蔡 健，馬同富，2*

(1.阜陽師范學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院 阜陽 236037; 2. 抗衰老中草藥安徽省工程技術(shù)研究中心 阜陽 236037)

薄荷( Mentha haplocalyx Brip.) 為唇形科薄荷屬，是一種多年生宿根性芳香草本植物，是世界上三大香料之一、常用中藥之一，貿(mào)易量在1 萬噸左右[1-2]。所以大力開發(fā)利用這一植物資源很有必要[1-3]。安徽省阜陽市是我國薄荷主產(chǎn)區(qū)，最高達(dá)到1 萬多hm2，約占全國的1/4。但由于繁殖材料攜帶母體病毒和薄荷連年種植等原因，導(dǎo)致薄荷品種嚴(yán)重退化，薄荷產(chǎn)量和原油質(zhì)量逐年下降。利用組織培養(yǎng)創(chuàng)造體細(xì)胞無性系變異，是作物品種改良的一條行之有效的技術(shù)途徑。運(yùn)用組織培養(yǎng)技術(shù)快速繁殖脫毒苗、優(yōu)質(zhì)苗已成為薄荷生產(chǎn)上的迫切需求，而薄荷離體培養(yǎng)愈傷組織誘導(dǎo)與分化是組織培養(yǎng)研究中的一個(gè)重要內(nèi)容[4-10]。本研究以薄荷莖段為外植體，研究培養(yǎng)基、激素水平對誘導(dǎo)、增殖培養(yǎng)的影響;以葉片為外植體，探討葉片的愈傷組織誘導(dǎo);以莖段、葉片和葉柄為外植體材料，比較不同外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)與材料

試驗(yàn)在阜陽師范學(xué)院生物技術(shù)應(yīng)用研究所生物組培室和阜陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院組織培養(yǎng)中心進(jìn)行，試驗(yàn)材料為阜陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院培育的“阜油9 號(hào)”薄荷品系。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體的消毒

外植體采回后，先用流水沖洗10 min，其中，莖段需要用刷子刷洗幾遍。然后都在超凈臺(tái)上用70% 酒精處理30 s，再對外植體消毒。消毒后均用無菌水沖洗4-5 遍。

1.2.2 培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件是光照強(qiáng)度1 000 Lx，光照時(shí)間14 h/d，培養(yǎng)溫度25 ℃，pH 值調(diào)至5.8-6.0。

1.2.3 愈傷組織誘導(dǎo)

1.2.3.1 葉片的愈傷組織誘導(dǎo)

以葉片為外植體，葉片切成(0.5 cm×0.5 cm)的方塊。每瓶接種4 塊外植體，重復(fù)3 次。培養(yǎng)期間，每周觀察記錄外植體的形態(tài)變化，30 d 后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。

愈傷組織誘導(dǎo)率=(產(chǎn)生愈傷組織的外植體塊數(shù)/接種的外植體塊數(shù)) ×100%

愈傷組織誘導(dǎo)天數(shù)為外植體接入培養(yǎng)基開始到外植體邊緣長出肉眼可見的淡黃色愈傷組織為止的天數(shù)。

1.2.3.2 不同外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率比較

對薄荷葉片、葉柄、莖段先用70%酒精消毒30 s，再用0.1% HgCl2+ Tween80 消毒20 min，切成0.5 cm 小段，葉片切成(0.5 cm ×0.5 cm) 小塊，接種在以下培養(yǎng)基上: (1) MS + 0.05 mg/L BA +0.01 mg/L NAA; (2) MS + 0.1 mg/L BA +0.01 mg/L NAA;(3) MS + 0.5 mg/L BA + 0.1 mg/L NAA;(4)MS + 1.0 mg/L BA + 0.1 mg/L NAA。每一處理10 瓶，每瓶接種5 個(gè)外植體，重復(fù)10 瓶。培養(yǎng)期間，每7 d 觀察記錄外植體的形態(tài)變化，30 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。愈傷組織分化率=( 分化出不定芽的愈傷組織塊數(shù)/愈傷組織總數(shù)) ×100%。

1.2.4 繼代培養(yǎng)

1.2.4.1 嫩莖的繼代增殖培養(yǎng)

以GA3、BA、KT 為三個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)L9(3)。選用由莖段培養(yǎng)獲得的一致的無菌苗在9 種培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，每種培養(yǎng)基接種20 個(gè)，每瓶2個(gè)，重復(fù)3 次。30 d 后統(tǒng)計(jì)其增殖率、增殖倍數(shù)。

