谷志龍，姜華茂，胡占升(遼寧醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，遼寧錦州121001)

姜黃素對內毒素誘發(fā)的小鼠急性肺損傷的保護作用探討

谷志龍，姜華茂，胡占升
(遼寧醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，遼寧錦州121001)

摘要:目的觀察姜黃素對脂多糖(LPS)誘導的小鼠急性肺損傷(ALI)的保護作用，并探討其機制。方法60 只SPF級BALB/C雄性小鼠，隨機分為A～F組，每組各10只。A組腹腔注射生理鹽水4 mL/次，1次/d，共注射7 d; B組先腹腔注射生理鹽水4 mL/次，1次/d，連續(xù)注射7 d，第8天腹腔注射LPS 5 mg/kg; C組處理同B組，但在腹腔注射LPS前10～12 h每只小鼠先腹腔注射TLR-4/MD抗體50 μg; D、E、F組分別腹腔注射姜黃素200、150、100 mg/kg，1次/d，連續(xù)注射7 d，第8天腹腔注射1次LPS，劑量5 mg/kg。A組第8天、B～F組腹腔注射LPS后4～6 h，于無菌條件下取小鼠肺組織和外周血。采用動態(tài)濁度法測血漿LPS水平。取各組小鼠肺組織標本行HE染色，光鏡下觀察肺組織病理變化。用RT-PCR法檢測各組小鼠肺組織標本TLR4 mRNA表達。用Western-blot法檢測各組小鼠肺組織標本TLR4蛋白表達。取各組小鼠肺組織標本行免疫組化染色，檢測MyD88及NF-κB表達。結果

與A組相比，B組小鼠血漿LPS增高(P＜0.01)，肺組織呈ALI表現(xiàn)，且TLR4 mRNA及蛋白表達上調(P均＜0.01)，MyD88及NF-κB表達上調(P均＜0.01)。與B組相比，D、E、F組小鼠血漿LPS明顯降低(P均＜0.01)，肺組織病理損傷程度下降，TLR4 mRNA及蛋白表達下調(P均＜0.01)，MyD88及NF-κB表達下調(P均＜0.01)。結論姜黃素對LPS誘導的小鼠急性肺損傷有保護作用，其主要機制可能與姜黃素抑制LPS-TLR4激活MyD88-NF-κB信號轉導通路有關。

關鍵詞:姜黃素;中藥;急性肺損傷;脂多糖; Toll樣受體4; MyD88蛋白;核因子κB

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.22.002

急性肺損傷(ALI)主要病理特征是在毛細血管內皮及肺泡上皮廣泛損傷［1］，發(fā)病率及病死率高，目前除對癥支持治療外，尚無特效治療手段。炎癥介質瀑布樣釋放和ALI發(fā)生有著十分密切關系，多項研究［2，3］表明脂多糖(LPS)致ALI主要機制是LPS通過與Toll樣受體(TLR) 4結合，激活單核巨噬細胞，釋放大量炎性介質及細胞因子，介導肺部失控性炎癥反應。中藥姜黃素有抑制炎性細胞活性［4～6］、提高機體免疫力、抗腫瘤［7～9］等作用。2015 年1～2月，我們觀察了姜黃素對于LPS誘導小鼠ALI的保護作用，并探討其可能機制?，F(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物SPF級BALB/C雄性小鼠(購自北京百奧賽圖基因生物技術有限公司) 60只，體質量30～35 g。常規(guī)飼養(yǎng)，自由進食水。

1.1.2藥品和試劑盒內毒素檢測試劑盒購自湛江博康海洋生物有限公司。RT-PCR檢測試劑盒購自寶生物工程有限公司公司。Western blot試劑盒購自碧云天公司。免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物制品公司。姜黃素及LPS均購自Sigma Aldrich公司。

