劉洪斌 楊萬秋/哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司宇璐 康宏 趙凱/黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物黑龍江省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

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殼聚糖及其衍生物在黏膜免疫中的應(yīng)用與展望

劉洪斌 楊萬秋/哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司
宇璐 康宏 趙凱/黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物黑龍江省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

免疫途徑可分為肌肉注射、皮下注射、口服和鼻腔等，產(chǎn)生的免疫應(yīng)答類型包括細(xì)胞免疫，體液免疫及黏膜免疫。在當(dāng)今臨床中，疫苗的接種方式主要還是通過肌肉注射給藥，該給藥途徑雖可以刺激免疫系統(tǒng)在血清中產(chǎn)生抗體，但是抗原表達(dá)量低，不能產(chǎn)生黏膜免疫反應(yīng)，免疫效果并不理想。殼聚糖是一種有免疫調(diào)節(jié)作用的葡聚糖，殼聚糖作為黏膜免疫的載體，能夠增強(qiáng)疫苗的免疫原性，提高機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫的水平。佐劑是指能夠增強(qiáng)機(jī)體的抗原免疫應(yīng)答或改變了免疫應(yīng)答類型的物質(zhì)。它主要通過免疫調(diào)節(jié)、抗原呈遞、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)、抗原靶向等方式誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生了高效、長期的免疫反應(yīng)，來提高對(duì)機(jī)體的保護(hù)能力，同時(shí)又減少了免疫物質(zhì)的用量，進(jìn)而降低疫苗的生產(chǎn)成本。因?yàn)闅ぞ厶菬o抗原免疫性、生物相容性優(yōu)良、來源廣泛、價(jià)格低廉等特點(diǎn)，使其成為一種理想的疫苗佐劑載體。本文圍繞對(duì)殼聚糖及其衍生物相關(guān)的載體和佐劑在黏膜免疫方面的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

（一）殼聚糖及其衍生物的理化性質(zhì)

1.殼聚糖的理化性質(zhì)。殼聚糖是甲殼類動(dòng)物（如蝦、蟹）、昆蟲和其它無脊椎動(dòng)物外殼中的甲殼質(zhì)在堿性條件下經(jīng)脫乙?；频玫囊环N天然高分子多糖體。這會(huì)出現(xiàn)一系列的脫乙酰程度和不同相應(yīng)的相對(duì)分子質(zhì)量。一般來說，脫乙酰度大于50%時(shí)，就可成為殼聚糖。殼聚糖本身是一種弱堿，Pka為6.2～7.0，在酸性條件下，殼聚糖氨基經(jīng)質(zhì)子化后可溶于水，并帶有正電荷，使其電荷密度大。在堿性和中性環(huán)境下不溶解，但可能與有機(jī)或無機(jī)酸形成鹽。殼聚糖是由葡糖胺和N-乙?；咸前方M成的多糖，是帶陽電荷的線性多糖，有良好的生物相容性和生物可降解性，其分子中的葡糖胺基荷正電，與荷負(fù)電的DNA可產(chǎn)生靜電作用，凝聚為多聚體復(fù)合物。殼聚糖的分子量可為幾萬甚至幾十萬，其陽離子特性可以很好的結(jié)合帶負(fù)電的蛋白或者DNA，所以被認(rèn)為是一個(gè)很好的蛋白，既能結(jié)合蛋白/DNA，又能避免蛋白/ DNA的降解。殼聚糖骨架上豐富的羥基和氨基使其易于化學(xué)修飾，能增加其增加其靶向性，除此之外殼聚糖還有很好的吸附性、成膜性、通透性、成纖性和保濕性。

2.殼聚糖衍生物的理化性質(zhì)。殼聚糖通過化學(xué)改性，可以得到具有一定官能團(tuán)的殼聚糖衍生物。衍生物的性能，與殼聚糖相比，往往有較明顯的改善。對(duì)殼聚糖的衍生物研究較多的有，殼聚糖的?；?、烷基化、硫酸酯化、羥基化、季銨化、羧甲基化等，其中硫酸酯化、季銨化、羧甲基化的產(chǎn)物由于具有良好的水溶性而備受重視。

（1）?；ぞ厶强膳c多種有機(jī)酸的衍生物如酸酐、酰鹵等反應(yīng)，引入不同分子量的芳香族酰基（苯甲酰、鄰苯二甲?；龋┗蛑荆ǘ□?、十二烷酰及馬來酰等），可大大改善產(chǎn)物在郵寄溶劑中的溶解度。?；磻?yīng)既可在羥基上發(fā)生，生成脂，也可在氨基上發(fā)生，生成酰胺，?；a(chǎn)物的生成與溶劑、?；Y(jié)構(gòu)及催化條件有關(guān)。

