王書珍等

摘要：利用FIASCO方法（Fast Isolation by AFLP Sequences COntaining repeats）構建杜鵑（Rhododendron simsii Planch.）的（AG）n微衛(wèi)星富集文庫。通過菌液PCR檢測，從（AG）n微衛(wèi)星富集文庫的356個陽性菌落中篩選了233個進行測序分析。結果表明，202個序列富含SSR位點，陽性比率達86.7%。去除雜峰、疊峰、信號弱的序列，最終篩選39個供后續(xù)引物開發(fā)使用，其中完美型SSR有22個，不完美型5個，混合型12個。磁珠富集法構建杜鵑基因組微衛(wèi)星文庫是一條高效可行的途徑，為微衛(wèi)星位點的分離、杜鵑種群遺傳多樣性和遺傳結構的研究奠定了基礎。

關鍵詞：杜鵑（Rhododendron simsii Planch.）；微衛(wèi)星；探針；富集文庫

中圖分類號：S685.21；Q343.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）03-0627-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.03.030

Constructing Microsatellite-enriched Library of Rhododendron simsii Planch.

WANG Shu-zhen，JIN Wei-bin，XIANG Jun，ZHENG Yong-liang，F(xiàn)ANG Yuan-ping，

GAN Jian-ping，CHENG Hua，DU Hang

（Hubei Key Laboratory of Economic Forest Germplasm Improvement and Resource Comprehensive Utilization/College of Life Science， Huanggang Normal University， Huanggang 438000， Hubei， China）

Abstract： （AG）n microsatellite-enriched library of Rhododendron simsii Planch. was constructed by FIASCO（Fast Isolation by AFLP Sequences COntaining repeats） method. Among 356 positive colonies verified by colony PCR of （AG）n microsatellite-enriched library， 233 colonies were chosen for further sequencing. Results showed that 202 colonies contained microsatellites， accounting for 86.7%. Discarding sequences with miscellaneous peak， overlapping peaks and weak signal， 39 sequences were selected for primer exploitation. The perfect， imperfect and compound microsatellite repeat types were 22， 5 and 12， respectively. The FIASCO method was efficient for constructing the enrichment library of R. simsii Planch. microsatellite. It will lay foundation for developing microsatellite markers and studying genetic diversity and genetic structure of Rhododendron species.

Key words： azalea（Rhododendron simsii Planch.）； microsatellite； probe； enriched library

杜鵑花（Rhododendron spp.）泛指杜鵑花科（Ericaceae）杜鵑花屬（Rhododendron）植物，具有極高的觀賞價值，并被譽為“花中西施”和“木本花卉之王”[1，2]。杜鵑花在亞洲、歐洲、北美洲等地廣泛分布，并且因氣候條件不同而垂直分布明顯，從而形成了常綠大喬木、常綠小喬木、常綠灌木、落葉灌木等不同形態(tài)特征的地理居群[3]。杜鵑花兼有美學觀賞、生態(tài)保護、藥用治療、科學研究等價值[1]。杜鵑花屬近1 000種，中國有571種，其中特有種多達400多個[4]。在中國，云南、西藏、四川三?。ㄗ灾螀^(qū)）交匯處的橫斷山脈是世界杜鵑花的發(fā)源地和分布中心[5]。近幾年來，在氣候變化與人類活動日漸加劇的大背景下，杜鵑花的種質(zhì)資源也受到不同程度的影響，甚至出現(xiàn)退化現(xiàn)象。因此，亟須對現(xiàn)有的杜鵑花資源進行科學的評價，并制定切實可行的遺傳保護策略。

