黃幼萍，林 峰

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帶對(duì)準(zhǔn)光路的激光細(xì)胞穿孔顯微物鏡設(shè)計(jì)

黃幼萍，林 峰

（福建師范大學(xué)光電與信息工程學(xué)院，醫(yī)學(xué)光電科學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350007）

針對(duì)近紅外光譜可對(duì)活體組織進(jìn)行無損傷穿孔，并解決在穿孔中需要重新對(duì)焦的問題，通過Zemax軟件對(duì)7片式前置光闌顯微物鏡結(jié)構(gòu)在0.48～1.48mm波長范圍內(nèi)進(jìn)行了寬光譜消色差的優(yōu)化設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)了像距為無限遠(yuǎn)的多光譜共焦成像，其放大倍率為40，數(shù)值孔徑0.5，最大焦面漂移量僅為27mm，可見光波段在空間頻率為350lp/mm時(shí)，0.7視場的MTF＞0.5，具有較高的分辨力。并且在波長1480nm處，MTF值接近衍射極限，具有較高的能量，滿足細(xì)胞穿孔的要求。文中還給出了實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并預(yù)測其應(yīng)用前景。

消色差顯微物鏡；激光細(xì)胞穿孔；多光譜共焦成像；Zemax軟件；無限遠(yuǎn)像距

0 引言

激光穿孔[1]即用激光微束照射受體細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞膜的可逆性穿孔，將一些外源物質(zhì)導(dǎo)入到活細(xì)胞當(dāng)中。由于激光具有無污染、非接觸、保證細(xì)胞完整性等優(yōu)點(diǎn)，且可以對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行操作，適用于各種細(xì)胞的研究，使得激光穿孔技術(shù)在基因轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面具有一定的研究價(jià)值。早在20世紀(jì)60年代末，Saks[2]等人就已經(jīng)使用紅寶石激光器進(jìn)行細(xì)胞穿孔實(shí)驗(yàn)，此后許多穿孔實(shí)驗(yàn)表明，使用近紅外光譜[3]可穿透到更深層組織，且速度更快，轉(zhuǎn)染效率更高。目前，國內(nèi)外主要有可見光-紫外以及可見-近紅外兩種寬光譜顯微物鏡，后者在激光穿孔中比較常見[4-6]，但這些鏡頭在穿孔時(shí)需要重新對(duì)焦，因此本設(shè)計(jì)基于奧林巴斯IX71顯微鏡的強(qiáng)大拓展能力和實(shí)驗(yàn)的具體要求，添加了一個(gè)對(duì)準(zhǔn)光路，同時(shí)需要設(shè)計(jì)一款可以實(shí)現(xiàn)多光譜共焦顯微物鏡，以代替奧林巴斯標(biāo)準(zhǔn)物鏡系列，解決其在細(xì)胞穿孔中需要重新對(duì)焦的問題。

無限遠(yuǎn)像距[7]顯微物鏡的特點(diǎn)是顯微物鏡和輔助物鏡之間為平行光束，間距比較自由、裝配調(diào)整自由，在其間加入棱鏡等附加元件而不引起像差和放大倍率的變化。利用這一優(yōu)點(diǎn)，本文將顯微物鏡設(shè)計(jì)為無限遠(yuǎn)共軛距，通過與CCD或者計(jì)算機(jī)相結(jié)合形成各種顯微成像技術(shù)，拓寬其應(yīng)用領(lǐng)域。

設(shè)計(jì)時(shí)利用625～660nm波段進(jìn)行對(duì)準(zhǔn)，1440～1500nm用于細(xì)胞穿孔，可見光譜波段則作為觀察時(shí)使用，此外使用單一波長光可以減小色差，提高光學(xué)系統(tǒng)的分辨力，故對(duì)準(zhǔn)和穿孔分別選取650nm和1480nm波長作為入射光。由于可見光和近紅外光在同一種光學(xué)材料中的成像焦面不一樣，為了讓近紅外光束聚焦在可見光譜范圍內(nèi)，設(shè)計(jì)中采用多光譜共焦技術(shù)。同時(shí)系統(tǒng)采用的光學(xué)玻璃較為普遍。

