裴河歡，唐漢慶，李曉華，李克明，朱曉瑩

(1．欽州市中醫(yī)藥研究所，廣西欽州 535000;2．右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西百色 533000)

附子注射液對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨組織的影響

裴河歡1，唐漢慶2△，李曉華2，李克明2，朱曉瑩2

(1．欽州市中醫(yī)藥研究所，廣西欽州 535000;2．右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西百色 533000)

目的:觀察附子注射液對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨組織的影響，為附子的拓寬應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)學(xué)基礎(chǔ)資料。方法:60只清潔級(jí)Wistar雌性大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、附子注射液低劑量、中劑量、高劑量組、雌二醇組6組，模型組、低劑量、中劑量、高劑量組、雌二醇組切除卵巢。低劑量、中劑量、高劑量組、雌二醇組再分別以附子注射液尾靜脈注射(iv)，正常組、模型組則分別給予同體積的生理鹽水。檢測(cè)血清鈣、磷、骨密度(BMD)、子宮質(zhì)量指數(shù)、骨小梁厚度、骨小梁間距并觀察骨形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果:與正常組比較，模型組血清鈣、磷水平、骨小梁間距均顯著升高，而BMD、子宮質(zhì)量指數(shù)、骨小梁厚度均顯著降低。與模型組比較，高劑量組、雌二醇組血清鈣、磷水平、骨小梁間距均降低，而BMD、骨小梁厚度升高，且雌二醇組子宮質(zhì)量指數(shù)顯著升高。結(jié)論:附子注射液和雌二醇均能改善骨質(zhì)疏松癥，其中高劑量附子注射液對(duì)子宮的刺激作用較雌二醇溫和，其機(jī)制需要更多實(shí)驗(yàn)研究。

附子注射液;骨質(zhì)疏松癥;卵巢切除術(shù);骨密度

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，附子具有補(bǔ)火助陽(yáng)、溫腎散寒等功效，對(duì)心脾腎陽(yáng)虛證均具有振奮作用，是助陽(yáng)名藥。對(duì)附子的研究以往多集中于心血管系統(tǒng)。近來(lái)有研究［1］表明，其功效的發(fā)揮與垂體-腎上腺-性腺軸有聯(lián)系。骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)以低骨量、骨組織的微觀結(jié)構(gòu)損害為特征，是造成骨折的高風(fēng)險(xiǎn)因素之一，被認(rèn)為是一種起病隱匿的慢性病。［2］37如何進(jìn)行有效的防治是值得探討的課題。根據(jù)中醫(yī)學(xué)“腎主骨”的理論述說(shuō)，參考有關(guān)附子等補(bǔ)陽(yáng)方劑與垂體-腎上腺-性腺軸的研究［3-4］，我們推測(cè)附子溫腎助陽(yáng)作用也有可能對(duì)骨組織代謝有一定的影響。鑒于去卵巢動(dòng)物骨質(zhì)疏松模型與臨床絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥表現(xiàn)相似度較高，這一造模方法目前也比較得到認(rèn)同［5］，因此我們?cè)噲D建立大鼠骨質(zhì)疏松模型，以附子注射液作為干預(yù)藥物觀察其對(duì)模型大鼠骨組織的影響，為附子拓寬應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)Wistar雌性大鼠60只，體質(zhì)量210～260 g，本院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供(動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(桂)2012-0007)。

1.1.2 藥物和試劑 附子注射液(自制);戊巴比妥鈉(批號(hào)20110621，北京化學(xué)試劑公司);雌二醇注射液(批號(hào)080401，上海通用藥業(yè));血清鈣試劑盒(批號(hào)00321101，北京博奧公司);磷試劑盒(批號(hào)120343121，北京博奧公司)。