微衛(wèi)星（Microsatellite），又稱簡單重復序列（Simple sequence repeat，SSR），是以1～6 bp核苷酸為重復單位且均勻分布于生物基因組中的串聯(lián)重復序列。微衛(wèi)星標記因其分布廣泛、多態(tài)性強、信息含量豐富、遺傳穩(wěn)定性好、共顯性遺傳等特點，而被廣泛應用于作物的遺傳結構分析、遺傳育種、圖譜構建、基因定位、親緣關系分析及種質(zhì)資源鑒定等研究中[6-9]。Naito等[10]率先從R. metternichii基因組內(nèi)開發(fā)了SSR分子標記。Tan等[11]從 R. simsii 基因組內(nèi)開發(fā)了8個SSR標記。Wang等[12]從R. decorum基因組內(nèi)開發(fā)了24個微衛(wèi)星標記。Wang 等[13]從 R. delavayi 和 R. decorum基因組內(nèi)開發(fā)了38對SSR引物，其中9對可以跨物種擴增。Delmas等[14]Charrier等[15]用454 焦磷酸測序技術從R. ferrugineum基因組內(nèi)開發(fā)了18個微衛(wèi)星標記。

現(xiàn)有的SSR標記難以滿足對杜鵑花種群的遺傳變異特征、基因流、種群進化歷史、遺傳圖譜構建等研究中對微衛(wèi)星標記數(shù)量的需求。因此，本研究以（AG）n為探針構建杜鵑花特有種杜鵑（Rhododendron simsii Planch.）的基因組微衛(wèi)星富集文庫，旨在為杜鵑花群體遺傳學分析、遺傳圖譜構建、花期性狀基因的關聯(lián)分析、QTL定位等研究提供高效的SSR標記。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料來源 杜鵑樣品取自湖北省麻城市龜峰山山頂“杜鵑花王”的幼嫩葉片。樣品采集后置于自封袋內(nèi)，并放入冰盒中，帶回實驗室置-80 °C冰箱備用。

1.1.2 試劑 DNA限制性內(nèi)切酶MseI、T4 DNA連接酶購自NEB（NewEngland Biolabs）。Taq DNA 聚合酶、dNTPs均購天根生物公司。鏈霉親和素磁珠M-280試劑盒（Dynalbeads M-280 Streptavidin，112-05D）、磁珠收集器（Dynal MPC，123-20D）購于Invitrogen。克隆載體pMD18-T購于TaKaRa，轉(zhuǎn)化用的大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞由經(jīng)濟林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點實驗室保存。AFLP接頭序列Oligo-MseI-A（5′-TACTCAGGACTCAT-3′）和Oligo-MseI-B（5′-GACGATGAGTCCTGAG-3′）由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。生物素標記的（AG）n探針由Invitrogen生物公司合成： 5′-Biotin-（AG）13。MseI-N混合組由上海生工生物工程技術服務有限公司合成：5′-GATGAGTCCTGAGTAAN-3′，N=A， T， G， C。M13通用引物由南京金斯瑞生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 提取 DNA提取方法參照改良的CTAB提取法[16]，并略作修改。提取的“杜鵑花王”基因組DNA經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測和紫外分光光度計檢測后，記錄原始結果，并將基因組DNA稀釋至終濃度為100 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 微衛(wèi)星富集文庫的構建 參照FIASCO（Fast Isolation by AFLP of Sequences COntaining repeats）方法構建微衛(wèi)星富集文庫[17]。利用MseI 限制性內(nèi)切酶對1 μg的基因組DNA進行酶切，酶切成功的標準是出現(xiàn)100～1 000 bp的彌散帶譜；將酶切后的基因組 DNA 片段回收并加 Mse I接頭（Oligo-MseI A 和Oligo-MseI B）；利用Mse I-N引物對連接片段進行預擴增（12/14/16/18/20個循環(huán)），篩選擴增產(chǎn)物剛剛能在瓊脂糖凝膠上呈現(xiàn)的擴增產(chǎn)物（100～1 000 bp）；將預擴增產(chǎn)物先后與Biotin-（AG）13 探針和鏈霉親和素包被的磁珠進行雜交，經(jīng)過系列非嚴格洗脫和嚴格洗脫后回收目的DNA片段；對回收的DNA片段進行30個循環(huán)的PCR擴增，回收200～800 bp的片段，與pMD18-T載體進行TA克隆并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞內(nèi)，涂布在含有氨芐霉素的培養(yǎng)基上。

