李克梅，張芯偽，王麗麗，先米西努爾·肉孜

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 烏魯木齊830052)

苜蓿(Medicago sativa)屬豆科苜蓿屬多年生草本植物，由于其品質(zhì)優(yōu)良，適口性好，因此作為主要牧草被廣泛種植［1］。苜蓿霜霉病是由苜蓿霜霉菌(Peronospora aestivalis)侵染引起的世界性病害，在我國(guó)發(fā)生普遍［2-3］，現(xiàn)已成為限制我國(guó)苜蓿生產(chǎn)的主要病害之一［4］。由于目前生產(chǎn)上對(duì)苜蓿霜霉病的防治存在缺乏抗病品種、農(nóng)業(yè)防治周期長(zhǎng)見(jiàn)效慢、化學(xué)防治的安全性堪憂等問(wèn)題，因此，探索更為安全、高效的苜蓿霜霉病防治措施是當(dāng)前苜蓿生產(chǎn)中急需解決的問(wèn)題之一。植物誘導(dǎo)抗病性因其不污染環(huán)境、抗病周期長(zhǎng)等特點(diǎn)，逐漸成為防治植物病害研究的熱點(diǎn)，被當(dāng)作是發(fā)掘植物內(nèi)在抗性機(jī)制的一種全新的病害防治方法和措施［5-6］，王海華和康健［7］報(bào)道了國(guó)外已有將誘導(dǎo)因子應(yīng)用于大田作物的嘗試，并取得了良好的防治效果。國(guó)內(nèi)針對(duì)植物誘導(dǎo)抗病性也開(kāi)展了一系列研究，證明茉莉酸甲酯能誘導(dǎo)水稻(Oryza sativa)幼苗對(duì)白葉枯病(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)和水稻苗期細(xì)菌性條斑病(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola)的抗性，并提高水稻相關(guān)防御酶的活性［8-9］;水楊酸處理可以改變?nèi)藚?Panax ginseng)根部相關(guān)防御酶的活性，從而提高對(duì)人參銹腐病(Cylindrocarpon destructans)的抗性［10］;水楊酸對(duì)番木瓜環(huán)斑病毒病(Papaya Ringspot Virus，PRV)有很好的誘導(dǎo)防病效果［11］。上述研究成果也為苜蓿病害的防治打開(kāi)了新思路［12］，故針對(duì)苜蓿霜霉病進(jìn)行誘導(dǎo)抗性研究，對(duì)探索苜蓿病害防治新技術(shù)具有重要意義。目前，利用誘導(dǎo)抗病性防治植物病害的研究對(duì)象主要包括糧食、油料、瓜果、煙草(Nicotiana tabacum)等［13］作物，用在牧草病害防治方面的報(bào)道很少。

草酸(Oxalic Acid，OA)是一種有效的化學(xué)誘抗劑，它能顯著提高植物對(duì)不同病菌的系統(tǒng)抗病性［14-18］，但草酸誘導(dǎo)苜?？顾共〉难芯可形匆?jiàn)報(bào)道。本研究用苜蓿霜霉病菌接種預(yù)先經(jīng)草酸處理過(guò)的苜蓿幼苗，測(cè)定草酸誘導(dǎo)苜?？顾共〉男Ч约敖?jīng)草酸誘導(dǎo)后苜蓿幼苗葉片中過(guò)氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性變化，旨在確定草酸誘導(dǎo)苜蓿抗霜霉病作用的安全使用量和持效期，為利用草酸防治苜蓿霜霉病提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試植株及菌種 供試苜蓿品種為“新疆大葉”，由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)草環(huán)學(xué)院育種基地提供。

供試苜蓿霜霉菌，采自田間自然發(fā)病植株，在20 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)水培備用［19］。