1.1.3 儀器 普利賽斯電子天平(XT220A型，上海麥聚瑞電子儀器有限公司);生物顯微鏡(DM1000，萊卡);電腦快速恒冷冷凍石蠟兩用切片機(jī)(KD-2258-VI型，浙江科迪);高速低溫離心機(jī)(PK121R型，ALC公司);雙能X線骨密度測(cè)定儀(DCS-600R型，Aloka，Japan);中草藥粉碎機(jī)(DXF-1000A型，廣州大祥);智能放免測(cè)量?jī)x(SN-695B型，上海核所日環(huán)光電儀器有限公司);自動(dòng)生化分析儀(RTX-90，Beckman，USA)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組和造模 60只清潔級(jí)Wistar雌性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組和附子低、中、高劑量組、雌二醇組6組各10只。其中模型組、附子低、中、高劑量組、雌二醇組均施行卵巢切除手術(shù)［6］:仰臥位2%戊巴比妥鈉大鼠腹腔注射(40 mg·kg－1)麻醉，嚴(yán)格無(wú)菌操作下正中腹部切口，鈍性分離肌肉組織和腹膜，沿輸卵管上行查尋卵巢，應(yīng)用7號(hào)手術(shù)縫線在輸卵管壺腹處進(jìn)行結(jié)扎，完整切除雙側(cè)卵巢后撒上青霉素粉，縫合皮膚并消毒傷口。正常組手術(shù)路徑相同但不切除卵巢，只用鑷子輕輕夾出卵巢再送回縫合關(guān)腹。術(shù)后均連續(xù)灌服青霉素3 d，以預(yù)防感染。術(shù)后均普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水。術(shù)后恢復(fù)2周后附子低、中、高劑量組和雌二醇組分別以附子注射液(5、10、20 g·kg－1)、雌二醇注射液(0.05 g·kg－1)尾靜脈注射(iv)，正常組、模型組則分別給予同體積生理鹽水。每天1次，連續(xù)靜脈注射8周。8周后第1天禁食12 h取材檢測(cè)。

考慮到附子對(duì)心血管系統(tǒng)的副作用，對(duì)附子注射液劑量我們參考研究確定的靜脈注射半數(shù)致死量(LD50)［7］和研究［8］單體藥物人體實(shí)驗(yàn)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)給藥劑量間等效劑量情況進(jìn)行折算而確定，將附子注射液劑量定在安全范圍內(nèi)。對(duì)雌二醇計(jì)量參考研究［8］而確定。

1.2.2 附子注射液制備 熟附片由本校藥理教研室提供并鑒定。參考沈陽(yáng)藥學(xué)院藥物制劑組《常用藥物制劑》酒精沉淀法制備100%附子注射液，即每100 mL中含有100 g生藥成分。

1.2.3 血清鈣、磷測(cè)定 心臟取血5mL離心(4℃，2000 r·min－1，10 min)取上清液，－80℃保存，分別按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作檢測(cè)。

1.2.4 骨密度(bone mineral density，BMD)測(cè)定 應(yīng)用雙能X線骨密度測(cè)定儀和軟件進(jìn)行大鼠左股骨掃描并測(cè)定BMD值。

1.2.5 子宮質(zhì)量指數(shù)測(cè)定 取材前大鼠稱重，處死后取大鼠子宮，輕壓擠出子宮液體，濾紙吸干稱重。為避免大鼠個(gè)體質(zhì)量差異對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，以子宮質(zhì)量指數(shù)為指標(biāo)，按下列公式計(jì)算:子宮質(zhì)量指數(shù)=大鼠子宮質(zhì)量/大鼠質(zhì)量。

1.2.6 骨組織形態(tài)學(xué)觀察 大鼠處死后取右股骨，剔除肌肉筋膜組織稱重，4%多聚甲醛固定48 h，10%EDTA-2Na溶液脫鈣4周，pH7.4的PBS沖洗2次，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋、組織切片厚度5 μm，HE染色，生物顯微鏡、自動(dòng)圖像分析儀觀察并拍片，進(jìn)行骨組織計(jì)量分析，計(jì)算骨小梁厚度和骨小梁間距。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠術(shù)后2～3 h后意識(shí)完全清醒，可正常進(jìn)食。48 h后切口無(wú)紅腫，可正?；顒?dòng)，72 h后切口無(wú)感染。全部大鼠2周后切口均I期愈合，實(shí)驗(yàn)中途沒有死亡脫失，均納入統(tǒng)計(jì)分析。