1.2.3 陽性克隆的測序及分析 經(jīng)氨芐抗性篩選和IPTG誘導后，挑取白色克隆。以M13通用引物進行菌液PCR檢測，擴增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳分析，挑取擴增片段大于500 bp的克隆交由南京金斯瑞生物科技有限公司測序。以M13通用引物進行雙向測序，序列比對拼接后用在線軟件VecScreen（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen/）去除載體序列和MseI接頭序列。利用軟件TRF（Tandem repeat finder，version 3.2.1）[17]查找序列的微衛(wèi)星位點。按照Weber[18]的微衛(wèi)星分類標準對杜鵑花基因組SSR位點進行分類。

2 結果與分析

2.1 提取的杜鵑基因組DNA

提取的“杜鵑花王”基因組DNA在0.8%的瓊脂糖凝膠上呈現(xiàn)比較完整的DNA條帶，條帶大于20 kb，并且無明顯的DNA降解現(xiàn)象（圖1）。利用紫外分光光度計對提取的“杜鵑花王”基因組DNA進行檢測，發(fā)現(xiàn)改良的CTAB法所提取的杜鵑花基因組DNA濃度和純度均比較好，OD260 nm/OD280 nm=1.746 3，DNA的濃度為3.76 μg/μL。因此，提取的DNA適合后續(xù)杜鵑花微衛(wèi)星富集文庫的構建。

2.2 微衛(wèi)星富集文庫的構建以及鑒定

對1 μg“杜鵑花王”基因組DNA的酶切結果見圖2，與未處理的對照樣品相比，經(jīng)MseI限制性內(nèi)切酶酶切的DNA呈彌散帶型，并且大小分布在100～1 000 bp之間，符合微衛(wèi)星富集文庫構建的要求。將回收后的酶切片段與MseI接頭相連，并對連接產(chǎn)物進行預擴增。根據(jù)文獻資料，設置不同的循環(huán)進行擴增。對比發(fā)現(xiàn)，16個循環(huán)的擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上剛剛能夠呈現(xiàn)，小于14個循環(huán)的擴增產(chǎn)物太少而不適合下游的磁珠富集，而多于18個循環(huán)的擴增產(chǎn)物過多，會導致下游陽性克隆子重復出現(xiàn)，因此選擇16個循環(huán)的擴增產(chǎn)物與Biotin-（AG）13探針進行雜交。經(jīng)多次雜片段的洗脫后，采用95 ℃預熱的TE溶液洗脫與探針雜交的目的片段，擴增30個循環(huán)，并進行TA克隆轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10細胞內(nèi)構建微衛(wèi)星富集文庫。經(jīng)氨芐抗性篩選和IPTG誘導后，從平板上挑取了356個克隆子。經(jīng)菌液PCR檢測，挑取233個克隆片段大于500 bp的克隆交由測序公司測序（圖3）。

2.3 測序分析

對上述測序的克隆，舍棄雜峰、信號弱的序列，最終得到（AG）n微衛(wèi)星富集文庫的202條序列片段，部分測序結果見圖4。在富含微衛(wèi)星位點的202條序列內(nèi)，有26個序列在微衛(wèi)星位點的下游出現(xiàn)了疊峰；還有31個序列在微衛(wèi)星位點的上游側(cè)翼序列過短，不適合后續(xù)的SSR引物設計；6個克隆與其他序列有重復。因此，最后挑選了139個序列供后續(xù)研究。

利用在線TRF軟件對139條微衛(wèi)星序列片段進行分析，（AG）n文庫內(nèi)序列的主要重復類型為（AG）n、（GA）n、（CT）n、（TC）n，以及由這些微衛(wèi)星重復單元組成的復合型微衛(wèi)星。在所檢測的微衛(wèi)星位點內(nèi)，重復次數(shù)最少為8次，最多可達36次，主要重復次數(shù)分布在22～31之間。不完美型的微衛(wèi)星位點，重復序列之間插入的堿基數(shù)為3～7個，以胞嘧啶和鳥嘌呤核苷酸堿基居多。復合型微衛(wèi)星內(nèi)既有（TC）n與（TA）n雙堿基重復的混合類型，也有（GA）n與（AT）n混合的類型，更有Cn和（CT）n類型的重復組合。

