郭寶帥，劉秀河*

（齊魯工業(yè)大學輕工學部 食品科學與工程學院，山東 濟南 250353）

“發(fā)泡酒”是以乳清作為原料，利用酸奶生產(chǎn)技術與啤酒技術而制成的一種低醇、含二氧化碳高級乳制飲品，是將現(xiàn)代生物技術應用到飲料中的一次嘗試。乳酸菌降解奶中的乳糖、蛋白質以及脂肪，產(chǎn)生易于吸收的單糖、揮發(fā)脂肪酸和游離氨基酸等代謝物，為酵母菌提供了能量來源。酵母菌能賦予飲料特殊的酒香味與二氧化碳氣體，使其具有普通飲料所沒有的爽口感和風味[1-2]。乳清是一種黃綠色液體，每生產(chǎn)1 t干酪要消耗約10 t鮮牛奶，而分離出約9 t乳清，全世界大約47%的乳清排入湖泊河流或泥土里，乳清的處理是奶酪生產(chǎn)者面臨的一個重大難題[3-4]。乳清保留了牛奶55%的營養(yǎng)成分，乳清中的蛋白質約為牛奶里蛋白質的20%，乳清蛋白主要包括α-乳白蛋白（13%）、β-乳球蛋白（58%），少量的免疫球蛋白、血清蛋白及朊蛋白等，而牛奶里的礦物質、維生素和乳糖幾乎全部保留在乳清中，因此乳清具有很高的生物學價值[5-7]。乳清經(jīng)發(fā)酵后可產(chǎn)生必需氨基酸、生物活性膚和乳酸或乙醇，賦予其豐富的營養(yǎng)，能調節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)，促進新陳代謝，對心臟病、胃腸病、糖尿病有獨特療效，有向保健食品方向發(fā)展的潛力[8-9]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌種

乳清：山東省農(nóng)科院興牛乳業(yè)有限公司提供，馬蘇干酪副產(chǎn)物。

啤酒酵母2399：齊魯工業(yè)大學啤酒釀造中心提供；葡萄酒酵母：齊魯工業(yè)大學葡萄與葡萄酒釀造研究所提供；白酒酵母1300：齊魯工業(yè)大學微生物實驗室提供；乳酸菌帝斯曼MY1821（規(guī)格，0.1 U；批號2013-7-13，簡稱M菌）：齊魯工業(yè)大學食品學院提供。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母膏粉10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，pH 5.8～6.2，121 ℃滅菌20 min。

MRS培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母膏粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，醋酸鈉5 g/L，吐溫80 0.1 g/L，檸檬酸二銨2 g/L，硫酸錳0.28 g/L，硫酸鎂0.58 g/L，pH 6.2～6.4，121 ℃滅菌15 min。

乳糖培養(yǎng)基：乳糖20 g/L，酵母膏粉10 g/L，胰蛋白胨20 g/L。

麥芽汁培養(yǎng)基：新鮮麥芽汁200 mL在65 ℃水浴糖化3 h，加水400 mL，調勻至生泡沫，將糖化液用4層紗布濾至澄清，并稀釋到5～6°Bé，pH 6.4，121 ℃滅菌30 min。

酵母膏粉（生化試劑）：北京奧博星生物技術有限公司；硫酸鎂、氯化鈉（分析純）：天津市大茂化學試劑廠；胰蛋白胨（生化試劑）：國藥集團化學試劑有限公司；葡萄糖（分析純）：天津市廣成化學試劑有限公司；1%乳糖酶（100 U/g）；鄰苯二甲酸氫鉀（分析純）：南京化學試劑股份公司；磷酸二氫鈉（分析純）：天津博迪化工股份公司；脫脂乳清粉：芬蘭維利奧有限公司。

1.2 儀器與設備

pHS-3C精密pH計：上海三北儀表廠；YXQ-LS-50G立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊有限公司；CP114電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；TDL-40B低速離心機：上海安亭科學儀器廠；XW-80A漩渦混合器：上海精科實業(yè)有限公司；GNP-9270隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海奧錚儀器；SGD-IV全自動還原糖測定儀：山東省科學院；UF-中空纖維超濾裝置：華泰凈化工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 測定方法

酸度：采用滴定法，用標定好的0.1 mol/L 的NaOH 溶液滴定測定酸度，然后折算為乳酸含量；乳糖含量：萊因-埃農(nóng)法測定；還原糖含量：全自動還原糖測定儀測定；酒精度：采用比重法。