增殖率=( 分化出不定芽的芽數(shù)/接種的總芽數(shù)) ×100%;

增殖倍數(shù)=( 每次繼代培養(yǎng)中增殖后的芽數(shù)/接種芽數(shù)) ×100%。

1.2.4.2 愈傷組織的繼代培養(yǎng)

采用正交設(shè)計(jì)L9 (3)，選取綠色緊密的愈傷組織，切成0.5 cm × 0.5 cm 的小塊，每種培養(yǎng)基接種10 瓶，每瓶2 個(gè)，重復(fù)3 次，30 d 后，統(tǒng)計(jì)其愈傷組織分化率。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織誘導(dǎo)

2.1.1 葉片愈傷組織誘導(dǎo)

薄荷葉片接種以后，依培養(yǎng)基中的激素配比不同，各組合都程度不同地形成愈傷組織，其誘導(dǎo)率、時(shí)間各不相同。據(jù)實(shí)驗(yàn)觀察，接種4 d 后，葉片明顯變厚且呈水漬狀，6 d 后在組織塊形成層表面形成愈傷組織。愈傷組織有的表面整齊，顏色呈深綠色，質(zhì)地堅(jiān)硬，28 d 愈傷組織細(xì)胞增生塊腫大，腫大部分為白色，形成的這一類愈傷組織整體增殖較慢。另一部分組織塊形成的愈傷組織表面凹凸不平，為泡狀細(xì)胞團(tuán)，淺綠色，同時(shí)，還有黃綠色，白色等愈傷組織的形成，其質(zhì)地都較松散，形成的這一類愈傷組織整體增殖較快。

表1 葉片愈傷組織誘導(dǎo)試驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，第6 種培養(yǎng)基MS +1.0 mg/L BA+0.1 mg/L KT + 0.5 mg/L NAA 的愈傷組織誘導(dǎo)效果最好，誘導(dǎo)率高達(dá)100%，誘導(dǎo)時(shí)間最短，僅為6 d。第1 種培養(yǎng)基( MS + 0.1 mg/L BA +0.1 mg/L KT + 0.1 mg/L NAA) 的愈傷組織誘導(dǎo)率最低，為72%，而且誘導(dǎo)的時(shí)間也較長，為9 d。第5 種培養(yǎng)基( MS + 0.5 mg/L BA + 1.0 mg/L KT + 0.5 mg/L NAA)，雖然也能獲得最高的誘導(dǎo)率(100%)，但與沒有加KT 的對照培養(yǎng)基對比(MS + 0.5 mg/L BA + 0.5 mg/L NAA)，其愈傷組織容易老化，呈黃褐色，不利于繼代培養(yǎng)和分化培養(yǎng)。第2-4 種培養(yǎng)基雖然誘導(dǎo)時(shí)間短，但愈傷組織誘導(dǎo)率不高。第7-9 種培養(yǎng)基的誘導(dǎo)時(shí)間較長、但其愈傷組織的誘導(dǎo)率較高。

2.1.2 激素對誘導(dǎo)率的影響

BA 和NAA 對愈傷組織的誘導(dǎo)率存在著顯著的作用，而KT 的作用不顯著。當(dāng)NAA 濃度為0.1 mg/L，1.0 mg/L 時(shí)對誘導(dǎo)率的影響差別不大，但當(dāng)NAA 濃度為0.5 mg/L 時(shí)，可顯著地提高愈傷組織的誘導(dǎo)率。BA 為0.1 mg/L 濃度時(shí)，愈傷組織的誘導(dǎo)率低，BA 為0.5 mg/L、1.0 mg/L 濃度時(shí)顯著地提高愈傷組織的誘導(dǎo)率，因此可推測最佳激素組合(5)和組合(6)較好。因?yàn)镵T 的價(jià)格昂貴，在考慮降低成本的前提下，得出最佳組合應(yīng)為組合(6)。

2.1.3 不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)比較

取薄荷新生枝的中部葉片，去除新生枝葉片部分后即得所需葉柄。試驗(yàn)過程中，將經(jīng)過消毒的幼葉、葉柄接種在不同的培養(yǎng)基上，7 d 后，幼葉的主脈最先長出愈傷組織，繼而切口處逐漸愈傷化，愈傷組織自兩端形成，并向中間發(fā)展，直至整個(gè)組織;20 d 后，愈傷組織已覆蓋整個(gè)葉片; 葉柄在接種15 d 后，其一端開始出現(xiàn)黃綠色緊密的愈傷組織，有的葉柄兩端出現(xiàn)愈傷組織，但其愈傷組織的增殖較慢。