1 光學(xué)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)優(yōu)化及公差分析

1.1 設(shè)計(jì)指標(biāo)

無限遠(yuǎn)像距的顯微物鏡的焦距可由公式￠＝TL￠/計(jì)算得出，TL￠為輔助物鏡的焦距；為顯微物鏡的放大倍率。不同廠家的輔助物鏡，其焦距也不一樣。以奧林巴斯顯微物鏡為參考，輔助透鏡的焦距TL￠＝180mm，則￠＝TL￠/＝180/40＝4.5mm，當(dāng)放大倍率為40×?xí)r，NA≥0.5，故光學(xué)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)指標(biāo)選取如下。

1.2 初始結(jié)構(gòu)的確定

顯微物鏡的結(jié)構(gòu)主要是在折射式和反射式兩種類型中選取。由于反射式中反射面的加工要求比較高，物鏡裝調(diào)、防止雜光和保持穩(wěn)定性等也都比較困難，故設(shè)計(jì)中選擇折射式的結(jié)構(gòu)。該顯微鏡屬于小焦距物鏡，設(shè)計(jì)中應(yīng)注重校正軸上色差、球差[8]，而垂軸色差可以通過補(bǔ)償目鏡進(jìn)行補(bǔ)償。球差是軸上點(diǎn)的單色像差，主要由透鏡的球形表面引起的，使用雙膠合透鏡可以同時(shí)校正球差和色差。綜上本光學(xué)系統(tǒng)選用三組雙膠合，根據(jù)消色差理論[9]，整個(gè)系統(tǒng)應(yīng)滿足：

式中：n￠為第個(gè)折射面的折射率；u￠為出射光線與光軸的夾角；為光線的入射高度。

對(duì)雙膠合系統(tǒng)應(yīng)滿足：

式中：1、1和2、2是各塊透鏡的光焦度和阿貝常數(shù)；為總光光焦度。

由公式(1)～(3)可知，采用冕牌玻璃和火石玻璃的組合方式可消除色差。故三組雙膠合均采用冕牌和火石玻璃的組合形式，把孔徑光闌固定在第一個(gè)面。對(duì)該光學(xué)系統(tǒng)進(jìn)行反光路設(shè)計(jì)，當(dāng)像距為無窮遠(yuǎn)時(shí)，系統(tǒng)應(yīng)以平行光入射，即物距設(shè)為無窮遠(yuǎn)。利用Zemax多重結(jié)構(gòu)[10]對(duì)多光譜進(jìn)行建模，由于物鏡的放大倍率由物鏡的焦距和輔助透鏡的焦距共同決定，其中輔助透鏡的焦距是固定的，所以在評(píng)價(jià)函數(shù)中要嚴(yán)格控制物鏡的焦距，同時(shí)還要控制好玻璃的中心厚度、邊緣厚度、材料的折射率和阿貝常數(shù)等邊界條件。優(yōu)化后的效果并不是很理想，此時(shí)在系統(tǒng)中加入一塊單透鏡5（見圖1），使其能更好地校正像差。當(dāng)把透鏡5和6、7設(shè)計(jì)成三膠合時(shí)，倍率色差得到很大的改善，系統(tǒng)的像差明顯變小，最大的均方根半徑只有1.5mm（見圖2）。該系統(tǒng)主要采用的玻璃材料折射率和阿貝常數(shù)分別為(1.8, 40)、(1.7, 54)、(1.7, 26)、(1.5, 61)等。

表1 設(shè)計(jì)指標(biāo)

圖1 光學(xué)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)