1.2方法

1.2.1實驗動物分組及處理將60只BALB/C雄性小鼠隨機分A～F組，每組10只。A組腹腔注射生理鹽水4 mL/次，1次/d，連續(xù)注射7 d; B組先腹腔注射生理鹽水4 mL/次，1次/d，連續(xù)注射7 d，第8天腹腔注射LPS，劑量5 mg/kg; C組處理同B組，但在腹腔注射LPS前10～12 h每只小鼠先腹腔注射TLR-4/MD抗體50 μg; D、E、F組分別腹腔注射200、150、100 mg/kg姜黃素，1次/d，共注射7 d，第8天腹腔注射1次LPS，劑量5 mg/kg。A組第8天、B ～F組腹腔注射LPS后4～6 h，于無菌條件下取小鼠肺組織和外周血待測。

1.2.2檢測指標和方法

1.2.2.1血漿內毒素水平分離各組小鼠外周血標本的血漿，用血漿細菌內毒素檢測試劑盒(動態(tài)濁度法)檢測血漿內毒素水平。操作按試劑盒說明書進行。

1.2.2.2肺組織形態(tài)學觀察將各組小鼠肺組織用4%甲醛固定，經浸潤、脫水，二甲醛，石蠟包理，連續(xù)切片5張，厚度6 μm，HE染色光鏡下觀察。用Gloor［10］方法行病理損害評分。

1.2.2.3肺組織TLR4 mRNA表達取各組小鼠肺組織標本80～100 mg，采用RT-PCR法檢測其中TLR4 mRNA表達。操作按試劑盒說明書進行。TLR-4上游引物序列: 5'-AATCTGGTGGCTGTGGAG-3';下游: 3'-TCTGGTTCGGAAAGTCCC-5'，擴增產物長度為287 bp;β-actin上游引物序列: 5'-CTGTCCCTGTATGCCTCTG-3';下游: 3'-CCTTTAGCACGCACACTGTA-5'，擴增產物長度為516 bp。反應體系: MgCl22 μL、10×RT Buffer 1 μL、dNTP Mixture 1 μL、Oligo dT 0.5 μL、AMV逆轉錄酶0.5 μL、RNase Inhibitor 0.25 μL、RNase Free dH2O 3.75 μL、Total RNA 1 μL。反應條件: 31℃10 min，49.3℃30 min，98℃5 min，4℃5 min。以ATLR4與β-actin的比值表示肺組織TLR4 mRNA相對表達量。

1.2.2.4肺組織TLR4蛋白表達采用Western blot法。按試劑盒說明書操作。用Tannon Gis軟件計算肺組織TLR4蛋白相對表達量。以ATLR4和β-actin的比值表示肺組織TLR4蛋白相對表達量。

1.2.2.5肺組織MyD88和NF-κB表達采用免疫組化法。按試劑盒說明書操作。肺泡壁、肺泡及支氣管鏡下棕色顆粒為陽性染色; MyD88和NF-κB蛋白相對表達量通過Image pro plus 6.0進行吸光度值測定分析。

1.3統(tǒng)計學方法采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)以珋x±s表示。組間比較采用單因素方差分析和兩兩比較的LSD檢驗。P＜0.01為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1造模后一般情況A組全部存活，自潔及攝食水量均正常，反應敏捷; B組1只死亡，余小鼠最初活動異常，之后蜷縮、抱團，反應遲鈍，停止攝食水，呼吸頻率加快，失去自潔能力; C、D、E、F組小鼠全部存活，表現(xiàn)同A組。

2.2各組血漿內毒素水平及肺組織病理學表現(xiàn)各組小鼠血漿內毒素水平見表1。由表1可見，與A組比，B、C組血漿內毒素水平明顯升高(P均＜0.01) ; D、E、F組血漿內毒素水平與B組相比顯著降低(P均＜0.01)，其中D組最低。與A組相比，B組肺間隔明顯增厚并充血，可見肺泡腔水腫及大量中性粒細胞浸潤。D、E、F組上述病變明顯減輕，表現(xiàn)為中性粒細胞浸潤減少，肺泡腔見少量的紅細胞及毛細血管輕度擴張。各組肺組織病理學評分見表1。

表1　各組血漿內毒素水平比較(EU/mL，±s)

