楊倩，盧麗莉，孟麗嬋，宋春紅

（1石家莊市第四醫(yī)院，石家莊050011;2石家莊市第三醫(yī)院）

妊娠早期母體子宮蛻膜化和胚胎絨毛的正常發(fā)育是建立有效母體—胎兒循環(huán)的關(guān)鍵因素，胚胎的絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞（EVT）侵入母體的蛻膜組織是影響胎盤及胎兒發(fā)育的重要環(huán)節(jié)之一［1］，EVT在妊娠早期主要位于胎盤著床部位，逐漸侵入子宮蛻膜組織及螺旋動脈，供應(yīng)日益增長的胎盤及胎兒的營養(yǎng)需要。EVT增殖、遷移及浸潤受很多局部信號分子的調(diào)節(jié)。體外實驗表明，胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7（IGFBP7）及血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）對EVT發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用［2，3］，同時有研究顯示 IGFBP7可以通過調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)影響血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成過程［4，5］。早期自然流產(chǎn)是婦產(chǎn)科常見的病理性妊娠，自然流產(chǎn)時 IGFBP7及 VEGF在EVT的表達(dá)情況國內(nèi)外尚未見報道。本研究觀察了早期自然流產(chǎn)患者EVT中IGFBP7、VEGF的表達(dá)變化，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2013年3月～2014年3月石家莊市第四醫(yī)院收治的早期自然流產(chǎn)患者20例（觀察組），年齡（28.2 ±3.4）歲，孕期（51.2 ±4.6）d;均經(jīng)B超檢查診斷為胚胎在宮內(nèi)死亡尚未自然排出且病因不明者（女方基礎(chǔ)體溫呈雙向，男方精液正常，夫妻雙方與流產(chǎn)有關(guān)的檢查均正常，包括染色體分析、內(nèi)分泌激素及免疫學(xué)檢測、盆腔超聲等）。另選同期收治自愿要求進(jìn)行人工流產(chǎn)健康婦女20例（對照組），年齡（27.5 ±2.6）歲，孕期（53.7 ±5.4）d;均無死胎、死產(chǎn)、自然流產(chǎn)史，本次妊娠期間無先兆流產(chǎn)的癥狀和體征，B超檢查提示胚胎發(fā)育正常，無用藥、病毒感染以及X線接觸史。兩組一般資料無統(tǒng)計學(xué)差異，具有可比性。

1.2 EVT中 IGFBP7、VEGF檢測 ①標(biāo)本采集及處理:兩組均采用可視人工流產(chǎn)手術(shù)，從刮出物中取蛻膜及絨毛種植部位蛻膜組織（底蛻膜），生理鹽水漂洗后，置于10%中性甲醛溶液中固定6～12 h，梯度乙醇脫水后石蠟包埋，5 μm切片。②HE染色及底蛻膜的辨別:在HE染色切片下觀察底蛻膜組織中的EVT是無清晰邊界的多角形細(xì)胞，含豐富的雙染性胞質(zhì)，核深染、不規(guī)則、具有輕度多形性。蛻膜細(xì)胞具有清晰的細(xì)胞膜，輕度嗜伊紅的胞質(zhì)和卵圓形的細(xì)胞核。當(dāng)兩者鑒別困難時，加用免疫組化染色CK和HPL加以鑒別。選取有底蛻膜成分的蠟塊，切片進(jìn)行免疫組化檢測。③免疫組化染色:所用一抗為兔抗人IGFBP7 多克隆抗體（1∶200，Epitomics公司）及兔抗人VEGF多克隆抗體（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司），運用 SP法檢測兩組底蛻膜 IGFBP7及VEGF。免疫組化檢測試劑盒（SP-9001）和DAB酶底物顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。操作嚴(yán)格按免疫組化檢測試劑盒說明書要求進(jìn)行，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。陰性對照以PBS代替一抗進(jìn)行。④結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn):采用雙盲法在顯微鏡下（10×10）觀察EVT著色情況，以細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為IGFBP7及VEGF表達(dá)陽性，每張切片隨機(jī)觀察10個視野。免疫組化染色結(jié)果采用半定量“Quickscore”法［6］判讀，細(xì)胞染色強(qiáng)度:陰性計0分，弱陽性計1分，中等程度陽性計2分，強(qiáng)陽性計3分;視野內(nèi)陽性細(xì)胞百分比:0～25%細(xì)胞著色計0分，25%～50%細(xì)胞著色計1分，50% ～75%細(xì)胞著色計2分，75% ～100%細(xì)胞著色計3分。細(xì)胞染色強(qiáng)度和密度的得分相乘再相加得到免疫染色評分（IRS）:0～12分的變化范圍。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗。觀察組IGFBP7與VEGF表達(dá)的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