1.3.2 乳清處理

采用的原料是生產(chǎn)干酪后剩余的乳清。膜分離技術是乳制品工業(yè)中日益受到重視的一種新型分離技術，具有很多優(yōu)點，操作簡單，條件溫和[10-11]。采用中空纖維超濾裝置對乳清液進行濃縮處理。膜出口壓力為0.2 MPa，濃縮溫度為30 ℃，濃縮時間為150 min，平均透液通量約為20 kg/（m2·h）。原乳清液與濃縮液中主要成分含量見表1。

表1 乳清液與濃縮液的主要成分Table 1 Main components of whey and concentrated solution %

1.3.3 菌種組合篩選及發(fā)酵菌株構建

（1）酵母菌的活化與培養(yǎng)

將白酒酵母1300、啤酒酵母2399和葡萄酒酵母分別接入YPD培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)20 h，并觀察生長情況。將生長良好的酵母菌分別取3環(huán)，放入含適量生理鹽水的離心管中，低速離心10 min，除去上清液并加入生理鹽水混勻，再離心，除去上清液，加入適量生理鹽水混勻，取0.1 mL菌懸液于YPD和乳糖培養(yǎng)基中涂布平板，28 ℃培養(yǎng)觀察。用麥芽汁培養(yǎng)基對酵母菌分別進行擴大培養(yǎng)。

（2）乳酸菌的活化與篩選

活化培養(yǎng)：將S菌種和M菌種取適量，分別加2.5 mL生理鹽水稀釋混勻，取0.1 mL稀釋液接于MRS培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫活化培養(yǎng)。

乳酸菌菌種篩選[12]：將稀釋后的乳酸菌液接種于MRS培養(yǎng)基，無氧條件37 ℃培養(yǎng)。將生長良好的單菌落進行劃線分離并分別接種，再次分別進行無氧條件和有氧條件培養(yǎng)，并將生長良好菌種標記后保存。

1.3.4 工藝流程

乳清→超濾處理→乳酸發(fā)酵→添加乳糖酶→酒精發(fā)酵→補加氮源→殺菌冷卻→包裝

1.3.5 發(fā)酵條件優(yōu)化

兩種乳酸菌不同比例對發(fā)酵的影響：桿狀乳酸菌和球狀乳酸菌在生長的過程中具有共生效應，兩者的混合比例對產(chǎn)品的品質影響很大，常見的比例為1∶1或1∶2[12-13]。分別取1 L乳清液，按桿菌M-2b和球菌M-1a不同比例（1.0∶2.0、1.0∶1.8、1.0∶1.6、1.0∶1.2、1.0∶1.0、1.0∶0.8、1.0∶0.6）接入10%乳酸菌。42 ℃培養(yǎng)4 h后，加入1.0%乳糖酶溶液以及5.0%酵母菌，30 ℃發(fā)酵10 h，測定酒精度及酸度。

乳酸菌接種量對發(fā)酵影響：乳酸菌的接種量影響產(chǎn)品的風味。分別取1 L乳清溶液接入不同梯度的乳酸菌6%、8%、9%、10%、11%、12%、14%。42 ℃培養(yǎng)4 h后，加入1.0%乳糖酶溶液以及5.0%酵母菌，30 ℃發(fā)酵10 h，測定酒精度及酸度。

乳糖酶添加量對發(fā)酵影響：因酵母不直接發(fā)酵乳糖，會影響乳清在發(fā)酵中的利用，故添加乳糖酶將乳糖分解為葡萄糖和半乳糖。乳糖酶在不同條件下對乳糖水解程度差別很大，確定最佳的乳糖酶添加量以提高乳清的利用率。分別取1 L乳清溶液，接入10%乳酸菌（桿菌∶球菌=1.0∶1.0），42 ℃培養(yǎng)4 h后，分別加入不同梯度的乳糖酶溶液（0.80%、0.90%、0.95%、1.00%、1.05%、1.10%、1.20%）和5.0%酵母菌液，30 ℃發(fā)酵10 h，測定酒精度及酸度。

胰蛋白胨添加量對發(fā)酵影響：酵母菌進行酒精發(fā)酵到一定階段，由缺乏氮源而導致酵母菌停止生長，使最終產(chǎn)品酒精度偏低，所以需要補加氮源使酵母菌能正常生長發(fā)酵，后期氮源采用補差法添加[14]。根據(jù)原始乳清測定的氮含量，以及胰蛋白胨溶液的含氮量進行適量補充。分別取1 L乳清溶液，接入10%乳酸菌（桿菌∶球菌=1∶1），42 ℃培養(yǎng)4 h后，分別加入不同梯度（3.5%、4.0%、4.5%、5.0%、5.5%、6.0%、6.5%）的胰蛋白胨溶液，同時加入1.0%乳糖酶溶液和5.0%酵母菌，30 ℃發(fā)酵10 h，測定酒精度及酸度。

