(玉溪師范學(xué)院 資源環(huán)境學(xué)院，云南 玉溪 653100)

滇龍膽(Gentianarigescens)為云南道地藥材，其主要藥效成分為龍膽苦苷.滇龍膽是龍膽瀉肝片、苦膽草片等200多種中藥的主要成分[1].近年來，龍膽市場需求量劇增，使野生滇龍膽野生資源遭到極大破壞[1].要解決龍膽的藥源問題，必須弄清龍膽苦苷生物合成途徑及其調(diào)控機(jī)理，這樣才能為通過基因工程生產(chǎn)龍膽苦苷奠定基礎(chǔ).

研究表明,WRKY轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)控萜類的生物合成.如,在棉花中，GaWRKY1通過激活(+)-δ-杜松烯合成酶而促進(jìn)棉子酚的生物合成[2];在擬南芥中，AaWRKY1通過激活紫穗槐-4，11-二烯合成酶的合成進(jìn)而促進(jìn)青蒿素的生物合成[3];在番茄毛狀體中，SlWRKY73主要在根中表達(dá)，能夠激活萜類合成酶基因SlTPS5的表達(dá)[4];在西洋參中，PqWRKY1是三萜人參皂苷生物合成的正調(diào)控因子[5].此外,最新研究表明，擬南芥中30%(22/72)的WRKY轉(zhuǎn)錄因子都對茉莉酸甲酯處理產(chǎn)生響應(yīng)，而在長春花中該數(shù)字為25%(12/48)[6].此前,通過對滇龍膽的根和葉進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，筆者發(fā)現(xiàn)GrWRKY2基因在葉中強(qiáng)烈上調(diào)，因此該基因可能與龍膽苦苷生物合成途徑的調(diào)控有關(guān).

此外,從目前的研究情況看，國內(nèi)外學(xué)者對龍膽的研究主要集中在種子萌發(fā)[7,8]、DNA條碼[9,10]、轉(zhuǎn)錄因子功能[11,12]、育種[13]等方面，而尚未對滇龍膽GrWRKY2基因進(jìn)行克隆和表達(dá)分析.因此,在本研究中,筆者根據(jù)滇龍膽轉(zhuǎn)錄組中的GrWRKY2基因序列，設(shè)計(jì)一對特異性引物，通過RT-PCR技術(shù)成功從滇龍膽幼葉中擴(kuò)增到該基因，并對其進(jìn)行序列分析.

1 材料和方法

1.1 材 料

本實(shí)驗(yàn)所用材料為滇龍膽(Gentianarigescens),其植株栽培于玉溪師范學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室.RNA提取所用材料為滇龍膽無菌苗幼葉.

1.2 方法

(1)葉片總RNA提取及GrWRKY2基因ORF的克隆.按照多糖植物組織提取試劑RNAiso(Takara，寶生物工程(大連)有限公司)說明書提取滇龍膽幼葉總RNA,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，寶生物工程(大連)有限公司)說明書合成cDNA.根據(jù)中間表達(dá)載體pENTR2B多克隆酶切位點(diǎn)和滇龍膽轉(zhuǎn)錄組中GrWRKY2基因序列，設(shè)計(jì)一對特異引物GrWRKY2BamHI-F：GGATCCATGTCTGACTCTAATTTTTATCAC(下劃線為BamHI酶切位點(diǎn))，GrWRKY2XhoI-R：CTCGAGTCAAATACTAGGGTTTGGATT(下劃線為XhoI酶切位點(diǎn)，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成).以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為PrimeSTAR Max Premix(2×，Takara，寶生物工程(大連)有限公司)25 μl，cDNA模板2 μl，正反向引物(10 μmol/L)各1 μl，加ddH2O補(bǔ)足50 μl.PCR反應(yīng)條件為：98 ℃變性10 s，50 ℃退火15 s，72 ℃延伸5 s，30循環(huán)；72 ℃加A尾30 min.PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，然后割膠，使用膠回收試劑盒(Qiagen，德國)對目的片段進(jìn)行回收，將其連接到pMD19-T載體(Takara，寶生物工程(大連)有限公司).轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(Takara，寶生物工程(大連)有限公司)后進(jìn)行藍(lán)白篩選，挑取白斑搖菌；使用試劑盒提取質(zhì)粒(百泰克，北京)，經(jīng)酶切檢測正確后進(jìn)行測序(上海生工，上海)，獲得重組質(zhì)粒pMD19-GrWRKY2.

(2)GrWRKY2基因的生物信息學(xué)分析.參考張曉東等[14]的方法對GrWRKY2基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析,其中二級結(jié)構(gòu)分析網(wǎng)址為：http://scratch.proteomics.ics.uci.edu/index.html.

2 結(jié)果與分析

2.1 滇龍膽GrWRKY2基因序列的克隆

以滇龍膽幼葉cDNA為模板，使用特異性引物擴(kuò)增出約400 bp的片段.通過TA克隆獲得重組質(zhì)粒pMD19-GrWRKY2，酶切檢測結(jié)果表明雙酶切獲得的兩片段大小之和等于單酶切片段大小，與預(yù)期相符.

