李成峰 , 甄 毓 劉材材, 秦 超, 馮 明, 王國(guó)善, 米鐵柱

(1.中國(guó)海洋大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 山東 青島 266100; 2.海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東青島 266100; 3.國(guó)家海洋局 東海環(huán)境監(jiān)測(cè)中心 , 上海 200137; 4.東華大學(xué) 化學(xué)化工與生物工程學(xué)院, 上海201620; 5.上海英基生物科技有限公司, 上海200137; 6.中國(guó)海洋大學(xué) 海洋生命學(xué)院, 山東 青島 266100)

近年來(lái), 面積超過(guò)1000 km2, 持續(xù)時(shí)間超過(guò)一個(gè)月的大規(guī)模赤潮時(shí)常在我國(guó)東海區(qū)域出現(xiàn)[1-3]。東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)屬于甲藻綱(Dinophyceae)、原甲藻目(Prorocentrales)、原甲藻科(Prorocentraceae), 是引發(fā)東海赤潮暴發(fā)的優(yōu)勢(shì)藻種之一。在赤潮發(fā)生的早期,藻細(xì)胞密度相對(duì)較低且個(gè)體微小, 傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡觀察計(jì)數(shù)的方法主要用于對(duì)藻類(lèi)的定性和分離, 但這種方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、過(guò)程繁瑣, 操作要求高, 不適合對(duì)赤潮暴發(fā)時(shí)大批量海水樣品的檢測(cè)。

近十幾年來(lái), 以抗體為基礎(chǔ)的免疫檢測(cè)方法逐漸發(fā)展成熟并應(yīng)用于浮游藻類(lèi)研究。Anderson等[4]制備了抑食金球藻(Aureococcus anophagefferens)的多克隆抗體, 利用免疫熒光技術(shù)研究該藻在美國(guó)東北海岸的分布。Nagasaki等、Vrieling等和 Adachi等陸續(xù)制備針對(duì)Gymnodinium nagasakiense[5]、Chattonella marina-[6]、Gyrodiniumcf.aureolum[7]和Alexandrium[8]甲藻的單克隆抗體, 實(shí)現(xiàn)了對(duì)相應(yīng)海藻的定性鑒定和分類(lèi)。Caron等[9]利用抗A.anophagefferens的特異性單克隆抗體, 建立了快速檢測(cè)該藻的酶聯(lián)免疫分析(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)方法。Costas等[10]將針對(duì)微小亞歷山大藻(A.minutum)的多克隆抗體與磁性微粒結(jié)合, 利用免疫磁性微粒技術(shù)對(duì)天然海水樣品中的目的細(xì)胞進(jìn)行分離。亓海剛等[11]建立了應(yīng)用赤潮異彎藻(Heterosigma akashiwo)的特異性多克隆抗體檢測(cè)該藻的間接ELISA方法。向軍儉等[12]制備了針對(duì)赤潮異彎藻(H.akashiwo)、海洋卡盾藻(Chattonella ma-rina)、卵圓褐胞藻(Chattonelia ovata)和具齒原甲藻(Prorocentnmz dentatum)的抗血清, 用間接ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn), 抗血清對(duì)各自藻體均有良好的特異性和親和力, 與異種赤潮藻之間交叉反應(yīng)較弱, 表明單種藻免疫獲得的小鼠多克隆抗體可以特異性地與相應(yīng)赤潮藻作用。這些研究表明, 抗體技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、精確度高的優(yōu)點(diǎn), 可以實(shí)現(xiàn)對(duì)赤潮藻的定性、定量分析, 對(duì)海洋環(huán)境監(jiān)控具有重要意義。

目前, 國(guó)內(nèi)外并未出現(xiàn)關(guān)于應(yīng)用多克隆、單克隆抗體和酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法定量檢測(cè)東海原甲藻的報(bào)道。本研究首次采用針對(duì)東海原甲藻制備的單克隆和多克隆抗體, 利用雙抗體 ELISA方法對(duì)東海原甲藻進(jìn)行快速定量檢測(cè), 并且對(duì)實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行了優(yōu)化。

1 材料和方法

1.1 藻種培養(yǎng)