觀察組及對照組IGFBP7 IRS分別為（10.75±1.28）、（8.63 ±1.06）分，VEGF IRS 分別為（5.25 ±1.98）、（7.75 ±2.25）分，兩組比較，P均 ＜ 0.05。Pearson相關(guān)分析顯示，觀察組IGFBP7與VEGF表達(dá)無相關(guān)性（r=-0.32，P=0.44）。

3 討論

早期自然流產(chǎn)是臨床常見的病理性妊娠，其發(fā)病率非常高，在對包括沒有或幾乎沒有早期自然流產(chǎn)臨床癥狀的孕婦在內(nèi)的所有孕婦人群進(jìn)行的前瞻性研究中，幾乎50%的妊娠因自然流產(chǎn)而終止［7］。早期自然流產(chǎn)病因復(fù)雜，其與染色體異常、內(nèi)分泌紊亂、解剖學(xué)異常等因素有關(guān)，但仍有部分病例發(fā)病機(jī)制不明。EVT侵入母體的蛻膜組織是影響胎盤絨毛發(fā)育及母體—胎兒循環(huán)建立重要環(huán)節(jié)之一，受激素、細(xì)胞因子等多種信號分子的調(diào)控，其中包括VEGF和 IGFBP7。

3.1 IGFBP7在EVT表達(dá)升高與早期自然流產(chǎn)的關(guān)系 IGFBP7廣泛分布于全身各組織，是一種重要的胰島素結(jié)合因子，還具有調(diào)控細(xì)胞活性、細(xì)胞分化和增殖等作用。IGFBP7在子宮間質(zhì)細(xì)胞蛻膜化過程中起重要作用［8］，胚胎植入后IGFBP7在子宮的表達(dá)明顯升高［9，10］。抑制 IGFBP7 的表達(dá)，小鼠懷孕率和孕卵著床率顯著降低。抑制IGFBP7表達(dá)，培養(yǎng)的滋養(yǎng)細(xì)胞增殖和浸潤能力亦減弱［11］。說明IGFBP7在調(diào)節(jié)母體的容受性、蛻膜化及胚胎植入過程中均發(fā)揮了重要作用，是維持生理性妊娠的重要調(diào)節(jié)因子之一。本研究顯示，觀察組EVT中IGFBP7 IRS高于對照組，我們推測其可能的機(jī)制有:①妊娠早期胚胎發(fā)育和胎盤形成是激素、細(xì)胞因子等多種因素調(diào)控的復(fù)雜而精密的過程，IGFBP7表達(dá)受到多種激素和細(xì)胞因子的影響，自然流產(chǎn)患者EVT中IGFBP7表達(dá)升高可能是多種因素綜合作用的結(jié)果，以IGFBP7促進(jìn)子宮蛻膜化及孕卵著床的保護(hù)性作用推測，自然流產(chǎn)時IGFBP7表達(dá)升高可能是機(jī)體啟動的一種保護(hù)性補(bǔ)救機(jī)制。②IGFBP7的表達(dá)隨著妊娠的進(jìn)展而相應(yīng)改變，如表達(dá)過度對胚胎發(fā)育和胎盤形成產(chǎn)生不利影響。Liu等［10］采用siRNA法使IGFBP7基因沉默后，培養(yǎng)的EVT分泌基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）及MMP-9明顯增多，即IGFBP7具有抑制MMP-2、MMP-9作用。胎盤形成過程中，MMP-2和MMP-9對細(xì)胞外基質(zhì)Ⅳ型和Ⅴ型膠原的降解是滋養(yǎng)細(xì)胞侵入蛻膜的必要條件［11］。自然流產(chǎn)過程中，絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞IGFBP7表達(dá)升高，可能以自分泌或旁分泌的方式過度抑制了MMP-2和MMP-9的表達(dá)，使EVT對細(xì)胞外膠原降解失調(diào)，抑制了EVT侵入蛻膜及對子宮螺旋小動脈的“血管重鑄”，參與了流產(chǎn)的發(fā)生;因此自然流產(chǎn)時EVT中IGFBP7升高是促進(jìn)流產(chǎn)發(fā)生還是一種保護(hù)性反應(yīng)尚有待進(jìn)一步研究。