注:與A組相比，#P＜0.01;與B組相比，*P＜0.01。

組別　n　內毒素(EU/mL)組織病理學評分A組10　7±0.98　1.00±0.52 B組　9　1 160±9.24#　7.89±0.72#C組　10　1 040±9.37#　3.57±0.56#*D組　10　36±1.74#*　3.34±0.48#*E組　10　67±2.34#*　4.74±0.81#*F組　10　85±2.06#*　5.95±0.68#*

2.3肺組織TLR4基因和蛋白表達各組肺組織TLR4 mRNA和蛋白表達量見表2。由表2可見，與A組比，B組肺組織TLR4 mRNA及蛋白表達明顯上調(P均＜0.01)。C～F組與B組比，TLR4基因及蛋白表達明顯下調(P均＜0.01)，其中D組最低。

表2　各組肺組織TLR4 mRNA及蛋白表達比較(±s)

注:與A組相比，#P＜0.01;與B組相比，*P＜0.01。

組別　n TLR4 mRNA相對表達量　TLR4蛋白相對表達量A組10　0.246 7±0.053 7　0.250 1±0.052 3 B組　9　0.970 3±0.071 4#　0.982 5±0.072 6#C組　10　0.327 4±0.081 5#*　0.359 6±0.072 5#*D組　10　0.303 6±0.061 8#*　0.323 5±0.081 2#*E組　10　0.568 2±0.072 6#*　0.612 5±0.061 4#*F組　10　0.746 2±0.071 4#*　0.762 4±0.025 1#*

2.4肺組織MyD88和NF-kB表達光鏡下觀察，A組見少量分布的淡棕色顆粒，B組見肺泡壁、支氣管和肺泡大片深棕色顆粒; C組較B組棕色顆粒少、顏色淺; D、E、F組見淺棕色顆粒，分布在肺泡及支氣管上。各組小鼠肺組織MyD88和NF-κB蛋白表達量見表3。由表3可見，與A組相比，B組小鼠肺組織MyD88和NF-κB蛋白表達明顯升高(P均＜0.01)。C～F組與B組比肺組織MyD88和NF-κB蛋白表達明顯下降(P均＜0.01)，D組最低。

表3各組肺組織MyD88和NF-κB蛋白表達比較(±s)

3　討論

ALI是肺泡上皮及肺毛細血管內皮的通透性增加所致的非心源性肺水腫。LPS在ALI發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［11，12］，和預后密切相關。Toll樣受體家族(TLRs)有多種同源物，TLR4是內毒素(LPS)受體［13］。感染發(fā)生時，免疫細胞識別侵入機體的G－細菌，啟動促炎相關反應，轉錄和激活一系列下游分子如NF-κB、MyD88、TNF-α等，最終引起以TNF-α、MyD88、NF-κB等［14，15］為中心的促炎癥因子激活，放大炎癥反應，導致多種炎癥因子的瀑布樣釋放，形成第二次生物損傷效應［16］。本研究中B組小鼠腹腔內注射LPS后，肺泡腔內可見炎性滲出和出血，成功建立了ALI動物模型。B組肺組織TLR4 mRNA、TLR4蛋白、MyD88蛋白、NF-κB蛋白表達均上調，提示急性肺損傷的發(fā)病機制可能與TLR4、MyD88和NF-κB相關。其機制可能為LPS和TLR4結合后激活下游分子MyD88轉錄，將信號下傳至腫瘤壞死因子受體相關因子(TRAF)，活化的TRAF進一步激活NF-κB誘導酶，使其磷酸化并遷移至細胞核內，導致炎性介質和細胞因子如TNF-α、IL-1、IL-4等釋放，引起相應的靶器官損害及臨床癥狀。