2.2 GrWRKY2基因的生物信息學(xué)分析

利用Genetyx、DNAMAN軟件對GrWRKY2基因cDNA序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示GrWRKY2基因ORF全長362 bp，編碼120個(gè)氨基酸.將該序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號KM215137.

利用DNAMAN 7軟件將GrWRKY2蛋白氨基酸序列與NCBI中相似性較高的部分序列進(jìn)行比對分析，結(jié)果表明GrWRKY2蛋白與已知蛋白序列保守性較高(圖1).利用MEGA6.06將GrWRKY2氨基酸序列與其他相似性較高的WRKY序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示滇龍膽GrWRKY2蛋白與琴葉擬南芥AlWRKY15和白菜BrWRKY51親緣關(guān)系較近(圖2).

使用ExPASy ProtParam tool對GrWRKY2蛋白進(jìn)行分析,結(jié)果表明:GrWRKY2蛋白單體相對分子質(zhì)量為13.24 kD，pI為8.29；帶正電氨基酸殘基(Arg+Lys)為13，帶負(fù)電氨基酸殘基(Asp+Glu)為11，其分子式為C567H907N161O188S8,不穩(wěn)定指數(shù)為38.20，屬于穩(wěn)定蛋白；脂肪指數(shù)為71.58，總平均疏水性(GRAVY)為-0.518，為親水蛋白.分析結(jié)果表明還表明,GrWRKY2蛋白含有20種基本氨基酸，其中絲氨酸含量最高，為14.2%,其次是天冬酰胺，為12.5%,色氨酸含量最低，為0.8%.

說明:黑色-相似性等于100%；深灰色-75%≤相似性<100%；淺灰色-50%≤相似性<75%圖1 GrWRKY2蛋白與其他植物WRKY蛋白保守區(qū)的比對結(jié)果

圖2 GrWRKY2蛋白與植物中其他WRKY2蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析

圖3 GrWRKY2蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用Sspro對GrWRKY2蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明:該蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋(H)占28.33%，無規(guī)則卷曲(C)占59.17%，延伸帶(E)占12.50%.利用Swiss-Model Workspace,使用自動模式預(yù)測GrWRKY2蛋白的三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖3.該模型以擬南芥AtWRKY4[1wj2.1]為模板，在第89～120氨基酸處建模，序列相似度為53.13%.使用InterPro在線工具對GrWRKY2蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果表明GrWRKY2蛋白包含DNA-binding WRKY(IPR003657)保守結(jié)構(gòu)域.

利用SignalP 4.1服務(wù)器分析GrWRKY2蛋白，未發(fā)現(xiàn)信號肽，表明該蛋白為非分泌型蛋白.利用TMHMM工具預(yù)測GrWRKY2蛋白的跨膜螺旋區(qū)，結(jié)果表明GrWRKY2蛋白不含跨膜螺旋區(qū)域，為非膜蛋白.使用WoLF PSORT軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，結(jié)果為GrWRKY2蛋白的定位系數(shù)分別為：細(xì)胞核5.0，葉綠體3.0，細(xì)胞質(zhì)3.0，分泌途徑2.0.

3 討 論

WRKY蛋白家族的作用比較廣泛，主要參與生物脅迫、非生物脅迫、種子發(fā)育、種子休眠與萌發(fā)、衰老等過程[15].最近的研究結(jié)果還表明,WRKY蛋白還參與萜類生物合成的調(diào)控[2,3,5].WRKY蛋白的最典型特征是包含“WRKY”結(jié)構(gòu)域，其中W=色氨酸、R=精氨酸；K=賴氨酸；Y=酪氨酸.根據(jù)該保守結(jié)構(gòu)域，筆者在滇龍膽數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行搜索，發(fā)現(xiàn)了大量的WRKY蛋白，其中GrWRKY2基因在葉中表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于根，可能參與龍膽苦苷的生物合成.為此，本文對GrWRKY2基因進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)分析.但在基因克隆過程中，由于受到DNA聚合酶種類、PCR循環(huán)數(shù)等影響，往往會導(dǎo)致所克隆的片段發(fā)生突變.因此,本研究采用目前保真性最高的酶PrimeSTAR Max Premix，并將PCR循環(huán)數(shù)設(shè)置為30，來最大限度地防止所克隆片段的突變，從而使所克隆的基因序列具有很高的可信度.

使用生物信息學(xué)對所克隆的基因片段進(jìn)行分析，BLAST比對結(jié)果和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果均表明所克隆片段為WRKY基因.亞細(xì)胞定位分析結(jié)果表明，GrWRKY2蛋白可能定位于細(xì)胞核，這與西洋參PqWRKY1的細(xì)胞核定位結(jié)果相一致[5].保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明，GrWRKY2蛋白包含DNA-binding WRKY(IPR003657)保守結(jié)構(gòu)域,因此,筆者推測GrWRKY2蛋白可能通過該保守結(jié)構(gòu)域來調(diào)控細(xì)胞核內(nèi)基因的表達(dá).

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