圖2 點(diǎn)列圖

為了減小培養(yǎng)皿厚度、液體環(huán)境等因素帶來的像差影響，本設(shè)計(jì)在透鏡7后增加了2塊平板用來模擬培養(yǎng)皿和細(xì)胞的組織液，這2塊平板的厚度和材料選擇上均按實(shí)驗(yàn)要求來設(shè)定，從而使物鏡模擬的結(jié)果與實(shí)驗(yàn)的情況相似，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為精確。

1.3 優(yōu)化結(jié)果分析

圖3分別是可見光波段、650nm波段、1480nm波段以及全波段的調(diào)制傳遞函數(shù)?？梢钥闯觯?480nm波長在空間頻率為350lp/mm時(shí)，MTF接近衍射極限，大部分能量都集中在瑞利斑內(nèi)，具有較高的能量，能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞穿孔。其余波段在該空間頻率處，0.7視場的MTF都在0.5以上，分辨率較高。

圖4和圖5是全波段的多色光焦點(diǎn)漂移圖和色球差曲線圖，0.486nm、0.650nm、0.656nm、1.480nm4條譜線在0.707帶基本交于一點(diǎn)，焦移量也僅為27mm，光學(xué)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了消色差。

圖6給出了全系統(tǒng)的場曲和畸變，所對(duì)應(yīng)的最大畸變?yōu)椋?.31%，滿足觀測條件。

圖4 色球差曲線圖

圖5 焦點(diǎn)漂移圖

圖6 畸變圖

1.4 公差分析

理論設(shè)計(jì)完成后，根據(jù)加工廠家的加工水準(zhǔn)和裝配檢測工藝，需要合理進(jìn)行公差分配，以提高產(chǎn)品的實(shí)際光學(xué)性能和良率，表2是該光學(xué)系統(tǒng)的公差要求。

以在350lp/mm傳遞函數(shù)的平均值作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，用zemax軟件進(jìn)行公差分析后，標(biāo)準(zhǔn)名義值為0.50265718，其中影響較為嚴(yán)重的公差操作數(shù)如圖7所示。圖中顯示，靠近孔徑光闌的第2、第4光學(xué)面在、軸上的偏心和厚度偏差較為敏感，可采取較為嚴(yán)格的公差要求，即第2和第4面的、偏心公差設(shè)置為±0.015mm，第2～4面以及第3～4面的厚度公差設(shè)置為±0.03mm，再次采取20個(gè)蒙特卡羅樣本，分析后的MTF曲線和蒙特卡羅分析結(jié)果分別如圖8和表3所示，其結(jié)果表明，90%以上的MTF在0.2635，滿足光學(xué)系統(tǒng)的要求。

2 激光細(xì)胞穿孔實(shí)驗(yàn)裝置

激光細(xì)胞穿孔的裝置如圖9所示。把物鏡安裝在奧林巴斯IX71顯微鏡上，該顯微鏡具有6個(gè)輸入/輸出口，可以單獨(dú)使用其中某個(gè)光口，也可以同時(shí)使用。在穿孔實(shí)驗(yàn)中，上光口用來照明，后上光口和右側(cè)光口作為光路輸入口，650nm和1480nm激光分別從這2個(gè)光口發(fā)射出來經(jīng)過瞄準(zhǔn)儀成為平行光，這2束平行光再被反射鏡反射到物鏡（NA＝0.5，＝－40×）上，通過物鏡聚焦在樣品上，在短時(shí)間內(nèi)能迅速完成細(xì)胞穿孔且不破壞活細(xì)胞的完整性。從左側(cè)光口或者底光口中選一個(gè)光口來安裝CCD，就可以獲得原始圖像。

圖7 最敏感的公差操作數(shù)

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖10是650nm激光產(chǎn)生的衍射光圈，該光圈用于目標(biāo)的對(duì)準(zhǔn)。當(dāng)激光光束和物鏡在同一方向校準(zhǔn)時(shí)，則光圈是平均對(duì)等的，光的顏色也是均勻的，如圖10所示，其光圈質(zhì)量在可接受范圍內(nèi)。