本研究結果顯示，與A組相比，C組小鼠肺組織血漿內毒素水平升高，但肺組織HE染色及免疫組化未見明顯病理性ALI改變，肺泡、肺泡壁及支氣管未見棕色顆粒染色，MyD88和NF-kB蛋白表達明顯下降，提示LPS通過TLR4受體途徑導致ALI;用姜黃素處理的D、E、F組小鼠肺組織血漿內毒素水平明顯低于B組，說明姜黃素可以有效降低血漿內毒素水平并具有劑量依賴性，機制可能與姜黃素增強吞噬細胞能力，促進RAW264.7細胞分泌進而抑制TNF-α對抗LPS，但尚不明確確切機制。本研究結果顯示，D、E、F組小鼠肺組織損傷程度、TLR4 mRNA和TLR4蛋白表達低于B組，并且呈劑量依賴性變化。機制可能通過姜黃素降低血漿內毒素水平，從而抑制其與TLR4受體結合，下調其下游表達，從而減輕細胞因子及炎性介質(MYD88、NF-KB、TNF-α等)對肺組織的損傷，提示姜黃素具有降低血漿內毒素，防治肺損傷作用，可為臨床膿毒血癥引起的ALI提供新的治療方向。

綜上所述，姜黃素預處理能夠降低LPS誘導的ALI，與劑量相關，其可能機制是通過阻斷、干擾LPS-TLR4-MyD88-NF-kB-TNF-α信號通路的轉導，從而降低炎性介質及細胞因子的過度表達。因此，姜黃素用于治療ALI具有良好的臨床應用價值。

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Protective effect of curcumin on acute lung injury induced by lipopolysaccharide in mice

GU Zhi-long，JIANG Hua-mao，HU Zhan-sheng
(The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China)

Abstract:Objective To observe the protective effect of curcumin on acute lung injury (ALI) induced by lipopolysaccharide (LPS) in mice and to investigate the mechanism.Methods Sixty BALB/C male mice in SPF grade were randomly divided into groups A，B，C，D，E and F，10 mice in each group.Mice in the groups A，B and C were daily injected with 4 mL normal saline intraperitoneally，once a day and for 7 d; after that，on day 8，mice in the group B were administered with 5 mg/kg LPS for once，and each mouse in the group C was injected with 50 μg TLR-4/MD antibodies 10-12 h before being administered with 5 mg/kg LPS.In the group A，on day 8，the lung tissues and peripheral blood were obtained and in groups B-F，the lung tissues and peripheral blood were obtained 4-6 h after intraperitoneal injection of LPS under the sterile conditions.The peripheral blood plasma was separated to detect the plasma LPS levels.The lung tissue specimen in each group received HE staining，then we observed the pathology changes of the lung tissues.The TLR4 mRNA expression in the lung tissues of each group was detected by RT-PCR，and the TLR4 protein expression in the lung tissues of each group was detected by Western blotting.The specimens of lung tissues received immunohistochemical staining，and then we detected the expression of MyD88 and NF-κB.Results Compared with group A，the plasma LPS was increased (P＜0.01)，lung tissue showed ALI，and TLR4 mRNA and protein expression，MyD88 and NF-κB expression was up-regulated in the group B (all P＜0.01).Compared with group B，the plasma LPS was significantly decreased (all P＜0.01)，the pathology damage of lung tissues declined，TLR4 mRNA and protein expression was down-regulated (all P＜0.01)，MyD88 and NF-κB expression was down-regulated in the groups D，E and F (all P＜0.01).Conclusion Curcu-book=6,ebook=468min has a protective effect on ALI induced by LPS in mice.The mechanism may be related to the inhibition of LPS-TLR4 combination and the activation of MyD88-Nf-kB signal pathway.

Key words:curcumin; acute lung injury; lipopolysaccharide; Toll-like receptor 4; MyD88 protein; nuclear factor-κB

(收稿日期:2015-03-17)

通信作者簡介:胡占升(1969-)，男，博士，教授、主任醫(yī)師，研究方向為多器官功能衰竭等。E-mail: lzguchn@ hotmail.com

作者簡介:第一谷志龍(1984-)，男，碩士，醫(yī)師，研究方向為急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合癥。E-mail: lzguchn@163.com

基金項目:遼寧省教育廳科研基金資助項目(2008419)。

文章編號:1002-266X(2015)22-0005-04

文獻標志碼:A

中圖分類號:R563