東海原甲藻(P.donghaiense)(分離于我國(guó)東海海域)、赤潮異彎藻(H.akashiwo)、柔弱角毛藻(Chaetoceros debilis)、纖細(xì)角毛藻 (C.gracilis)、裸甲藻(Gymnodiniumsp.)、米氏凱倫藻(Karenia mikimotoi)、血紅哈卡藻(Akashiwo sanguinea)、中肋骨條藻(Skeletonema costatum)均由中國(guó)海洋大學(xué)提供,培養(yǎng)基為f/2培養(yǎng)基, 普通日光燈為光源, 光照/黑暗周期12h/12h, 光照強(qiáng)度4 000 lx, 培養(yǎng)溫度20~25℃。

1.2 免疫原的制備

取適量東海原甲藻樣品(100~500 mL)用 0.45 μm濾膜過(guò)濾, 記錄體積。將得到的濾膜放入5 mL離心管, 加入2 mL磷酸鹽緩沖液(PBS), 超聲波破碎2 min,得到樣品溶液。將樣品溶液與等體積的弗氏完全佐劑充分乳化后作為免疫原備用。

1.3 抗體的制備

1.3.1 多克隆抗體的制備

實(shí)驗(yàn)用純種新西蘭白兔由中科院上海生物工程研究中心動(dòng)物房提供并飼養(yǎng)。免疫前采血樣作陰性對(duì)照, 每2只同種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為一組, 共設(shè)兩組。選取皮下多點(diǎn)和肌肉注射方式對(duì)家兔進(jìn)行免疫。間隔兩周加強(qiáng)免疫。三次免疫后耳動(dòng)脈取血, ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)。最后一次免疫兩周后頸動(dòng)脈放血, 4 000 r/min離心5 min分離血清, 收集抗體保存于–20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 單克隆抗體的制備

在1.3.1獲得的高效價(jià)多克隆抗體的基礎(chǔ)上, 參照文獻(xiàn)[13]的方法, 經(jīng)過(guò)骨髓瘤細(xì)胞及飼養(yǎng)細(xì)胞的制備、細(xì)胞融合, 次黃嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)、胸苷(T)和甘氨酸的完全培養(yǎng)液(HAT培養(yǎng)液)的選擇培養(yǎng),用間接ELISA方法特異性篩選細(xì)胞融合的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞, 接種到4只小鼠腹腔中, 進(jìn)行抗體制備、純化得到高純度的單克隆抗體。

1.4 ELISA方法試驗(yàn)條件的優(yōu)化

參照文獻(xiàn)[14]的方法, 確定酶標(biāo)二抗、單克隆抗體以及多克隆抗體的最佳工作濃度, 封閉液用2%的牛血清蛋白溶液, 選擇37℃封閉2 h作為封閉時(shí)間。

雙抗體ELISA方法如下: 將單抗包被于96孔板,4℃包被過(guò)夜, 次日洗板; 加入封閉液, 37℃封閉2 h后洗板; 加入待測(cè)抗原, 37℃, 1.5 h后洗板; 加入多克隆抗體, 37℃, 1.5 h后洗板; 加入酶標(biāo)二抗溫育45 min,添加TMB顯色液(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)和終止液后檢測(cè)A450值。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

根據(jù)實(shí)驗(yàn)所得的最佳實(shí)驗(yàn)條件, 用制備的東海原甲藻的單克隆抗體、多克隆抗體和已知濃度藻細(xì)胞(密度分別為 32×103、16×103、8×103、4×103、2×103、0×103個(gè)/mL), 用雙抗體ELISA實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定。以藻細(xì)胞濃度為橫坐標(biāo),A450為縱坐標(biāo), 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 確定最小檢出限度。

1.6 模擬樣品的雙抗體ELISA定量檢測(cè)

海藻樣品分為兩組: 第一組純種樣品: 將只含有東海原甲藻的培養(yǎng)液稀釋至 104個(gè)/mL; 第二組混合樣品: 在多種藻(不含測(cè)試的目標(biāo)藻)混合濃度為 104個(gè)/mL的培養(yǎng)液中加入要檢驗(yàn)的目標(biāo)藻, 使目標(biāo)藻濃度約為104個(gè)/mL。按1.4確定的最佳工作濃度和步驟進(jìn)行雙抗體 ELISA檢驗(yàn), 標(biāo)準(zhǔn)樣品設(shè)置三個(gè)平行樣, 選取曲線方程決定系數(shù)R2值大于0.995的作為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。檢測(cè)樣品設(shè)置 10個(gè)平行樣,根據(jù)檢測(cè)得到的吸光度值計(jì)算得到細(xì)胞濃度, 與顯微鏡直接計(jì)數(shù)進(jìn)行比較。