圖11則是用1480nm激光在小鼠胚胎上進(jìn)行的穿孔情況。從圖11可知，物鏡穿孔質(zhì)量整體還是比較理想，因而本設(shè)計(jì)符合實(shí)驗(yàn)要求。

圖8 20個(gè)樣本的MTF曲線

Fig 8 MTF curves of 20 samples

表3 蒙特卡羅分析結(jié)果

4 應(yīng)用前景

隨著綠色熒光蛋白和其它分子熒光探針的發(fā)明，熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡在生物醫(yī)學(xué)上得到了更廣泛地應(yīng)用。由于標(biāo)本的自發(fā)熒光量比較小，為了提高熒光圖像的亮度，應(yīng)選擇數(shù)值孔徑較大的消色差物鏡，尤其是在高放大倍率時(shí)，更應(yīng)該采用高數(shù)值孔徑的物鏡，以檢測微弱的熒光信號(hào)。激光掃描共聚焦顯微鏡要求物鏡具有消色差和高分辨率的特點(diǎn)。從上述設(shè)計(jì)結(jié)果可得出，系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了消色差，并具有較高的分辨力，滿足了熒光顯微物鏡和激光掃描共聚焦顯微物鏡的要求。同時(shí)，系統(tǒng)使用的都是些常見的冕牌和火石玻璃，解決了成本昂貴的問題，因而此物鏡在熒光探測[11]和激光共聚焦顯微技術(shù)[12]中將具有可觀的應(yīng)用前景，同樣適合在多種顯微技術(shù)[13]相結(jié)合的場合中使用。應(yīng)用在熒光顯微鏡中，可以將熒光激發(fā)光源、激發(fā)濾光片、熒光照明系統(tǒng)安裝在后上光口，把圖6光路圖中的紅外濾光片更換成濾光片，在底光口安裝CCD探測器連接到計(jì)算機(jī)觀察熒光成像。激光共聚焦顯微鏡是在熒光顯微鏡上加裝激光掃描和共軛裝置，共聚焦掃描元件可以安裝在左側(cè)光口或者后下光口中，通常使用紅外或可見光激發(fā)熒光探針，與計(jì)算機(jī)配合使用，可以得到細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)，形成一種強(qiáng)有力的研究工具。多光譜共焦是本設(shè)計(jì)的另一特點(diǎn)，這一特色使得它可以普遍應(yīng)用在多光譜顯微成像系統(tǒng)[14-15]中，從可見光到近紅外區(qū)域內(nèi)對(duì)活體進(jìn)行成像，獲取光譜圖像。除此之外，本結(jié)構(gòu)的像距為無限遠(yuǎn)，這使得它在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中將會(huì)有更廣泛的應(yīng)用。

5 結(jié)束語

通過Zemax軟件對(duì)7片式的光學(xué)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)計(jì)了像距為無限遠(yuǎn)，帶對(duì)準(zhǔn)裝置的細(xì)胞穿孔顯微物鏡。物鏡的放大倍率為40×、數(shù)值孔徑為0.5，設(shè)計(jì)結(jié)果表明系統(tǒng)在可見光到近紅外寬波段內(nèi)進(jìn)行了消色差，存在的像差較小，在350lp/mm時(shí)具有較高的分辨力和優(yōu)良的成像質(zhì)量。所使用的材料為常見光學(xué)玻璃，預(yù)測該物鏡在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中有著廣泛的應(yīng)用。

圖9 實(shí)驗(yàn)裝置圖

圖10 衍射光圈

[1] Stevenson D J, Gunn-Moore F J, Campbell P, et al. Single cell optical transfection[J]., 2010: rsif20090463.

[2] Saks N M, Roth C A. Ruby laser as a microsurgical instrument[J]., 1963, 141(3575): 46-47.

[3] 王懋, 李春炎, 孫云飛, 等. 近紅外小動(dòng)物活體熒光成像系統(tǒng)的研制[J]. 光學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 33(6): 617003.