利用Primer Premier 5.0軟件對重復次數(shù)大于12的序列進行分析，有39個序列能夠設計出得分大于85分的SSR引物，可用于SSR引物開發(fā)的序列。這39個序列內(nèi)部的微衛(wèi)星類型、5′核心序列、3′端側(cè)翼序列如表1所示。依據(jù)Weber[19]提出的標準為序列進行分類，發(fā)現(xiàn)杜鵑的微衛(wèi)星富集文庫內(nèi)以完美型微衛(wèi)星類型居多：完美型SSR有22個，占56.41%；不完美型5個，占12.82%；混合型SSR有12個，占30.77%。

3 小結與討論

在湖北麻城的龜峰山風景區(qū)內(nèi)，有著連片面積達6 000多公頃的杜鵑花灌木叢，建群種主要是杜鵑。該杜鵑群落的平均樹齡在100～300年之間，而被譽為“杜鵑花王”的樹齡大于500年，是世界上迄今為止發(fā)現(xiàn)的面積最大、品種最純、分布最集中的野生古杜鵑群落。龜峰山風景區(qū)的杜鵑特有種和變種不僅為湖北省生態(tài)旅游業(yè)的發(fā)展奠定了基礎，也為杜鵑的遺傳育種提供了優(yōu)良的材料[6]。因此，亟須對麻城杜鵑種質(zhì)資源進行研究，而SSR標記的開發(fā)是首要任務，微衛(wèi)星富集文庫的構建則是從基因組信息未知的物種內(nèi)開發(fā)SSR標記的前提。

微衛(wèi)星標記可以通過基因組分離、數(shù)據(jù)庫挖掘、近緣物種轉(zhuǎn)移等途徑獲得。微衛(wèi)星標記的開發(fā)是一件繁瑣且耗時的工作，傳統(tǒng)的微衛(wèi)星分離方法效率低且耗時，陽性率多為0.04%～12%[20]。本研究通過對基因組DNA的MseI酶切、特定接頭的連接、MseI-N簡并引物的PCR預擴增、生物素探針雜交、磁珠富集、多次洗脫、回收目的片段等途徑構建了杜鵑花（AG）n微衛(wèi)星富集文庫，陽性克隆比率高達86.7%。

在構建（AG）n文庫的同時，也同時利用生物素標記的（AT）13、（GCC）9、（CTAT）6探針構建富集文庫，但最終只從篩選平板上各挑取了15、9、7個克隆，測序分析均為陰性，可能的原因是杜鵑花基因組內(nèi)（AT）n、（GCC）n、（CTAT）n類型的微衛(wèi)星位點比較少見。在（AG）n文庫的構建過程中，選擇的是（AG）13探針，主要是因為探針中堿基的增加會直接影響雜交退火溫度和雜交的效率，而堿基過少則影響陽性克隆率。

采用菌液PCR技術對克隆子進一步篩選，擴增片段長度大于500 bp的克隆才會進行下一步的測序分析。M13通用引物所擴增的片段包括載體序列和外源插入序列，因此如果片段過短，即便是含有微衛(wèi)星位點，其兩側(cè)也沒有足夠的側(cè)翼序列供SSR引物的開發(fā)，因此選擇片段長度大于500 bp的克隆。據(jù)以往在蓮、苦瓜、慈姑等物種內(nèi)的研究經(jīng)驗，重復次數(shù)大于12的二堿基微衛(wèi)星位點在群體內(nèi)的多態(tài)性比較豐富[17]。因此，結合Primer Premier 5.0軟件的分析結果，最終篩選39個序列以供后期杜鵑花基因組SSR引物的設計。

綜上所述，F(xiàn)IASCO富集法能夠有效地從杜鵑基因組DNA內(nèi)分離到微衛(wèi)星座位，在所測序的233個克隆內(nèi)，202個序列富含SSR位點，陽性比率高達86.7%，便于后續(xù)的引物設計與開發(fā)，同時為麻城龜峰山杜鵑種質(zhì)資源現(xiàn)狀的遺傳評估、遺傳結構分析、遺傳圖譜構建、目標性狀關聯(lián)分析、QTL定位、種群進化潛力和進化路線的研究奠定了基礎。

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