表2 不同外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率

從表2中可以看出，在附加BA 和NAA 的4 種培養(yǎng)基中，愈傷組織誘導(dǎo)率都在72%以上，第3 種培養(yǎng)基即MS + 0.5 mg/L BA + 0.1 mg/L NAA對幼葉、葉柄和莖段都具有很高的愈傷組織誘導(dǎo)率，分別為100%、88%和87%，而且愈傷組織的長勢也最好，培養(yǎng)1 個(gè)月時(shí)能達(dá)到1.0 cm 大小，其中幼葉的愈傷組織最大可達(dá)1.5 cm 。第4 種培養(yǎng)基MS + 1.0 mg/L BA +0.1 mg/L NAA 對三者的誘導(dǎo)效果次之，其愈傷組織的長勢也較好，培養(yǎng)1 個(gè)月后，愈傷組織基本能達(dá)到0.9 cm 左右。第1 種培養(yǎng)基MS + 0.05 mg/L BA + 0.01 mg/L NAA對幼葉、葉柄和莖段的愈傷組織 誘 導(dǎo) 率最低，愈傷組織長勢也最差，葉柄和莖段的愈傷組織體積均低 于0.5 cm。第1-2 種培養(yǎng)基所得愈傷組織的誘導(dǎo)率和愈傷組織長勢均差于其它兩組?？偟膩砜?，幼葉在4 種培養(yǎng)基上是三類外植體中誘導(dǎo)效果最好的，不僅愈傷組織誘導(dǎo)率高，長勢旺，而且愈傷組織出現(xiàn)也最早。此外，4 種不同培養(yǎng)基上形成的愈傷組織的類型不相同，葉片的愈傷組織呈綠色緊密狀，葉柄的愈傷組織呈黃綠色緊密狀，莖段的愈傷組織呈淡黃色松軟狀。

2.2 繼代培養(yǎng)

BA、KT 和GA3正交試驗(yàn)的結(jié)果表明細(xì)胞分裂素、生長素對植物器官分化、生長發(fā)育有著極其重要的影響。第9 種培養(yǎng)基即MS + 1.5 mg/L GA3+ 1.0 mg/L BA + 0.5 mg/L KT 對薄荷幼莖的增殖效果最好，其增殖率高達(dá)83%，增殖倍數(shù)為4.7。第7 種培養(yǎng)基MS + 1.5 mg/L GA3+ 0.2 mg/L BA + 1.0 mg/L KT 的增殖效果最低，其增殖率僅為51%，增殖倍數(shù)為2.5。第6 種培養(yǎng)基MS +1.0 mg/L GA3+ 1.0 mg/L BA + 0.2 mg/L KT 雖然能獲得很高的增殖倍數(shù)(4.6)，但其增殖率卻只有75%。第8 種培養(yǎng)基MS + 1.5 mg/L GA3+0.5mg/L BA + 0.2 mg/L KT 的增殖率(80%) 高，但增殖倍數(shù)僅為3.5。第1-5 種培養(yǎng)基對薄荷幼莖的增殖率和增殖倍數(shù)均不明顯。試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)嫩莖基部總有一定的愈傷組織，增殖芽就是從愈傷組織中長出。

表3 薄荷莖段增殖培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果

從表3中可以看出，試驗(yàn)所安排的三個(gè)因素對薄荷嫩莖增殖率的影響均無顯著性差異。BA 的濃度對試驗(yàn)結(jié)果影響最大。GA3、BA、KT 三種激素對增殖率的影響以BA 最為明顯，隨著BA 濃度的增大，薄荷嫩莖的增殖率也增大。GA3的濃度對薄荷嫩莖與BA 的變化趨勢相似，也是隨著GA3濃度的增大，其增殖率增大，但變化的幅度相對較小。隨著KT 濃度的增大，薄荷幼莖的增殖率開始是呈下降趨勢，當(dāng)濃度達(dá)到某一臨界值時(shí)，其增殖率則呈緩慢上升趨勢，KT 濃度臨界值為0.5 mg/L。

3 小結(jié)與討論

3.1 小結(jié)

以增殖倍數(shù)和增殖率作指標(biāo)探討了薄荷增殖培養(yǎng)的效果。綜合各項(xiàng)指標(biāo)，最佳增殖培養(yǎng)基應(yīng)為:MS + 1.0 mg/L BA + 0.1 mg/L KT + 0.5 mg/L NAA。