1.7 現(xiàn)場(chǎng)樣品的雙抗體ELISA定量檢測(cè)

2013年7月至10月, 采集現(xiàn)場(chǎng)樣品(采樣站位如圖1)。圖中 A點(diǎn)是東海赤潮監(jiān)控海區(qū)采樣點(diǎn)(122°36′48″E, 30°49′04″N), 間隔兩周采樣一次。B點(diǎn)是嵊泗海水浴場(chǎng)(南長(zhǎng)涂海水浴場(chǎng))采樣點(diǎn)(122°27′55″E, 30°41′49″N), 每天采樣。樣品處理:取2 L左右樣品, 用0.45 μm的醋酸纖維膜過(guò)濾, 得到濾膜, 記錄體積。將得到的濾膜放入5 mL離心管中, 加入 2 mL 磷酸鹽緩沖液, 超聲波破碎 2 min,得到待檢測(cè)的樣品溶液, 4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 現(xiàn)場(chǎng)樣品采樣站位Fig.1 Map of sampling station sites

將待測(cè)樣品進(jìn)行雙抗體 ELISA檢驗(yàn), 方法和步驟同 1.4, 標(biāo)準(zhǔn)樣品設(shè)置三個(gè)平行樣, 根據(jù)檢測(cè)得到的吸光度值由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞濃度。另取一份樣品進(jìn)行鏡檢, 兩組結(jié)果進(jìn)行比較以驗(yàn)證檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果分析

2.1 抗體效價(jià)

圖2和圖3是東海原甲藻多克隆抗體和單克隆抗體的抗血清效價(jià)檢測(cè)結(jié)果。圖2中兔1、兔2血清中的多克隆抗體在稀釋倍數(shù)<23 000時(shí), 吸光度值均大于 1.0, 具有很高效價(jià)。陰性對(duì)照 1和陰性對(duì)照2的吸光度值均小于 0.4, 與抗體的試驗(yàn)結(jié)果存在明顯差異, 影響不顯著。所以, 可以得出由東海原甲藻制備的兔血清中多克隆抗體的效價(jià)是23 000。圖3中結(jié)果顯示, A、B、C、D四只小鼠在單克隆抗體稀釋倍數(shù)低于16 000時(shí), 吸光度值大于1.0, 可以得出小鼠血清中單克隆抗體的效價(jià)是16 000。

圖2 東海原甲藻多克隆抗體效價(jià)Fig.2 Polyclonal antibody titers of P.donghaiense

圖3 東海原甲藻單克隆抗體效價(jià)Fig.3 Monoclonal antibody titer of P.donghaiense

2.2 ELISA試驗(yàn)條件的選擇

酶標(biāo)二抗的稀釋倍數(shù)為5 000倍時(shí), 檢測(cè)得到的吸光度值為0.998, 最接近 1.0, 確定酶標(biāo)二抗的最佳工作濃度為1∶5 000(表1)。當(dāng)單抗?jié)舛葹?∶4 000, 多抗?jié)舛葹?∶2 000, 檢測(cè)得到的吸光度值為0.996, 最接近于1.0, 同時(shí)陰性檢測(cè)數(shù)值小于 0.1, 確定單抗和多抗的最佳工作濃度分別為1∶4 000和1∶2 000(表2)。

表1 不同濃度酶標(biāo)二抗A450值Tab.1 The absorbance of secondary antibody labeled with different percentage of enzyme

表2 棋盤(pán)法比色結(jié)果Tab.2 Results of checkerboard method

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

將標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行雙抗體 ELISA檢測(cè), 得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0521x+0.0536,R2=0.999, 大于0.995(圖4)。濃度稀釋到 1×103個(gè)/mL時(shí), 檢測(cè)得到的吸光度值已經(jīng)小于0.1, 和標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度為0時(shí)的數(shù)值很接近, 所以此方法的最低檢出限為1×103個(gè)/mL。

圖4 雙抗體ELISA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of double antibodies sandwich ELISA

2.4 模擬樣品檢測(cè)

試驗(yàn)證明, 本研究建立的雙抗體 ELISA檢測(cè)方法對(duì)單一藻種樣品的檢測(cè)結(jié)果與鏡檢得到的“真實(shí)”濃度基本一致, 相對(duì)誤差小于 30%(平均值在(1±30%)μ范圍內(nèi),μ為平均值)。經(jīng)過(guò)t檢驗(yàn), sig 值小于 0.05, 沒(méi)有顯著性差異, 結(jié)果如表3, 達(dá)到了定量檢測(cè)準(zhǔn)確度的指標(biāo)要求。并且該方法在對(duì)混合藻種樣品的檢測(cè)中表現(xiàn)出良好的特異性(表4), 不會(huì)受其他藻種的影響, 表明該方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)東海原甲藻的快速定性、定量檢測(cè)。