1.1.2 供試藥劑及濃度 草酸為天津市福晨化學(xué)試劑廠生產(chǎn)，品質(zhì)為分析純。草酸用蒸餾水溶解，藥液經(jīng)細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾。在前期預(yù)試驗(yàn)過(guò)程中，草酸濃度分別為1 和5 mmol·L－1時(shí)，誘導(dǎo)酶活性變化差異不顯著，草酸濃度為50 mmol·L－1時(shí)，苜蓿苗葉片發(fā)黃，顯示輕度藥害癥狀，故將其稀釋至供試濃度分別為10、20、30、40 mmol·L－1備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 苜蓿苗培養(yǎng) 參照孫濤等［4］的方法培養(yǎng)苜蓿苗，待真葉長(zhǎng)至十葉期時(shí)接種。

1.2.2 草酸對(duì)苜蓿幼苗誘導(dǎo)抗病性測(cè)定 選擇十葉期的苜蓿健康幼苗，配制不同濃度10、20、30、40 mmol·L－1的草酸溶液噴霧處理，以清水作對(duì)照。共噴藥兩次，間隔3 d，第2 次噴藥3 d 后接種，每個(gè)處理重復(fù)3 次。苜蓿霜霉病菌的制備和接種方法參照李克梅等［19］的方法進(jìn)行。孢子囊溶液配好后立即施用，均勻噴灑到健康苜蓿葉片的正反兩面，先保濕暗培養(yǎng)24 h，然后在溫度18 ～20 ℃、相對(duì)濕度60% ～80%、光照強(qiáng)度1 500 lx、日光照8 ～10 h 人工生長(zhǎng)箱中培養(yǎng)。一周后采集所有葉片調(diào)查發(fā)病情況，根據(jù)苜蓿霜霉病的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)病葉數(shù)，記錄病葉癥狀反應(yīng)級(jí)別，計(jì)算病情指數(shù)和誘抗效果。

1.2.3 苜蓿霜霉病嚴(yán)重度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn) 0 級(jí):無(wú)病斑;1 級(jí):病斑面積小于葉片總面積的1/3;2 級(jí):病斑面積大于葉片總面積的1/3，但小于2/3;3 級(jí):病斑面積大于葉片總面積的2/3［20］。

1.2.4 苜蓿葉片內(nèi)防御酶活性的測(cè)定 選用健康的苜蓿種子，消毒催芽播種于花盆內(nèi)(每盆15 株)。方法同1.2.1。待苜蓿幼苗長(zhǎng)到十葉期時(shí)，用草酸對(duì)苜蓿幼苗誘導(dǎo)抗病性測(cè)定試驗(yàn)中確定濃度的草酸溶液噴霧處理苜蓿植株，以葉片上均勻布滿微小霧點(diǎn)為宜，以清水為對(duì)照。分別在經(jīng)草酸溶液噴霧處理后的1、3、5、7 和9 d 測(cè)定苜蓿葉片中POD、PAL、SOD 的活性。每處理重復(fù)3 次。

POD 活性測(cè)定采用Ye 等［21］的方法;SOD 和PAL 活性測(cè)定采用湯章城［22］的方法。各樣品測(cè)定3 次，3 個(gè)重復(fù)。以上方法均略有改動(dòng)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Excel 和DPS 7.05 軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度草酸對(duì)苜蓿幼苗抗霜霉病的誘抗效果

不同濃度草酸溶液處理的苜蓿植株與對(duì)照相比抗病性明顯增強(qiáng)，在10 ～40 mmol·L－1草酸溶液誘導(dǎo)下，誘抗效果呈上升趨勢(shì)(表1)。處理濃度為40 mmol·L－1時(shí)，誘抗效果可達(dá)50.8%。草酸濃度10、20、30 mmol·L－1之間誘抗效果均差異顯著(P ＜0.05)，30 和40 mmol·L－1處理間的誘抗效果無(wú)顯著差異(P ＞0.05)。當(dāng)草酸濃度為40 mmol·L－1時(shí)，盡管其防治效果最好，但與30 mmol·L－1處理間無(wú)顯著差異，從實(shí)用和經(jīng)濟(jì)角度考慮，選用30 mmol·L－1為誘導(dǎo)處理適宜濃度。因此，在苜蓿葉片防御酶活性測(cè)定中以30 mmol·L－1為處理濃度。