酵母菌接種量對發(fā)酵影響：酵母菌的接種量對產(chǎn)品酒精度會有直接的影響，其接種量多少需要適當控制。分別取1 L乳清溶液，接入10%乳酸菌（桿菌∶球菌=1.0∶1.0），42 ℃培養(yǎng)4 h后，加入1.0%乳糖酶溶液，分別接入不同梯度的酵母菌（3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%、5.5%、6.0%），30 ℃發(fā)酵10 h，測定酒精度及酸度。

1.3.6 發(fā)酵工藝條件優(yōu)化正交試驗

選用桿菌M-2b和球菌M-1a兩種乳酸菌以及啤酒酵母2399進行乳酸發(fā)酵和酒精發(fā)酵，其中兩種乳酸菌的配比為1.0∶1.0。在單因素試驗基礎上以乳酸菌接種量、乳糖酶添加量、胰蛋白胨添加量和酵母菌接種量4個參數(shù)作為試驗因素，設計L9（34）正交試驗，以酒精度為評價指標，確定其最佳發(fā)酵條件。

1.3.6 產(chǎn)品的穩(wěn)定性

（1）穩(wěn)定劑的選擇

發(fā)酵后的乳清產(chǎn)品經(jīng)放置一段時間后，由于物質的密度不同，產(chǎn)品呈現(xiàn)不均勻狀態(tài)，容易出現(xiàn)分層。為了使產(chǎn)品更加穩(wěn)定，必須適當加入一些穩(wěn)定劑。分別選擇羧甲基纖維素、海藻酸鈉、黃原膠、明膠作為穩(wěn)定劑進行試驗。以空白試驗為對照，以沉淀率為評價指標，考察不同穩(wěn)定劑及添加量對產(chǎn)品穩(wěn)定性的影響。

沉淀率的測定：將添加不同穩(wěn)定劑的乳清飲料放置于10 mL離心管，5 000 r/mim離心20 min，并稱量沉淀物，沉淀率越大則穩(wěn)定性越差。按如下公式計算沉淀率[15]：

（2）產(chǎn)品穩(wěn)定系數(shù)的測定

向適量乳清發(fā)酵產(chǎn)品中添加0.35%的黃原膠，分別加入不同量的蔗糖酯（0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%、0.14%、0.16%），并稀釋50倍。利用分光光度計在波長540 nm處測定其吸光度值為A1，然后將添加不同量蔗糖酯的產(chǎn)品，3 500 r/min離心20 min，取中間清液并稀釋50倍，并在相同條件下測其吸光度值為A2。用穩(wěn)定系數(shù)來表示產(chǎn)品的穩(wěn)定性和乳化性。穩(wěn)定系數(shù)越大則表示穩(wěn)定性和乳化性越好。穩(wěn)定系數(shù)按如下公式計算[16]：

式中：A1、A2分別為離心前后發(fā)酵液的吸光度值。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 兩種乳酸菌不同比例對發(fā)酵的影響

在混合乳酸菌的接種量為9%，酵母菌的接種量為5.0%條件下，考察兩種乳酸菌的不同配比對產(chǎn)品發(fā)酵效果的影響，結果見圖1。

圖1 兩種乳酸菌接種比例對發(fā)酵產(chǎn)品酒精度和酸度的影響Fig.1 Effect of two different lactic acid bacteria inoculum ratio on alcohol content and acidity of the products

由圖1可知，隨著桿狀菌M-2b占比的增加最終發(fā)酵產(chǎn)品的酸度呈增加趨勢，而酒精度先提高后下降。這可能是因為桿狀菌M-2b比球狀菌M-1a的產(chǎn)酸能力強，故隨著其占比的增加產(chǎn)品酸度增加。由于乳酸菌與酵母菌的相互作用機理，而桿狀菌M-2b的繁殖能力較強，故當菌M-2b的占比超過50%后會加快碳源消耗而導致酒精度有所下降。故選兩種乳酸菌種比例為1.0∶1.0，該條件下產(chǎn)品酒精度為0.53%vol，酸度為1.014%。

2.1.2 乳酸菌接種量對發(fā)酵影響

乳酸菌的接種量不僅影響產(chǎn)品的品質，還對產(chǎn)品的酸度和酒精度有直接影響。在乳酸菌的比例為1.0∶1.0，酵母菌的接種量為5.0%條件下，考察乳酸菌的接種量對產(chǎn)品發(fā)酵效果的影響，結果見圖2。