表3 單一藻種樣品檢測(cè)結(jié)果Tab.3 The test results of pure strains

表4 在其他混合藻液中加入東海原甲藻的檢測(cè)結(jié)果Tab.4 The test results of P.donghaiense in other microalgae solutions

2.5 現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)結(jié)果

由于赤潮監(jiān)控海區(qū)數(shù)據(jù)變化范圍較大, 對(duì)抗體定量法計(jì)算和顯微鏡直接計(jì)數(shù)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)處理后, 以顯微鏡觀測(cè)數(shù)值為x軸, 抗體定量檢測(cè)計(jì)數(shù)為y軸, 得到以下曲線(圖5、圖6)顯微鏡計(jì)數(shù)和抗體定量法檢測(cè)得到藻細(xì)胞濃度數(shù)據(jù)具有高度的一致性, 相關(guān)系數(shù)分別為 0.998和 0.992, 具有良好的正相關(guān)關(guān)系。證明本實(shí)驗(yàn)建立的酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)可以和顯微鏡計(jì)數(shù)一樣, 較準(zhǔn)確地檢測(cè)樣品中東海原甲藻的細(xì)胞濃度。

圖5 赤潮監(jiān)控海區(qū)東海原甲藻顯微鏡計(jì)數(shù)和抗體檢測(cè)計(jì)數(shù)結(jié)果Fig.5 Microscope counting and antibody detection counting results of P.donghaiense in Red Tide Monitoring Sea

圖6 嵊泗海水浴場(chǎng)東海原甲藻顯微鏡計(jì)數(shù)和抗體檢測(cè)計(jì)數(shù)結(jié)果Fig.6 Microscope counting and antibody detection counting results of P.donghaiense in ShengSi Beach

利用雙抗體ELISA對(duì)2013年5月至9月赤潮監(jiān)控海區(qū)東海原甲藻的密度進(jìn)行檢測(cè)(圖7)。由圖可以看出顯微鏡檢測(cè)計(jì)數(shù)和抗體定量檢測(cè)計(jì)數(shù)得到的曲線基本一致。東海原甲藻暴發(fā)時(shí)間是5月底至6月初, 最高濃度為 1.1×104個(gè)/mL。7月底至 9月也會(huì)有一定增長(zhǎng), 最高濃度約為1×102個(gè)/mL, 但未達(dá)到赤潮暴發(fā)的程度(約為5×103個(gè)/mL)。

圖7 赤潮監(jiān)控海區(qū)2013年5月-9月東海原甲藻濃度變化曲線Fig.7 The concentration curve of P.donghaiense in Red Tide Monitoring Sea from May to September, 2013.

同樣利用該方法檢測(cè)嵊泗海水浴場(chǎng)7月至9月東海原甲藻細(xì)胞密度(圖8~圖10)。在 7月下旬、8月初、8月中旬和9月中旬東海原甲藻都保持了較高的細(xì)胞密度, 8月最高(約為40 個(gè)/mL), 遠(yuǎn)小于赤潮監(jiān)控海區(qū)的細(xì)胞濃度, 并且暴發(fā)時(shí)間相對(duì)較晚。分析其原因可能在于: ①海水溫度的影響, 近海地區(qū)溫差變化大。②受潮汐作用的影響, 可將外海的浮游植物帶到近海, 導(dǎo)致近海地區(qū)藻細(xì)胞濃度增加, 且時(shí)間延后。

圖8 嵊泗海水浴場(chǎng)2013年7月東海原甲藻濃度變化曲線Fig.8 The concentration curve of P.donghaiense in Shengsi beach in July 2013

圖9 嵊泗海水浴場(chǎng)2013年8月東海原甲藻濃度變化曲線Fig.9 The concentration curve of P.donghaiense in Shengsi beach in August 2013

圖10 嵊泗海水浴場(chǎng)2013年9月東海原甲藻濃度變化曲線Fig.10 The concentration curve of P.donghaiense in Shengsi beach in September 2013