[4] Baumgart J, Bintig W, Ngezahayo A, et al. Quantified femtosecond laser based opto-perforation of living GFSHR-17 and MTH53 a cells[J]., 2008, 16(5): 3021-3031.

[5] Judith Baumgart, Willem Bintig, AnacletNgezahaYo, et al. Quantified Femtosecond Laser Based Opto-perforation of Living Cells[J]., 2009, 4(2): 111-117.

[6] 梁曉軒, 王晶, 張鎮(zhèn)西. 納米尺度激光緊聚焦光穿孔技術(shù)[J]. 西安交通大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 46(10): 107-115.

[7] 遲澤英, 陳文建. 應(yīng)用光學(xué)與光學(xué)設(shè)計(jì)基礎(chǔ)[M]. 南京: 東南大學(xué)出版社, 2008: 330-333.

[8] 陳姣, 焦明印, 常偉軍, 等. 紫外-可見寬光譜顯微成像光學(xué)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)[J]. 應(yīng)用光學(xué)報(bào), 2011, 32(2):195-199.

[9] 李曉彤, 岑兆豐. 幾何光學(xué)·像差·光學(xué)設(shè)計(jì)[M]. 杭州: 浙江大學(xué)出版社, 2003:124-132.

[10] 馬潔, 曾宇. 基于 1.06/1.54μm激光的離軸折反式平行光管物鏡設(shè)計(jì)[J]. 紅外技術(shù), 2010, 32(2): 81-83.

[11] 羅湘建.生物醫(yī)學(xué)熒光成像系統(tǒng)的應(yīng)用[J]., 2010, 23(6): 24-25.

[12] 高興宇, 蕭澤新, 伍世榮. 基于OSLO的無限遠(yuǎn)像距消色差顯微物鏡的設(shè)計(jì)[J]. 光學(xué)與光電技術(shù), 2006, 4(4): 4-7.

[13] Rao B, Soto F, Kerschensteiner D, et al. Integrated photoacoustic, confocal, and two-photon microscope[J]., 2014, 19(3): 036002-036002.

[14] Hiraoka Y, Shimi T, Haraguchi T. Multispectral imaging fluorescence microscopy for living cells[J]., 2002, 27(5): 367-374.

[15] 曾衛(wèi)娟, 李宗煥, 文印憲, 等. 多光譜成像技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2012, 12(5): 968-971.

Design of Microscopic Objective for Laser Cell Perforation with an Aligned Optical Path

HUANG You-ping，LIN Feng

(,,350007,)

Since living tissue can be perforated without injury bynear infrared spectrum, and in order to solve the problem of refocusing, the 7 pieces of front aperture microscope structure is designed and optimized in the 0.48-1.48mm waveband by using Zemax software. It realizes apochromatism and multi-spectral confocal imaging with the image distance of infinity, and the maximum focal shift is only 27mm. At the same time, the optical magnification reaches 40 and number aperture is 0.5. The Optimal Structure Designing shows that the system has high resolution, the MTF of visible wavelengths beyond 0.5 at a spatial frequency of 350lp/mm in 0.7 field. In addition, the MTF of 1480nm wavelength is close to the diffraction limit and the energy is high, which caters for the requirements of cell perforation. In the meantime, the experimental results are drawn out and we have made predictions about its prospects.

achromatic microscope objective，laser cell perforation，multispectral confocal imaging，Zemax software，infinity image distance

TH773

A

1001-8891(2015)04-0305-06

2014-10-20；

2015-02-04.

黃幼萍（1991-），女，漢族，福建泉州人，碩士研究生，主要從事光學(xué)設(shè)計(jì)方面的研究。E-mail: 986930890@qq.com。

林峰（1968-），男，漢族，福建龍巖人，高級(jí)工程師，主要從事光學(xué)設(shè)計(jì)方面的研究。E-mail: lfeng127@163.com。

福建省科技廳重點(diǎn)項(xiàng)目，編號(hào)：2013H0022；福州市科技計(jì)劃項(xiàng)目，編號(hào)：2014-G-68。