以葉片、葉柄、莖段為外植體誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)，誘導(dǎo)率都達(dá)72%以上，高的可達(dá)100%。但三者的愈傷組織質(zhì)地呈現(xiàn)明顯的差異，以莖段誘導(dǎo)的愈傷組織質(zhì)的松軟，顏色黃綠; 葉片誘導(dǎo)的愈傷組織質(zhì)地緊密堅(jiān)硬，顏色深綠，更有利于愈傷組織的分化，最適的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS + 1.0 mg/L BA + 0.1 mg/L KT + 0.5 mg/L NAA。愈傷組織20 d 繼代一次，轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基愈傷組織一直沒有分化。

3.2 討論

3.2.1 關(guān)于嫩莖增殖過程中芽的起源問題

在嫩莖增殖培養(yǎng)過程中，嫩莖基部總有一定的愈傷組織，所增殖的芽從愈傷組織中長出，很容易讓人認(rèn)為是從愈傷組織分化出來的。本試驗(yàn)將此類愈傷組織切成塊，繼續(xù)培養(yǎng)，卻未見有芽的分化，而帶嫩莖的愈傷組織塊上則又有不定芽的增殖。表明可能是嫩莖中的生長激素可以促進(jìn)愈傷組織分化出不定芽;或者并不是愈傷組織分化出了不定芽，而可能是由嫩莖生長發(fā)育形成的，即嫩莖基部的隱芽的生長，這有待今后組織學(xué)方面的研究來驗(yàn)證。

3.2.2 關(guān)于組織培養(yǎng)中愈傷化的問題

在本試驗(yàn)中，不管是嫩莖的增殖培養(yǎng)，還是無菌苗的生根培養(yǎng)，苗的基部一般都易腫大愈傷化。前者不利于嫩莖的生長，后者則會(huì)影響移栽成活率。在降低了培養(yǎng)基中的激素濃度后，試驗(yàn)結(jié)果，仍然都有愈傷組織，雖然在繼代培養(yǎng)中存在著激素的累積作用，但也不排除薄荷的內(nèi)源激素生長素水平可能較高。目前，薄荷內(nèi)源激素水平測定的研究很少，特別是在組織培養(yǎng)方面。原因有待于從內(nèi)源激素方面作進(jìn)一步探討。

3.2.3 玻璃化的問題

玻璃化現(xiàn)象在植物組織培養(yǎng)中普遍存在，在實(shí)驗(yàn)過程中，所采的已萌發(fā)的頂芽褐化現(xiàn)象嚴(yán)重，一方面褐化的發(fā)生與外植體組織中所含的酚類化合物多少和多酚氧化酶活性有直接關(guān)系，而且在生長季節(jié)都含有較高的酚類物質(zhì); 另一方面，也可能與消毒有關(guān)，因?yàn)橛啄鄣牟牧先菀资艿交瘜W(xué)消毒劑的傷害，而受傷害程度會(huì)直接影響褐化，如消毒后的嫩葉和葉柄有的接種第2 d 即出現(xiàn)褐化，幾天后死亡。為了減輕褐化，則應(yīng)選用新生枝的中部的葉片和葉柄，頂芽應(yīng)選粗的并切長些。

3.2.4 展望

現(xiàn)在世界上幾乎所有地區(qū)均在開展植物組織培養(yǎng)的研究和應(yīng)用，大部分是研究植物的再生和快速繁殖。薄荷的研究也不落后，其組織培養(yǎng)報(bào)道越來越多，但能否進(jìn)行大量繁殖，有三個(gè)關(guān)鍵問題:無菌苗的獲得、繁殖速度和生根移栽。目前在這些方面的研究雖然已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但在生產(chǎn)上實(shí)行工廠化育苗仍有許多限制因素。如生產(chǎn)成本高，優(yōu)良株系少等。今后的研究如在愈傷組織的分化、人工種子的生產(chǎn)實(shí)用化方面取得一定的進(jìn)展，則薄荷芽的生產(chǎn)可以由種芽大量提供，如豆芽菜的生產(chǎn)一樣，不受季節(jié)約束，占地面積小，而且管理方便，生產(chǎn)成本大大降低。同時(shí)愈傷組織的分化利于建立薄荷的再生體系，為薄荷的遺傳改良研究打下基礎(chǔ)。

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