3.2 VEGF在EVT表達(dá)降低與早期自然流產(chǎn)的關(guān)系 VEGF作為一種高效的促血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂原，廣泛表達(dá)于蛻膜、絨毛及子宮內(nèi)膜腺體［12］;在促進(jìn)胎盤絨毛及蛻膜組織血管形成中起著重要作用，不僅如此，孕早期 EVT也存在VEGF 及其受體flt-1 的表達(dá)［13］;研究［3］顯示VEGF還具有增加體外培養(yǎng)EVT增殖力的作用。本研究顯示，觀察組EVT中VEGF IRS低于對照組，說明VEGF有可能通過影響EVT的功能影響胎盤的發(fā)育。其可能通過如下機(jī)制參與了自然流產(chǎn)的發(fā)生:①EVT表達(dá)VEGF減少，可能抑制了EVT的增殖活性，使發(fā)育中的EVT數(shù)量不同程度減少，胎盤對子宮內(nèi)膜的錨定作用和營養(yǎng)吸收功能減弱;②血管滋養(yǎng)細(xì)胞分泌VEGF減少，血管滋養(yǎng)細(xì)胞向螺旋小動脈侵入的過程受挫，抑制了子宮螺旋動脈的生理性轉(zhuǎn)化，子宮螺旋動脈不能適時擴(kuò)張，子宮血循環(huán)壓力未能及時下降，影響了母胎交界的營養(yǎng)交換;③自然流產(chǎn)時，子宮處在相對缺氧的環(huán)境中，研究［8］表明VEGF在體外的絨毛膜癌細(xì)胞系BeWo通過激活Nrf2途徑減少氧化損傷，VEGF的表達(dá)下降，使得EVT耐受缺氧應(yīng)激的能力下降，EVT結(jié)構(gòu)和功能受損;當(dāng)上述機(jī)制累積到一定程度最終可能使得流產(chǎn)發(fā)生。

3.3 IGFBP7與VEGF的相互關(guān)系及其與早期自然流產(chǎn)的關(guān)系 本研究顯示，觀察組IGFBP7、VEGF表達(dá)無相關(guān)性。但有研究顯示，IGFBP7在不同的研究中對VEGF表達(dá)具有相反的調(diào)節(jié)效果。自然流產(chǎn)時，EVT同時存在IGFBP7表達(dá)升高和VEGF表達(dá)下降，我們分析有如下可能性:①自然流產(chǎn)時IGFBP7升高是一種保護(hù)性反應(yīng)。Liu等［10］發(fā)現(xiàn)，特異性抑制IGFBP7的表達(dá)后，孕7 d小鼠子宮VEGF表達(dá)明顯減少，說明IGFBP7具有上調(diào)VEGF表達(dá)的作用，自然流產(chǎn)的絨毛和蛻膜組織由于VEGF表達(dá)減少，胎盤形成部位血管生成不良，EVT處于相對缺氧的微環(huán)境，IGFBP7作為妊娠保護(hù)性分子被激活而表達(dá)增多，但其刺激VEGF的作用不足或存在某種信號機(jī)制障礙未能使VEGF的表達(dá)上調(diào)，IGFBP7升高不足以扭轉(zhuǎn)胎盤缺血缺氧的局面，流產(chǎn)難免發(fā)生。②IGFBP7過表達(dá)抑制了VEGF表達(dá)，促進(jìn)了自然流產(chǎn)的發(fā)生。Tamura等［4］研究表明，IGFBP7可通過抑制VEGF的表達(dá)抑制培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成，并通過抑制絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和環(huán)氧化酶（COX-2）途徑抑制VEGF誘導(dǎo)的大鼠卵巢早期黃體微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和管腔形成［5］。人胎盤血管生成大約發(fā)生在受精后32 d～25周，VEGF在這一過程中發(fā)揮了重要作用，自然流產(chǎn)時IGFBP7表達(dá)的升高可能通過抑制MAPK和COX-2途徑抑制VEGF的表達(dá)，從而影響絨毛及底蛻膜微血管的形成，胎盤血管網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建不良，導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生。