（2）烷基化。由于殼聚糖結(jié)構(gòu)中存在氨基和羥基，因此可在N或O上發(fā)生烷基化反應(yīng)，其相應(yīng)的產(chǎn)物分別為N-烷基殼聚糖、O-烷基殼聚糖或N，O-烷基殼聚糖。

N-烷基殼聚糖衍生物的合成，通常是采用殼聚糖分子中的氨基和醛反應(yīng)形成的席夫堿，然后再用NaBH4或NaBH3CN還原得到。用這種方法合成的產(chǎn)物，能夠?qū)Ω鞣N金屬離子有很好的吸附和螯合能力。O-烷基殼聚糖衍生物的常見合成方法有：①N-鄰苯二甲?；ǎ河么朔磻?yīng)保護(hù)氨基，在使之與鹵代烷烷基化反應(yīng)，隨后用肼脫去保護(hù)基，既得O-烷基殼聚糖衍生物；②金屬模板合成法：將殼聚糖與金屬離子進(jìn)行絡(luò)合反應(yīng)，保護(hù)-NH2和C3位上的-OH，在與鹵代烷烷基發(fā)生基化反應(yīng)，然后用稀酸反復(fù)洗滌處理，得到C6位上的O-烷基殼聚糖衍生物；③希夫堿法：通過殼聚糖與醛反應(yīng)生成席夫堿，在將其與鹵代烷烷基化反應(yīng)，之后在醇酸中脫去保護(hù)基，既得O-烷基殼聚糖。N，O-烷基殼聚糖衍生物的合成，當(dāng)在堿性條件下時(shí)，殼聚糖與鹵代烷可直接反應(yīng)，制備出在N，O位同時(shí)取代的衍生物。此類的衍生物具有較好的生物相容性，可在醫(yī)藥材料方面應(yīng)用。

（3）硫酸酯化。根據(jù)殼聚糖硫酸酯化前的狀態(tài)不同，可分為兩類：第一類是根據(jù)所要制備的殼聚糖硫酸酯化衍生物的特殊要求，對(duì)殼聚糖進(jìn)行預(yù)處理，可以通過活化、降解或者是對(duì)糖單元上的某一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)進(jìn)行化學(xué)修飾并加以保護(hù)，實(shí)施定位硫酸酯化，即將不同的預(yù)處理方法和殼聚糖硫酸酯化的方法相結(jié)合，就能得到符合要求的殼聚糖衍生物。第二類是殼聚糖沒有經(jīng)過預(yù)處理，直接對(duì)殼聚糖進(jìn)行硫酸酯化。

進(jìn)行硫酸酯化試劑的選擇主要是根據(jù)反應(yīng)裝置的情況和控制反應(yīng)過程的難易程度。所用的試劑主要有氯磺酸，濃硫酸，二氧化硫-三氧化硫，從理論上來講，三氧化硫是最有效的試劑。殼聚糖硫酸酯結(jié)構(gòu)的多樣性也為我們提供了多種生理功能。

（4）羥基化。殼聚糖羥基化衍生物的合成一般是在堿性介質(zhì)中進(jìn)行的，在堿性條件下，殼聚糖可與環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷直接反應(yīng)，最后得到N，O位取代的衍生物。用縮水甘油或32氯21，22丙二醇也可進(jìn)行羥基化反應(yīng)，通過進(jìn)一步反應(yīng)就可在殼聚糖的分子中引入兩個(gè)羥基。通常來說，殼聚糖衍生物具有良好的水溶性和生物相容性，它也同時(shí)具有高分子和表面活性劑的兩大特點(diǎn)，可以成為一種優(yōu)異的新型高分子表面活性劑。

（5）季銨化。殼聚糖的季銨化衍生物可以分為兩類：一類是根據(jù)殼聚糖氨基的反應(yīng)來制得 ，具體方法是使用過量鹵代烷和殼聚糖反應(yīng)得到鹵化的殼聚糖季銨化衍生物。另一類是用含有環(huán)氧烷烴的季銨鹽和殼聚糖進(jìn)行反應(yīng) ，得到含有羥基的殼聚糖季銨化衍生物。該衍生物不僅有很好的殺菌性能，還可以作為污水處理劑，絮凝劑以及表面活性劑。

（6）羧甲基化。近幾年關(guān)于殼聚糖羧甲基化衍生物的報(bào)道越來越多，羧甲基殼聚糖是指，殼聚糖分子在不同的條件下，將羧甲基引入到分子鏈上，即殼聚糖與乙醛酸或氯代烷酸進(jìn)行反應(yīng)。因?yàn)橐媵然罂梢缘玫酵耆苄缘母叻肿?，更重要的是可以得到含陰離子的兩性殼聚糖衍生物。根據(jù)羧甲基的取代位置不同，O-羧甲基殼聚糖，N-羧甲基殼聚糖，O，N-羧甲基殼聚糖三種衍生物。該類衍生物可在多方面得到應(yīng)用，特別是作為藥物載體方面。