表1 草酸對(duì)苜蓿霜霉病的誘導(dǎo)抗病效果Table 1 Effects of alfalfa resistance against downy mildew induced by oxalic acid

2.2 草酸處理對(duì)苜蓿葉片防御酶活性的影響

2.2.1 草酸對(duì)過(guò)氧化物酶(POD)活性的影響 經(jīng)30 mmol·L－1草酸溶液誘導(dǎo)處理后1 ～9 d 的苜蓿葉片的POD 活性均有提高，其活性呈先升后降的趨勢(shì)，草酸誘導(dǎo)處理1、3、5、7 和9 d 后，苜蓿葉片組織內(nèi)POD 活性分別為對(duì)照的1.04、1.26、1.59、1.18和1.27 倍。從誘導(dǎo)后1 d 開(kāi)始，POD 活性持續(xù)升高，并 于 誘 導(dǎo) 處 理 后 5 d 達(dá) 到 最 大(8. 22 U·g－1·min－1)，而此時(shí)對(duì)照的POD 活性為5.16 U·g－1·min－1。之后酶活性開(kāi)始下降，至誘導(dǎo)處理后9 d 時(shí)降至6.05 U·g－1·min－1，但仍顯著高于對(duì)照(P ＜0.05)(圖1)。

圖1 草酸對(duì)苜蓿葉片POD 酶活性影響Fig.1 Effects of oxalic acid on alfalfa POD activity

2.2.2 草酸對(duì)苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的影響苜蓿葉片中PAL 活性在30 mmol·L－1草酸溶液誘導(dǎo)處理后1 ～9 d 均高于對(duì)照，分別為對(duì)照的1.05、1.08、1.39、1.31 和1.30 倍，且從3 d 開(kāi)始均與對(duì)照差異顯著(P ＜0.05)，至5 d 時(shí)達(dá)到最大值(5.64 U·g－1·h－1)，而此時(shí)對(duì)照的PAL 活性為4.06 U·g－1·h－1。之后PAL 活性開(kāi)始下降，但7 d和9 d 時(shí)PAL 活性依然能分別達(dá)到4.91 和4.67 U·g－1·h－1，說(shuō)明草酸誘導(dǎo)可使PAL 活性增強(qiáng)，且能持續(xù)到9 d(圖2)。

2.2.3 草酸對(duì)超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響經(jīng)30 mmol·L－1草酸溶液誘導(dǎo)處理不同時(shí)間苜蓿葉片中SOD 活性均顯著高于對(duì)照(P ＜0.05)，誘導(dǎo)處理1、3、5、7 和9 d 后，苜蓿葉片組織內(nèi)SOD 活性分別為對(duì)照的1.10、1.56、1.29、1.37 和1.40 倍。誘導(dǎo)后3 d，苜蓿葉片組織內(nèi)SOD 活性達(dá)到最大(642.47 U·g－1)，而此時(shí)對(duì)照的SOD 活性為412.15 U·g－1，處理5、7 和9 d 后的苜蓿葉片SOD活性略有下降，但均顯著高于對(duì)照(P ＜0.05)(圖3)。