3 討論

近年來(lái), 赤潮的頻繁出現(xiàn)[15]對(duì)經(jīng)濟(jì)及海洋生態(tài)系統(tǒng)造成了重大影響, 因此建立赤潮早期預(yù)報(bào)系統(tǒng)就顯得尤為重要。目前, 除了抗體定量檢測(cè)赤潮藻外,還有PCR技術(shù)和rRNA探針技術(shù)[16]。PCR技術(shù)需要高質(zhì)量純化的 DNA, 目前試驗(yàn)存在 DNA純化效率低及效率不穩(wěn)定的缺點(diǎn), 在很大程度上影響了分析的準(zhǔn)確性。Lin等[17]發(fā)現(xiàn), 相對(duì)于PCR檢測(cè)技術(shù), 免疫學(xué)檢測(cè)方法的靈敏性略低, 但對(duì)較高細(xì)胞密度的檢測(cè)結(jié)果更為穩(wěn)定, 不會(huì)受到樣品中其他藻類(lèi)和懸浮物質(zhì)的影響, 可以實(shí)現(xiàn)小樣本大批量的樣品檢測(cè)。Anderson 等[18]通過(guò)對(duì)比試驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 相對(duì)于 rRNA探針技術(shù), 抗體檢測(cè)方法操作要求低, 結(jié)果穩(wěn)定性高,不易受外界條件影響。因此, 在免疫學(xué)基礎(chǔ)上建立的針對(duì)東海原甲藻的雙抗體 ELISA檢測(cè)方法, 在理論和技術(shù)上都是可行的, 具有較大的發(fā)展?jié)摿? 為赤潮檢測(cè)和研究提供了新的技術(shù)方法。

免疫學(xué)方法的優(yōu)勢(shì)在于不需要對(duì)自然海水樣品進(jìn)行過(guò)多預(yù)處理就可以進(jìn)行測(cè)定; 單抗的制備步驟相對(duì)簡(jiǎn)單、成本也較低廉; 單克隆抗體技術(shù)的發(fā)展使制備高特異性、高度均一的抗體成為可能; 封閉抗體技術(shù)則使多克隆抗體的應(yīng)用價(jià)值得到極大提高[19]。利用抗體免疫檢測(cè)方法對(duì)海藻細(xì)胞進(jìn)行定性定量檢測(cè)的一個(gè)障礙就是需要特異性的抗體。本實(shí)驗(yàn)成功制備了特異性的單克隆抗體和多克隆抗體。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中, 免疫動(dòng)物沒(méi)有發(fā)生意外死亡情況, 在第四次免疫之后產(chǎn)生的抗體就表現(xiàn)出很高的親和力。本研究建立的雙抗體ELISA檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.999, 線性關(guān)系良好, 檢測(cè)限為1×103個(gè)/mL。模擬樣品和現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)表明, 該方法可以對(duì)東海原甲藻進(jìn)行定性、定量檢測(cè)并且不會(huì)受到海水中其他海藻和懸浮顆粒物的影響, 檢測(cè)結(jié)果與鏡檢結(jié)果相吻合, 檢測(cè)過(guò)程只需要幾個(gè)小時(shí)。

本研究建立的針對(duì)東海原甲藻的雙抗體 ELISA檢測(cè)方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)該藻的快速定量檢測(cè), 但是海洋中的海藻種類(lèi)繁多, 目前的特異性驗(yàn)證對(duì)象只是針對(duì)常見(jiàn)藻種, 對(duì)于一些其他藻種的影響還有待進(jìn)一步驗(yàn)證; 靈敏度不是很高, 方法還需要進(jìn)一步完善。本實(shí)驗(yàn)室 Xin等[20]、亓海剛等[11]分別用競(jìng)爭(zhēng)型ELISA方法和間接 ELISA方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)裸甲藻(Gymnodiniumsp.)和赤潮異彎藻(H.akashiwo)的定量檢測(cè); Fabienne等[21]利用特異性單克隆抗體, 建立了微小亞歷山大藻(Alexandrium minutum)全細(xì)胞快速檢測(cè)的 ELISA方法。與其相比, 本研究建立的雙抗體ELISA方法具有特異性好、不易受外界因素干擾、穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn), 在一定程度上反應(yīng)赤潮暴發(fā)的情況, 對(duì)中國(guó)近海赤潮暴發(fā)的實(shí)時(shí)監(jiān)控具有重要意義。特別是可以據(jù)此研制出標(biāo)準(zhǔn)化的ELISA檢測(cè)試劑盒, 可使東海原甲藻的檢測(cè)更為簡(jiǎn)便。

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