［1］ Huppertz B.Extravillous trophoblast:proliferation and invasion during pregnancy［J］.Pathologica，2003，95（5）:231-232.

［2］Liu ZK，Liu HY，F(xiàn)ang WN，et al.Insulin-like growth factor binding protein 7 modulates estrogen-induced trophoblast proliferation and invasion in HTR-8 and JEG-3 cells［J］.Cell Biochem Biophys，2012，63（1）:73-84.

［3］ Athanassiades A，Hamilton GS，Lala PK.Vascular endothelial growth factor stimulates proliferation but not migration or invasiveness in human extravillous trophoblast［J］.Biol Reprod，1998，59（3）:643-654.

［4］Tamura K，Hashimoto K，Suzuki K，et al.Insulin-like growth factor binding protein-7（IGFBP7）blocks vascular endothelial cell growth factor（VEGF）-induced angiogenesis in human vascular endothelial cells［J］.Eur J Pharmacol，2009，610（1-3）:61-67.

［5］Tamura K，Yoshie M，Hashimoto K，et al.Inhibitory effect of insulin-like growth factor-binding protein-7（IGFBP7）on in vitro angiogenesis of vascular endothelial cells in the rat corpus luteum［J］.J Reprod Dev，2014，60（6）:447-453.

［6］Detre S，Saclani Jotti G，Dowsett M.A"quickscore"method for immunohistochemical semiquantitation:validation for oestrogen receptor in breast carcinomas［J］.J Clin Pathol，1995，48（9）:876-878.

［7］Rebecca N.人類胎盤病理學(xué)手冊［M］.天津:天津科技翻譯出版公司，2008:116-118.

［8］Kweider N，F(xiàn)ragoulis A，Rosen C，et al.Interplay between vascular endothelial growth factor（VEGF）and nuclear factor erythroid 2-related factor-2（Nrf2）:implications for preeclampsia［J］.J Biol Chem，2011，286（50）:42863-42872.

［9］夏紅飛，孫敬，楊穎，等.胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-7在大鼠胚胎植入過程中的差異表達(dá)與調(diào)節(jié)［J］.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2007，34（3）:267-274.

［10］Liu ZK，Wang RC，Han BC，et al.A novel role of IGFBP7 in mouse uterus:regulating uterine receptivity through Th1/Th2 lymphocyte balance and decidualization［J］.PLoS One，2012，7（9）:e45224.

［11］王海燕，歸綏琪.MMPs及其調(diào)控因子與滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲［J］.生殖與避孕，2003，23（3）:164-168.

［12］Schiessl B，Innes BA，Bulmer JN，et al.Localization of angiogenic growth factors and their receptors in the human placental bed throughout normal human pregnancy［J］.Placenta，2009，30（1）:79-87.

［13］Cooper JC，Sharkey AM，McLaren J，et al.Localization of vascular endothelial growth factor and its receptor，flt，in human placenta and decidua by immunohistochemistry［J］.J Reprod Fertil，1995，105（2）:205-213.