2.2 大鼠血清鈣、磷、BMD及子宮質(zhì)量指數(shù)測(cè)定

表1顯示，與正常組比較，模型組血清鈣、磷水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，而BMD及子宮質(zhì)量指數(shù)均顯著降低，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與模型組比較，低劑量、中劑量組鈣、磷水平均降低，BMD及子宮質(zhì)量指數(shù)均升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05)，而高劑量組血清鈣、磷水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);BMD顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，子宮質(zhì)量指數(shù)也升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹥0.05)。與模型組比較，雌二醇組血清鈣、磷水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，而BMD升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，子宮質(zhì)量指數(shù)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。高劑量組和雌二醇組各項(xiàng)指標(biāo)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 血清鈣、磷、BMD及子宮質(zhì)量指數(shù)比較(±s)

表1 血清鈣、磷、BMD及子宮質(zhì)量指數(shù)比較(±s)

注:與正常組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與模型組比較:3)P＜0.05，4)P＜0.01

組 別 例數(shù) 劑量/g·kg－1血清鈣/mmol·L－1血清磷/mmol·L－1BMD/g·cm2子宮質(zhì)量指數(shù)正 常 組 10 —2.76±0.54 1.87±0.84 0.94±0.04 0.23±0.02 模 型 組 10 — 5.56±0.892)4.58±0.922)0.18±0.012)0.09±0.012)低劑量組 10 5 4.18±0.66 4.22±0.81 0.23±0.05 0.13±0.02中劑量組 10 10 4.09±0.72 3.86±0.86 0.34±0.06 0.14±0.01高劑量組 10 20 2.98±0.524)2.03±0.764)0.88±0.044)0.16±0.04雌二醇組 10 0.05 2.82±0.494)2.45±0.684)0.76±0.053)0.34±0.054)

2.3 大鼠骨小梁厚度、骨小梁間距測(cè)定結(jié)果

表2顯示，與正常組比較，模型組骨小梁厚度顯著減少，骨小梁間距顯著增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與模型組比較，低劑量、中劑量組骨小梁厚度增大，骨小梁間距減小，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05)，而高劑量組骨小梁厚度顯著增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，骨小梁間距減小，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組比較，雌二醇組骨小梁厚度增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);骨小梁間距減小，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。高劑量組和雌二醇組骨小梁厚度、骨小梁間距比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.4 骨組織形態(tài)學(xué)觀察

正常組股骨骨小梁粗壯，分布均勻密集，形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，連接成網(wǎng)狀，骨髓細(xì)胞較多，腔大小正常。模型組骨小梁稀疏、斷裂，排列雜亂，骨髓腔擴(kuò)大，有空泡存在。

低劑量、中劑量組骨小梁稀疏、斷裂，也有空泡存在，而高劑量組和雌二醇組骨小梁排列致密，骨髓腔骨髓細(xì)胞較多(見圖1～6)。

表2 骨小梁厚度、骨小梁間距比較(±s)

表2 骨小梁厚度、骨小梁間距比較(±s)

注:與正常組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與模型組比較:3)P＜0.05，4)P＜0.01

組 別 例數(shù) 劑量/g·kg－1骨小梁厚度/mm骨小梁間距/mm正常組 10 —42.52±6.82 0.16±0.02模型組 10 — 20.22±3.342)0.36±0.062)低劑量 10 5 22.87±4.56 0.34±0.08中劑量 10 10 26.78±5.16 0.32±0.05高劑量 10 20 50.65±8.844)0.21±0.043)雌二醇 10 0.05 38.36±6.223)0.22±0.033)

圖1 正常組(HE×100)

圖2 模型組(HE×100)

圖3 低劑量組(HE×100)

圖4 中劑量組(HE×100)

圖5 高劑量組(HE×100)

圖6 雌二醇組(HE×100)