總之，殼聚糖具有以上的優(yōu)良特點(diǎn)。這些特點(diǎn)也決定了殼聚糖及其衍生物作為載體和佐劑對(duì)黏膜免疫在醫(yī)藥、免疫學(xué)等領(lǐng)域的重要的應(yīng)用價(jià)值。

（二）殼聚糖及其衍生物在黏膜免疫方面的應(yīng)用

1.黏膜免疫。黏膜免疫一般是將抗原和攜帶抗原的復(fù)合物通過口服、鼻腔給藥等方法進(jìn)行免疫。一方面可在局部的黏膜表面產(chǎn)生針對(duì)目的抗原的免疫球蛋白，另一方面又刺激機(jī)體產(chǎn)生全身性免疫，進(jìn)而在整體上起到防御作用?，F(xiàn)階段有多種免疫給藥方式，其中的黏膜免疫與其他方式相比有著更顯著的優(yōu)勢(shì)，比如成本低、順應(yīng)性較好、患者易接受等方面。

（1）口服免疫。口服免疫簡(jiǎn)單易行，是理想的黏膜免疫途徑之一。疫苗口服免疫主要面對(duì)兩大屏障：形態(tài)學(xué)屏障和胃腸道的生理學(xué)屏障。其中，形態(tài)學(xué)屏障對(duì)激活免疫應(yīng)答起關(guān)鍵作用。有利于在有效接種部位富集基因疫苗，增加免疫原性。生理學(xué)屏障包括了各種酶和胃酸對(duì)疫苗的降解。通過采用了微粒包裹活性形式的疫苗，保護(hù)pDNA，避免各種酶和胃酸破壞導(dǎo)致過早失活。同時(shí)提高疫苗了的靶向性，增加對(duì)M細(xì)胞的攝取量，從而達(dá)到局部或全身黏膜免疫的效果。

（2）鼻黏膜免疫。鼻腔作為免疫部位具有以下生物學(xué)特征：①給藥方便：可以以滴入或噴入發(fā)的方式給藥，患者可以自己完成；②促進(jìn)藥物的吸收：鼻腔的黏膜上存在許多細(xì)微絨毛，也有豐富的淋巴管和毛細(xì)血管，有效的增加了藥物吸收的面積，使藥物更容易被鼻黏膜吸收；③避免了胃腸道酶和胃酸的降解：藥物經(jīng)鼻黏膜吸收之后，直接進(jìn)入人體循環(huán)，提高了藥物的利用率。

與口服免疫相比，鼻黏膜免疫的傳輸距離短，鼻腔內(nèi)pH為6.5～7.0，水解酶的種類和數(shù)量小于胃腸道，所以不會(huì)受到酶和酸的降解，免疫疫苗的吸收不受食物影響，給藥疫苗可以包裹也可不用包裹在微粒中。而且，鼻黏膜較其他部位的黏膜，不規(guī)則度更高，更具有滲透性。

2.殼聚糖作為黏膜疫苗載體、佐劑。

（1）殼聚糖作為黏膜疫苗載體。殼聚糖作為黏膜疫苗載體，具有良好的低毒性、生物相容性及促滲作用。它能與活體的組織相容，被體內(nèi)的胃蛋白酶降解后，人體能夠完全的吸收降解產(chǎn)物，無毒、副作用。殼聚糖還具有良好的免疫刺激活性、凝結(jié)能力、控制藥物釋放、提高疏水性藥物的穩(wěn)定性、延長藥物療效及改變給藥途徑，還可以加強(qiáng)制劑的靶向給藥能力。根據(jù)上述生物特性，殼聚糖在黏膜疫苗載體中得到了廣泛的應(yīng)用。

殼聚糖作為黏膜疫苗載體的作用如下：①促滲作用：殼聚糖可使黏膜上皮細(xì)胞的蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而提高了黏膜的通透性，促進(jìn)了蛋白抗原分子的跨黏膜吸收；將殼聚糖及其衍生物作用于細(xì)胞單層，可促進(jìn)抗原疫苗通過細(xì)胞旁路進(jìn)入體內(nèi)，增強(qiáng)其滲透吸收，提高生物利用度；②黏膜吸附特性：殼聚糖分子中的氨基和羥基能與黏膜中帶負(fù)電荷的糖蛋白形成氫鍵，產(chǎn)生黏附作用，延緩了對(duì)抗原的清除，使抗原更易穿過黏膜屏障，進(jìn)而與淋巴組織作用，引起局部或全身的黏膜免疫反應(yīng)。

