祝 艷，張春陽(yáng)，馮華松,陳旭昕，王 偉

直線加速器X線照射對(duì)人肺成纖維細(xì)胞經(jīng)典Wnt通路中關(guān)鍵信號(hào)蛋白的影響

祝 艷1，張春陽(yáng)2，馮華松2,陳旭昕2，王 偉3

目的 探討直線加速器X線照射對(duì)人肺成纖維細(xì)胞經(jīng)典Wnt通路中關(guān)鍵信號(hào)蛋白的影響。方法 人肺成纖維細(xì)胞分為照射組和正常對(duì)照組，照射組經(jīng)直線加速器X線5 Gy照射24 h后，Western blot檢測(cè)兩組成纖維細(xì)胞胞核內(nèi)β-catenin蛋白表達(dá)，Real time PCR檢測(cè)成纖維細(xì)胞胞核內(nèi)β-catenin mRNA表達(dá)，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中WISP-1蛋白表達(dá)。結(jié)果 照射組人肺成纖維細(xì)胞β-catenin蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)水平均高于對(duì)照組，WISP-1蛋白表達(dá)水平也顯著升高，與對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(637±88)vs(387±58)，P<0.05]。結(jié)論 直線加速器X線照射可誘導(dǎo)人肺成纖維細(xì)胞經(jīng)典Wnt通路活化，促進(jìn)肺纖維化的形成，可能為放射性肺損傷的治療提供新的靶點(diǎn)。

放射性肺損傷；Wnt信號(hào)通路；肺成纖維細(xì)胞；肺纖維化；直線加速器

放射性肺損傷是胸部惡性腫瘤進(jìn)行放射治療中常見(jiàn)的不良反應(yīng)之一，可進(jìn)展為肺間質(zhì)纖維化，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，限制了放射治療的開(kāi)展[1,2]。此外，核泄漏事故的頻發(fā)和戰(zhàn)爭(zhēng)中核武器的使用所造成的輻射效應(yīng)也可累及肺部。文獻(xiàn)[3]報(bào)道Wnt信號(hào)通路是肺組織發(fā)育所必需的分子信息傳遞系統(tǒng)，在細(xì)胞的增殖及分化過(guò)程中起到重要作用，其表達(dá)異常與肺纖維化和肺部腫瘤等呼吸系統(tǒng)疾病都存在緊密的聯(lián)系。本研究通過(guò)檢測(cè)放射線照射后人肺成纖維細(xì)胞(human lung fibroblasts，HLFs)中經(jīng)典Wnt通路中部分主要信號(hào)蛋白的變化，以揭示放射線對(duì)其影響，為探索放射治療致肺損傷的新靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 HLFs由解放軍醫(yī)學(xué)院陳潔博士惠贈(zèng)； DMEM/F12培養(yǎng)液、胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS;GIBCO，USA)，按培養(yǎng)液∶胎牛血清為9∶1的比例配置成完全培養(yǎng)液；青霉素、鏈霉素、0.25%胰蛋白酶-EDTA(Hyclone，USA)、5%牛血清白蛋白、PMSF、磷酸酶抑制藥、β-catenin 兔單克隆一抗(1∶500，EPITOMICS,1247-1)、GAPDH 兔單克隆一抗(1∶500，abcam, ab9485)、Histon H3 兔多克隆一抗(1∶500，abcam, ab45173)、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG二抗(1∶1000，Jackson，購(gòu)自北京普利萊生物技術(shù)公司，貨號(hào)：C1309)、胞核胞漿蛋白制備試劑盒 (Nuclear-Cytosol Extraction Kit，P1200，APPLYGEN)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime ScriptTM RT Reagent Kit，RR037A，Takara)及熒光定量PCR試劑盒(SYBR? Premix Ex TaqTM (Tli RNaseH Plus) Kit, RR820A/B，Takara)購(gòu)自寶生物(大連)有限公司；TRIzd WISP-1(BP-E11700, Lengton)ELISA試劑盒、ELISA酶標(biāo)儀(Thermo，3001-122J)、二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo)。

1.2 方法

1.2.1 HLFs的培養(yǎng) 將細(xì)胞接種于含10%FBS的DMEM/F12中，放于37 ℃ 5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)，每1～2 d換液1次，待細(xì)胞融合至80%左右傳代。

1.2.2 分組 HLFs傳代24 h后，細(xì)胞貼壁，分為對(duì)照組(C組)和照射組(R組)。C組常規(guī)培養(yǎng)，不做任何處理；R組細(xì)胞經(jīng)X線照射(劑量為5 Gy)。兩組細(xì)胞再培養(yǎng)24 h后分別留取上清、提取細(xì)胞核蛋白和RNA。