3 討論

去卵巢動(dòng)物骨質(zhì)疏松模型與臨床絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥表現(xiàn)吻合度較高，骨代謝的正常是骨吸收和骨形成2個(gè)過(guò)程維持平衡的結(jié)果［9］，這2個(gè)過(guò)程與破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的功能狀態(tài)相關(guān)，如果破骨細(xì)胞功能亢進(jìn)，增加對(duì)骨的吸收，從而引起骨中鈣磷的流失，導(dǎo)致骨礦物質(zhì)的減少，表現(xiàn)為BMD的減小、血清鈣磷水平的升高［10］。研究［11-12］已表明，卵巢切除后引起大鼠骨量減少，是由于雌激素不足引起破骨細(xì)胞功能相對(duì)亢進(jìn)、骨吸收大于骨形成而致。

在本實(shí)驗(yàn)中我們觀察到，與正常組比較，模型組血清鈣、磷水平均顯著升高，而BMD顯著降低，骨小梁厚度顯著減少，骨小梁間距顯著增大。骨形態(tài)學(xué)也觀察到，骨小梁稀疏、變細(xì)，排列雜亂，骨髓腔擴(kuò)大，說(shuō)明模型組雌激素不足出現(xiàn)骨代謝異常表現(xiàn)。采用附子注射液和雌二醇干預(yù)后，上述指標(biāo)或異常表現(xiàn)在一定程度上得到糾正或恢復(fù)。這一效果與附子注射液的劑量有關(guān)。低劑量和中劑量組改善效果不明顯，而以高劑量組改善效果顯著，使各項(xiàng)指標(biāo)接近或趨向正常組水平，提示單味中藥如果要臨床取效可能需要較大用量，這與一些中藥復(fù)方的效果好、用量精有不同之處［13］，推測(cè)與中藥復(fù)方作用于多環(huán)節(jié)和多通路有關(guān)。

附子注射液和雌二醇均能改善骨質(zhì)疏松癥骨組織異常表現(xiàn)，但兩者的作用還稍有不同。單就本實(shí)驗(yàn)工作而言，我們注意到與模型組比較，雌二醇組子宮質(zhì)量指數(shù)顯著升高，附子注射液3個(gè)劑量組盡管子宮質(zhì)量指數(shù)也升高，但與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明盡管附子注射液對(duì)子宮也有刺激作用，但作用較雌二醇溫和。這一點(diǎn)提示我們，長(zhǎng)期應(yīng)用雌激素防治骨質(zhì)疏松癥有可能存在刺激子宮組織增生、有潛在致瘤風(fēng)險(xiǎn)。如果能找到一種對(duì)子宮刺激作用微弱而又有效治療骨質(zhì)疏松癥的藥物，就有可能使女性絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的治療變得更安全有效，并有可能成為長(zhǎng)期使用的預(yù)防藥物。關(guān)于附子注射液和雌二醇對(duì)子宮不同程度的刺激作用，我們推測(cè)可能與雌激素受體不同的亞型有關(guān)。研究表明，不同的亞型對(duì)子宮的刺激作用不同［14］，因此對(duì)于附子注射液是否通過(guò)不同亞型起作用值得進(jìn)一步的探究。

［1］ 王祺，楊積武．強(qiáng)心寧煎劑對(duì)慢性心力衰竭心腎陽(yáng)(氣)虛血瘀水停證患者血漿TNF-α，IL-6的影響［J］．中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17(14):264-266．

［2］ 羅琳．21世紀(jì)健康新觀念-骨質(zhì)疏松終身防治觀的建立［J］．科技視界，2012，35:29．

［3］ 李嶄，劉仁慧，康學(xué)，等．擇時(shí)合用滋陰、益陽(yáng)方對(duì)腎虛衰老模型HPAT軸的影響［J］．中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18 (24):256-259．

［4］ 金龍，葛爭(zhēng)艷，劉建勛．五子衍宗丸對(duì)大鼠交配功能和腎陽(yáng)虛模型小鼠的影響［J］．中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(16): 228-231．