圖2 草酸對(duì)苜蓿葉片PAL 酶活性影響Fig.2 Effects of oxalic acid on alfalfa PAL activity

圖3 草酸對(duì)苜蓿葉片SOD 酶活性影響Fig.3 Effects of oxalic acid on alfalfa SOD activity

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，10 ～40 mmol·L－1草酸溶液均可降低苜蓿幼苗霜霉病的病情指數(shù)，且隨草酸濃度增加誘抗效果呈上升趨勢(shì)，但草酸濃度為30和40 mmol·L－1時(shí)，誘導(dǎo)防效無(wú)顯著差異(P ＞0.05)，這說(shuō)明誘導(dǎo)劑在一定濃度范圍內(nèi)可能與植物獲得的誘導(dǎo)抗性程度呈正相關(guān)，但當(dāng)誘導(dǎo)劑達(dá)到一定濃度后就可充分誘導(dǎo)植株體內(nèi)相關(guān)防御機(jī)制的運(yùn)轉(zhuǎn)，之后并不隨著誘導(dǎo)劑濃度增大而使植株誘導(dǎo)抗性繼續(xù)增強(qiáng)。在植物的誘導(dǎo)抗病過(guò)程中伴隨著一系列物質(zhì)的代謝，其中關(guān)鍵因子就是催化這些反應(yīng)的酶［12］。本試驗(yàn)中使用誘導(dǎo)劑草酸處理苜蓿幼苗后，葉片組織中POD、PAL、SOD 活性比清水處理均有不同程度的提高，表明外源草酸可提高苜蓿葉片相關(guān)防御酶活性，草酸誘導(dǎo)苜蓿對(duì)霜霉病抗性獲得可能與相關(guān)防御酶活性的提高有關(guān)，此研究結(jié)果與在黃瓜(Cucumis sativus)［23］、油菜(Brassica campestris)［24］上的研究結(jié)果基本一致。另外，隨著30 mmol·L－1草酸溶液處理時(shí)間的推移，3 種酶活性均高于清水對(duì)照，但總體呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，可能是外源草酸激活了與POD、PAL、SOD 表達(dá)有關(guān)的信號(hào)分子，使其表達(dá)量上升到一定峰值，但隨后可能隨著草酸被消耗，相應(yīng)的酶活性又逐漸降低，直至處理后9 d，活性仍然高于清水對(duì)照，說(shuō)明草酸誘導(dǎo)的持效性大于9 d。

誘導(dǎo)抗性技術(shù)是植物病害防治的一條新途徑，特別是對(duì)生產(chǎn)上缺乏抗病品種和有效的化學(xué)防治藥劑或者不適合使用化學(xué)農(nóng)藥的植物病害尤為重要。在苜蓿病害防治中，由于化學(xué)農(nóng)藥的使用不利于綠色奶業(yè)的發(fā)展，故誘導(dǎo)抗性的研究可為尋找苜蓿病害安全防控新技術(shù)提供依據(jù)。草酸是一種有效的非生物誘導(dǎo)劑，應(yīng)用外源草酸可顯著降低林木炭疽病、西瓜花葉病毒病、油菜菌核病、黃瓜炭疽病、黃瓜霜霉病等病害的病情指數(shù)，提高植物對(duì)病害的抗性［23］。本研究結(jié)果證明，外源草酸能顯著降低苜蓿霜霉病的病情指數(shù)，提高苜蓿對(duì)霜霉病的抗性，且抗性持效期至少在9 d。

本試驗(yàn)只針對(duì)苜蓿的單個(gè)病害進(jìn)行了單一誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)抗病，對(duì)于同一種誘導(dǎo)劑能否對(duì)苜蓿的其他病害產(chǎn)生誘導(dǎo)作用以及不同誘導(dǎo)劑組合使用效果如何等方面尚未涉及，有待進(jìn)一步研究。

［1］ 耿華珠，吳永敷，曹致中.中國(guó)苜蓿［M］.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1995:114-120.

［2］ 許志剛.普通植物病理學(xué)［M］.第四版.北京:高等教育出版社，2009:49.

［3］ 南志標(biāo)，李春杰.中國(guó)牧草真菌病害名錄［J］.草業(yè)科學(xué)，1994，11:22-25.

［4］ 孫濤，曹致中，馬暉玲，徐廣平.水楊酸誘導(dǎo)苜蓿對(duì)霜霉病抗性的研究［J］.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，41(3):61-64.

［5］ Sticher L，Mauch-Mani B，Métraux J P.Systemic acquired resistance［J］.Annual Review of Phytopatholoy，1997，35:235-270.

［6］ 俞振明，李家玉，林志華，張奇，何海斌.植物抗性誘導(dǎo)防御病蟲(chóng)草害的研究進(jìn)展［J］.農(nóng)業(yè)科學(xué)研究，2013，34(2):69-76.