圖2 乳酸菌接種量對發(fā)酵產(chǎn)品酒精度和酸度的影響Fig.2 Effect of lactic acid bacteria inoculum on alcohol content and acidity of the products

由圖2可知，隨著乳酸菌接種量的增加，發(fā)酵產(chǎn)品的酒精度會越來越小，而酸度會越來越大。這是因為發(fā)酵過程中乳酸菌和酵母菌存在競爭作用，隨著乳酸菌接種量的增加，會加強乳酸發(fā)酵過程而降低酒精發(fā)酵過程。在保證產(chǎn)品酸度的前提下選擇較高的酒精度[17]。故選擇乳酸菌接種量為10.0%，此時產(chǎn)品酒精度為0.50%vol，酸度為0.996%。

2.1.3 乳糖酶添加量對發(fā)酵的影響

酵母菌無法直接利用乳糖，添加乳糖酶分解乳糖以提高乳清的利用率?？疾烊樘敲傅奶砑恿繉Ξa(chǎn)品發(fā)酵效果的影響，結果見圖3。

圖3 乳糖酶添加量對發(fā)酵產(chǎn)品酒精度和酸度的影響Fig.3 Effect of lactase addition on alcohol content and acidity of the products

由圖3可知，乳糖酶添加量的增加對產(chǎn)品酸度無明顯影響，但總體呈下降趨勢。下降趨勢是因為乳糖分解會影響乳酸菌的生長代謝而影響其產(chǎn)酸能力。隨著乳糖酶添加量的增加，產(chǎn)品的酒精度呈明顯增加趨勢后有所下降?？赡苁且驗槿樘敲阜纸馊樘菫榻湍妇峁┝顺渥闾荚矗龠M了酒精的產(chǎn)生，又因為酵母菌與乳酸菌存在競爭機制而導致酒精度有所降低[18]。在乳糖酶添加量為0.95%時酒精度最高，為0.55%vol，其產(chǎn)品酸度為1.024%。因此，乳糖酶最適添加量為0.95%。

2.1.4 胰蛋白胨添加量對發(fā)酵影響

發(fā)酵后期由于氮源的缺乏會限制酵母菌的生長代謝，適當添加胰蛋白胨有助于改善產(chǎn)品的品質和提高其酒精度?？疾煲鹊鞍纂颂砑恿繉Ξa(chǎn)品發(fā)酵效果的影響，結果見圖4。

由圖4可知，隨著胰蛋白胨添加量的增加，產(chǎn)品的酒精度和酸度都有所增加。這是因為及時補加了氮源，保證了乳酸菌與酵母菌的生長，但是由于乳酸菌與酵母菌的互生機理以及碳源等其他因素的限制，酒精度的增加幅度有限。當胰蛋白胨添加量為5.0%時，產(chǎn)品的酒精度最高，為0.6%vol，酸度為1.046%。因此，胰蛋白胨最適添加量為5.0%。

圖4 胰蛋白胨添加量對發(fā)酵產(chǎn)品酒精度和酸度的影響Fig.4 Effect of tryptone addition on alcohol content and acidity of the products

2.1.5 酵母菌接種量對發(fā)酵的影響

酵母菌的接種量直接影響了產(chǎn)品的酒精度，考察不同酵母菌接種量對產(chǎn)品發(fā)酵效果的影響，結果見圖5。

圖5 酵母菌接種量對發(fā)酵產(chǎn)品酒精度和酸度的影響Fig.5 Effect of yeast inoculums on alcohol content and acidity of the products

由圖5可知，隨著酵母菌的接種量的增加，發(fā)酵產(chǎn)品的酸度越來越低，酒精度先提高后降低。因為酵母菌接種量的不斷加大會限制乳酸菌的生長繁殖，故產(chǎn)品酸度會降低。而當酵母菌接種量偏大，則酵母菌的“疲勞”現(xiàn)象越快出現(xiàn)，會使酒精度降低。當酵母菌接種量為5.0%時，產(chǎn)品的酒精度最高，為0.56%vol，酸度為1.016%。因此，酵母菌接種量5.0%為宜。

2.2 正交試驗結果與分析

在單因素試驗基礎上，以酒精度為評價指標，考察胰蛋白胨添加量、乳糖酶添加量、乳酸菌（桿菌∶球菌=1.0∶1.0）接種量及酵母菌接種量對產(chǎn)品發(fā)酵效果的影響，正交試驗結果與分析見表2。