［5］ Thompson DD，Simmons HA，Pirie CM，et al．FDA guidelines and animal models for osteoporosis［J］．Bone，1995，17(4 supply):125-133．

［6］ 劉忠厚．骨質(zhì)疏松癥的研究與防治［M］．北京:化學(xué)工業(yè)出版社，1994:180．

［7］ 金治萃，田德真，楊煜榮，等．附子注射液對(duì)體液免疫影響的初步研究［J］．內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)雜志，1983，3(1):1-3．

［8］ 黃娟萍，羅裕，江力，等．中藥藥動(dòng)學(xué)研究中給藥劑量的現(xiàn)狀分析［J］．中國(guó)藥學(xué)雜志，2012，47(21):1685-1689．

［9］ Kalu DN．The ovariectomized rat model of postmenopausal bone loss［J］．Bone Miner，1991，15:175-191．

［10］ 王冰，徐又佳，郝彥明，等．去卵巢和激素致骨質(zhì)疏松模型中骨密度與血清指標(biāo)的比較［J］．蘇州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2008，28(1):10-13．

［11］ 陳薊，肖德明，林博文，等．大鼠骨質(zhì)疏松模型中血清瘦素與鈣磷含量相關(guān)性研究［J］．中國(guó)骨腫瘤骨病，2006，5(4): 235-237．

［12］ 沈輝，潘時(shí)中．大鼠切除卵巢骨質(zhì)疏松模型的實(shí)驗(yàn)研究［J］．福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，38(2):152-154．

［13］ 魏力利，謝凱．中藥復(fù)方治療骨質(zhì)疏松癥研究［J］．中國(guó)中醫(yī)骨傷科雜志，2009，17(6):68-69．

［14］ Kuiper GG，Lemmen JG，Carlsson B，et al．Interaction of estrogenic chemicals and phytoestrogens with estrogen receptor beta［J］．Endocrinology，1998，139:4252-4263．

Effects of aconite injection on bone tissue in osteoporotic rats

PEI He-huan1，TANG Han-qing2△，LI Xiao-hua2，LI Ke-ming2，ZHU Xiao-ying2
(1．Chinese Medical research institute of Qinzhou city，Guangxi Qinzhou 535000，China; 2．Youjiang Medical University for Nationalities，Guangxi Baise 533000，China)

Objective To observe effects of Fuzi injection on bone tissue in ovariectomized rats with osteoporosis for further applicatioin of Fuzi．Methods 60 clean grade female Wistar rats were randomly divided into control group，model group，F(xiàn)uzi injection low-dose，middle-dose，high-dose group and estradiol group 6 groups．Model group，F(xiàn)uzi injecton 3 groups and estradiol group have been ovariectomized to establish model of osteoporosis，and then Fuzi injecton 3 groups and estradiol group respectively were iv Fuzi injection and estradiol．control group and model group were iv the same volume normal saline．To examine levels of serum calcium and phosphorus，bone mineral density(BMD)，uterus index，trabecular thickness，trabecular space and changes of bone morphology．Results:Compared with control group，levels of serum calcium，phosphorus and trabecular space in model group increased significantly while BMD，uterus index and trabecular thickness reduced significantly．Compared with model group，levels of serum calcium，phosphorus and trabecular space in both high-dose group and estradiol group reduced while BMD and trabecular thickness increased，in additon，uterus index in estradiol group increased significantly．Conclusion:It was suggested that both Fuzi injection and estradiol might improve bone tissue of osteoporosis while high-dose Fuzi injection had a milder stimulating effect on uterus than that of estradiol，whose mechanism was needed more experimental researches．

Fuzi injection;Osteoporosis;Ovariectomy;Bone mineral density

R285．6

B

1006-3250(2015)03-0278-04

2014-11-13

裴河歡(1981-)，男，藥師，從事中醫(yī)藥的臨床與研究。

△通訊作者:唐漢慶(1976-)，男，副教授，從事中西醫(yī)結(jié)合及民族醫(yī)藥研究，Tel:18978603776，E-mail:phdtanghanqing@ 163．com。