNF-α表達(dá)的功能，TNF-α作為重要的炎癥始動因子受到抑制，那么由它介導(dǎo)和趨化的相關(guān)炎性級聯(lián)擴大反應(yīng)損傷就受到抑制，從而減輕腎IRI。然而腎缺血再灌注損傷機制復(fù)雜，還需要進(jìn)一步觀察AS預(yù)處理對其他炎性因子的影響，探討其作用機制。

[1]Manuela G,Verstrepen WA,Nouwen EJ,et al.Inflammatory cells in renal regeneration[J].Renal Failure,1996,18(3):355-375.

[2]Friedewald JJ,Hamid R.Inflammatory cells in ischemic acute renal failure[J].Kidney Int,2004,66(2):486-491.

[3]劉文闖,劉春明,陸 娟,等.刺五加葉中總黃酮的分離提取及抗氧化活性研究[J].遼寧中醫(yī)雜志,2011,38(8):1622-1625．

[4]Sparg SG,Light ME,van Staden J.Biological activities and distribution of plant saponins[J].J Ethnopharmacol,2004,94(23):219-243.

[5]海春旭.自由基醫(yī)學(xué)[M].西安:第四軍醫(yī)大學(xué)出版社,2006: 107-108.

[6]孟宇竹,雷昌貴,王 霞,等.SOD抗氧化作用及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J].中國食品添加劑,2009,1:134-137.

[7]Leslie JA,Meldrum KK.The role of interleukin-18 in renal injury [J].J Surg Res,2008,145(1):170-175.

[8]Huang Y,Rabb H,Womer KL.Ischemia-reperfusion and immediate T cell responses[J].Cell Immunol,2007,248(1):4-11.

Effect of aeanthopanax senticosus on antioxidants and serum TNF-α during acute renal ischemia-reperfusion injury in rats.

LI Qiang1,JIN Shu-bin1,CHEN Jing2,Wang Jie1,HUO Shao-jun1,ZHANG Rui-gang1.1.Department of Urology,Handan Central Hospital,Handan 056001,Hebei,CHINA;2.College of Life Sciences,Hebei United University,Tangshan 063015,Hebei,CHINA

Objective To observe the protective effect of aeanthopanax senticosus(AS)and discuss its possible mechanism on rats with acute renal ischemia-reperfusion injury(IRI).MethodsThirty-six healthy male SD rats from Mar.2014 to Jun.2014 were randomly divided into six groups:Control 5 h group(n=6),Control 10 h group(n= 6),IRI 5 h group(n=6),IRI 10 h group(n=6),AS 5 h group(n=6),AS 10 h group(n=6).Rat models with acute renal IRI were constructed by single-artery occlusion.The rats of Control(5 h,10 h)group only had resection of the right kidney.The IRI(5 h,10 h)group and AS(5 h,10 h)group were removed right kidney,and the left renal were occlusived by small vascular clamp for 45 min.AS group rats was injected intraperitoneally 5 days and 30 min before surgery by AS 100 mg/kg;Control group and IRI group were given intraperitoneal injection by saline equivalent as AS group in mean time.The levels of serum creatinine(Scr),superoxide dismutase(SOD),malonaldehyde(MDA),tumor necrosis factorα(TNF-α)were measured.ResultsCompared with the control group,the levels of Scr in IRI group and AS group were significantly elevated(allP＜0.05).SOD activity of serum in IRI group and AS group descended significantly,but MDA and TNF-αcontents increased significantly(allP＜0.05).In AS group,SOD activity of serum was stepped up,but the levels of Scr,MDA and TNF-αdecreased,which showed significant difference compared with IRI group(allP＜0.05).ConclusionAS pretreatment has a protective effect on rats with acute renal IRI,which might be realized by antioxidation and inhibiting inflammatory reaction.

Aeanthopanax senticosus;Renal ischemia reperfusion injury;Superoxide dismutase(SOD); Malonaldehyde(MDA);Tumor necrosis factorα(TNF-α)

R-332

A

1003—6350（2015）07—0941—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.07.0338

2014-09-24)

邯鄲市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計劃項目（編號：1423108062-4）

李 強。E-mail：xinghuoliqiang@163.com