由表2可知，各因素對產(chǎn)品還原糖含量的影響作用依次為B＞A=D＞C，其中乳糖酶添加量對產(chǎn)品的酒精度有較大影響。最佳組合為A2B2C2D2，即乳清“發(fā)泡酒”的最佳發(fā)酵條件為乳酸菌（桿菌∶球菌=1∶1）接種量10%，乳糖酶添加量0.95%，胰蛋白胨添加量5.0%和酵母菌接種量5.0%。該最佳發(fā)酵條件下產(chǎn)品的酒精度為0.68%vol，酸度為1.036%。

表2 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for fermentation process optimization

2.3 產(chǎn)品的穩(wěn)定性

2.3.1 穩(wěn)定劑的選擇

穩(wěn)定劑不僅能夠增加產(chǎn)品的黏度，而且在蛋白質分子外圍形成了一層保護膜，在pH 3.6～4.6內防止蛋白質發(fā)生沉淀，并適當提高產(chǎn)品的口感[17]。不同穩(wěn)定劑的穩(wěn)定效果見表3。

表3 不同穩(wěn)定劑對產(chǎn)品穩(wěn)定性的影響Table 3 Effect of different stabilizers on product stability

由表3可知，黃原膠對產(chǎn)品的穩(wěn)定效果最好，沉淀率僅為4.21%；其次是羧甲基纖維素和海藻酸鈉；而明膠的沉淀率最高，穩(wěn)定效果最差。黃原膠溶膠分子形成超結合帶狀的螺旋共聚體，構成能夠支持液滴、固體顆粒的網(wǎng)狀結構，從而顯示出較強的穩(wěn)定作用[17]。因此選擇添加黃原膠來增加產(chǎn)品的穩(wěn)定性。

圖6 黃原膠對產(chǎn)品穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of xanthan addition on product stability

選擇不同的黃原膠添加量進行試驗，確定黃原膠的最佳添加量，結果見圖6。由圖6可知，當黃原膠的添加量為0.35%時，沉淀率最低，為4.32%，產(chǎn)品的穩(wěn)定性最好。

2.3.2 產(chǎn)品穩(wěn)定系數(shù)的測定

在乳制品生產(chǎn)過程中，脂肪上浮是一大問題，在乳清產(chǎn)品中加入適量的蔗糖酯能夠有效抑制脂肪上浮，還能防止乳脂的析出，一定程度增加了產(chǎn)品的穩(wěn)定性[18-19]，蔗糖酯對產(chǎn)品穩(wěn)定系數(shù)影響的結果見圖7。

圖7 蔗糖酯對產(chǎn)品穩(wěn)定系數(shù)的影響Fig.7 Effect of sucrose ester addition on the stability coefficient of the product

因為蔗糖酯會在油/水界面會形成界面膜，能阻止顆粒的相互結合，提高其穩(wěn)定性。而當添加量過大時，由于膠束的形成，反而使穩(wěn)定系數(shù)降低[18]。由圖7可知，當蔗糖酯的添加量為0.10%時，產(chǎn)品的穩(wěn)定系數(shù)為0.2。穩(wěn)定系數(shù)最大，穩(wěn)定效果和乳化效果較好。

3 結論

先對乳清原料進行超濾處理，除掉大部分水和部分鹽。通過對菌種篩選和發(fā)酵試驗，確定用球狀乳酸菌M-1a、桿狀乳酸菌M-2b和啤酒酵母2399分別進行乳酸發(fā)酵和酒精發(fā)酵。通過單因素和正交試驗確定乳清“發(fā)泡酒”最佳發(fā)酵條件為乳酸菌（桿菌∶球菌=1.0∶1.0）接種量10%，乳糖酶添加量0.95%，胰蛋白胨添加量5.0%和酵母菌接種量0.5%。為了提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性，黃原膠添加量為0.35%，蔗糖酯的添加量為0.1%。最佳發(fā)酵條件下產(chǎn)品酒精度為0.68%vol，酸度為1.036%，產(chǎn)品顏色乳白，口感醇厚，符合國標GB 16321—2003《乳酸菌飲料衛(wèi)生標準》中的要求。

乳清里含有乳糖、蛋白、多種維生素和礦物質，有很高的營養(yǎng)價值。本研究通過二次發(fā)酵制得的乳清發(fā)酵產(chǎn)品有良好口感和較好的穩(wěn)定性，不僅具有時尚感，而且還迎合了消費者的健康理念，具有良好的社會效益和經(jīng)濟效益，為乳清的開發(fā)與利用提供了一種新的技術支持。

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