殼聚糖可以被制成不同的形態(tài)，如微球、納米粒子、條狀顆粒及薄膜?？梢圆捎枚喾N方法來制備殼聚糖微粒：①復(fù)凝聚法：利用帶正電荷的殼聚糖和帶負(fù)電荷的聚合物互相作用的特點(diǎn)，復(fù)凝聚制得殼聚糖微粒；②交聯(lián)法：利用殼聚糖的氨基和其他化合物相應(yīng)活性基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)的特點(diǎn)，交聯(lián)制得殼聚糖微粒。在乳劑中的微粒可通過乳液分離、溶劑蒸發(fā)等方法得以分離；③噴霧劑干燥法：通過噴霧干燥設(shè)備制得殼聚糖微粒；④疏水修飾自聚集法：將殼聚糖用化學(xué)試劑進(jìn)行疏水修飾，其在水溶液中形成自聚集體；⑤沉淀法：與疏水修飾自聚集法相似，將殼聚糖用沉淀劑進(jìn)行沉淀，制得殼聚糖微粒。其中復(fù)凝聚法和和交聯(lián)法是制備殼聚糖微粒最常用的兩種方法。

（2）殼聚糖黏膜免疫佐劑。黏膜佐劑是一類與抗原預(yù)先或同時(shí)應(yīng)用，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原性的免疫應(yīng)答，來增強(qiáng)相應(yīng)抗原的免疫原性。殼聚糖在黏膜免疫中的佐劑效應(yīng)：疫苗經(jīng)黏膜免疫產(chǎn)生的免疫反應(yīng)通常不能達(dá)到理想的免疫效果，所以必須依賴一些有效的黏膜免疫佐劑，其能夠提高T細(xì)胞、B細(xì)胞、漿細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、多形核細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞的活性和積聚能力，誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，激發(fā)有效的T細(xì)胞免疫應(yīng)答。其自身還可引起IL-10的釋放及黏膜IL-4的表達(dá)，激活脾臟的T細(xì)胞，黏膜Th2免疫反應(yīng)明顯上調(diào)。理想的疫苗佐劑應(yīng)當(dāng)具備以下的特點(diǎn)：①必須安全有效；能夠有效誘導(dǎo)或增強(qiáng)細(xì)胞免疫；③應(yīng)具有穩(wěn)定的活性，本身可降解，無免疫原性。

（3）殼聚糖微粒作為黏膜載體、佐劑免疫中有的應(yīng)用。

Alpar等研究發(fā)現(xiàn)，牛血清白蛋白在加入殼聚糖微球后與不加殼聚糖相比較，其能誘導(dǎo)更多的抗原特異性的IgG抗體反應(yīng)；Mohaghegh等研究表明，lgG和lgA抗體，納米粒免疫組與對(duì)照組相比較，其免疫反應(yīng)水平顯著提高；Biswas 等研究證明，涂有藻酸鹽的納米顆粒，制劑經(jīng)小鼠口服，結(jié)果顯示了覆載麻疹抗原的納米顆粒誘發(fā)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。全身黏膜免疫應(yīng)答和低細(xì)胞毒性，可以證實(shí)藻酸鹽納米顆粒經(jīng)口服的方式，可作為新型的黏膜載體。Yao等研究表明，將甘露糖基脫乙酰納米顆粒，進(jìn)行鼻內(nèi)給藥，評(píng)估抑制小鼠前列腺腫瘤細(xì)胞的生長功效，經(jīng)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)抑制功效顯著提高。所以該納米顆粒是一種有效的抗腫瘤免疫治療的載體。

Bento等研究發(fā)現(xiàn)，新型的疫苗佐劑C40/48相關(guān)的殼聚糖納米粒子，該納米顆?？纱龠M(jìn)細(xì)胞攝取，延長抗原在鼻腔的停留時(shí)間，有利于免疫應(yīng)答。Moon等研究重組流感病毒血凝素抗原與納米顆粒組成的殼聚糖作為黏膜佐劑，通過鼻腔給藥的方式，誘發(fā)防止高致病性流感病毒。它可以作為臨床應(yīng)用中一種有效的安全性的黏膜佐劑。

（三）展望

殼聚糖有著特殊的生物和理化性質(zhì)，是極有潛力的新型疫苗載體佐劑，近年來對(duì)殼聚糖及其衍生物在黏膜免疫方面做了許多的研究，也取得了很大的進(jìn)展。但是，科研應(yīng)是不斷的去探索、進(jìn)步、發(fā)展。今后，對(duì)于如何開發(fā)新型的載體佐劑，選擇合適、安全的改性材料，減少制備過程的復(fù)雜程度，增強(qiáng)對(duì)黏膜免疫穩(wěn)定性及放大生產(chǎn)等等，都有待進(jìn)一步的解決。相信在不久的將來，殼聚糖等疫苗載體、佐劑在疾病防治中發(fā)揮最大的功效。

參考文獻(xiàn)（略）