［7］ 王海華，康健.植物誘導(dǎo)抗病性及應(yīng)用前景［J］.生物學(xué)通報(bào)，2001，36(6):3-5.

［8］ 向妙蓮，何永明，付永琦，曾曉春，黃俊寶，黃友明. 茉莉酸甲酯對(duì)水稻白葉枯病的誘導(dǎo)抗性及相關(guān)防御酶活性的影響［J］.植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2013，40(2):97-102.

［9］ 向妙蓮，陳明，曾曉春，何永明，黃俊寶.茉莉酸甲酯對(duì)水稻幼苗抗細(xì)菌性條斑病的誘導(dǎo)效應(yīng)［J］. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，33(4):679-683.

［10］ 張雪芹，鄭明瓊，賴瑞云，鐘贊華.誘導(dǎo)劑對(duì)番木瓜環(huán)斑病毒病的防治效果［J］.植物保護(hù)，2012，38(2):178-181.

［11］ 孫嘉曼，傅俊范，嚴(yán)雪瑞，周如軍.相關(guān)防御酶對(duì)人參銹腐病誘導(dǎo)抗性的響應(yīng)［J］.植物病理學(xué)報(bào)，2012，42(4):396-403.

［12］ 徐林波，劉正坪，王海霞，楊海清，烏蘭巴特爾. 茉莉酸對(duì)苜?？共⌒缘恼T導(dǎo)作用［J］. 中國(guó)草地學(xué)報(bào)，2013，35(5):57-61.

［13］ 王勇剛，曾富華，吳志華，羅澤民.植物誘導(dǎo)抗病與病程相關(guān)蛋白［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2002，28(2):177-182.

［14］ 張?jiān)?，劉英?非殺菌劑化合物防治瓜類病害的研究［J］.植物病理學(xué)報(bào)，1992，22(3):241-244.

［15］ 鄭光宇，趙榮樂(lè).草酸誘導(dǎo)甜瓜對(duì)南瓜花葉病毒的系統(tǒng)抗性［J］.北京師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，1999，35(3):390-393.

［16］ 楊榮金，彭新湘，姜子德，郭振飛，李明啟. 草酸誘導(dǎo)黃瓜抗炭疽病的機(jī)理研究［J］. 植物病理學(xué)報(bào)，2000，30(2):153-157.

［17］ 張偉麗，郭振飛，何華玄.水楊酸和草酸誘導(dǎo)柱花草對(duì)炭疽病的抗性［J］.中國(guó)草地學(xué)報(bào)，2006，28(4):53-59.

［18］ 李玉紅，陳鵬，程智慧，杜慧芳.草酸和BTH 對(duì)黃瓜幼苗霜霉病抗性和胞間隙病程相關(guān)蛋白的誘導(dǎo)［J］.植物病理學(xué)報(bào)，2006，36(3):238-243.

［19］ 李克梅，張博，方芳.苜蓿品種(品系)抗霜霉病能力測(cè)定初報(bào)(簡(jiǎn)報(bào))［J］.草地學(xué)報(bào)，2008，16(6):667-668.

［20］ 閔繼淳，李擁軍，陳穎，李淑平，徐鄭偉.新牧二號(hào)紫花苜?？顾共∧芰Φ难芯浚跩］.八一農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1995，18(4):14-17.

［21］ Ye X S，Pan S Q，Ku'c J.Activity，isozyme pattern，and cellular localization of peroxidase as related to systemic resistance of tobacco to blue mold (Peronospora tabacina)and to tobacco mosaic virus［J］.Phytopathology，1990，80(12):1295-1298.

［22］ 湯章城.現(xiàn)代植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指南［M］.北京:科學(xué)出版社，2004:314-322.

［23］ 李玉紅，程智慧，孟煥文，杜慧芳.草酸誘導(dǎo)黃瓜幼苗對(duì)霜霉病的抗性與H2O2的關(guān)系［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2008，28(6):1160-1164.

［24］ 毛瑋，侯英敏，劉志文.核盤菌和草酸誘導(dǎo)下的油菜幾種酶活力的變化分析［J］. 大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，30(1):39-42.