1.2.3 檢測(cè)方法及指標(biāo)

1.2.3.1 Western Blot 檢測(cè)HLFs中β-catenin的蛋白表達(dá) 按實(shí)驗(yàn)條件分組處理后，收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌2 次，加入200 ml胞核蛋白提取裂解液(每1ml裂解液中加10 μl PMSF)，冰上裂解10 min，搖床震蕩。4 ℃，12 000 r/min，離心10 min，取上清,BCA法測(cè)定蛋白含量。4∶1體積比加入上樣緩沖液，100 ℃ 5min 蛋白變性。每孔上樣等量總蛋白，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后取下凝膠，30 V轉(zhuǎn)膜150 min，含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h。TBST 洗膜5 min/次×3 次，加入一抗β-catenin(1∶1000 稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜。TBST 洗膜3 次,每次5 min，加入對(duì)應(yīng)二抗(1∶500稀釋)，室溫孵育1 h。顯色液暗處顯色觀察，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析，β-catenin水平用β-catenin和內(nèi)參蛋白的相對(duì)密度表示。

1.2.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量-PCR檢測(cè)HLFs中β-catenin基因mRNA表達(dá)水平 將收集的HLFs加入500 μl TRIzol試劑抽提細(xì)胞總RNA，測(cè)定總RNA純度及濃度。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)體系：5×Mix 2 μl，RNA 8 μl，總量10 μl；反應(yīng)條件，37 ℃，15 min；85℃，5 s。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物采用real

time PCR試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系20μl：2×SYBR Mix 10μl，上下游引物各0.4 μl，ROX Dye 0.4 μl，cDNA模板2 μl，ddH2O 6.8 μl。采用ABI step one plus序列檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參校正每個(gè)樣本的循環(huán)閾值Ct，得到ΔCt，目的基因的相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCt值表示，重復(fù)3次。引物設(shè)計(jì)及合成由上海生工生物工程有限公司完成:β-catenin sense 5′-CTTACACCCACCATCCCACT-3′；antisense 5′-GCACGAACAAGCAACTGAAC-3′。β-actin sense 5′- TGCGTGACATTAAGGAGAA-3′；antisense 5′-TGATGGAGTTGAAGGTAGTT-3′。

1.2.3.3 ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中WISP-1水平 采用ELISA法(試劑盒)，ELISA酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)吸光度值，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其濃度值，每個(gè)樣本做3復(fù)孔。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，兩組均數(shù)比較采用成組t檢驗(yàn),以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 倒置相差顯微鏡下觀察HLFs的形態(tài) HLFs傳代后正常培養(yǎng)48 h后，于倒置相關(guān)顯微鏡不同倍鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)(圖1)，細(xì)胞大小基本一致，細(xì)胞形態(tài)呈梭形、三角形或不規(guī)則形，邊緣光滑，細(xì)胞排列為旋渦狀或放射狀。

圖1 倒置相差顯微鏡不同倍鏡下HLFs細(xì)胞形態(tài)

2.2 Western blot檢測(cè)結(jié)果 β-catenin表達(dá)顯示定位于HLFs細(xì)胞核內(nèi)。C組β-catenin蛋白表達(dá)較弱，照射后HLFs細(xì)胞核內(nèi)β-catenin蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)(圖2)。

圖2 Western blot 檢測(cè)HLFs胞核中β-catenin蛋白表達(dá)

2.3 Realtime PCR 檢測(cè)HLFs β-catenin mRNA水平 R組中24 h HLFs中β-catenin mRNA表達(dá)水平是正常HLFs的(10.4±2.2)倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0016)。

2.4 ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中WISP-1表達(dá) C組為387±58，R組為637±88,R組明顯高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),提示放射線照射后的HLFs產(chǎn)生WISP-1增多。

3 討 論

放射性肺纖維化是放射性肺損傷的演變和結(jié)局，以至使廣大患者感到恐慌，其預(yù)防和治療迫在眉睫。肺纖維化過(guò)程中有多種細(xì)胞因子共同參與，形成復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)影響間質(zhì)成纖維細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞的增殖和凋亡，促使肺纖維化持續(xù)進(jìn)展。肺成纖維細(xì)胞被認(rèn)為是纖維化誘導(dǎo)形成和發(fā)展過(guò)程中的主要細(xì)胞類(lèi)型，其活化、增殖和分化，以及隨之出現(xiàn)的大量細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的沉積是肺纖維化的重要標(biāo)志[4,5]。

近年來(lái)多項(xiàng)研究表明，Wnt信號(hào)途徑參與肺纖維化的形成過(guò)程[6,7]。Wnt信號(hào)通路是一條高度保守的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞形態(tài)與功能的分化、細(xì)胞凋亡與細(xì)胞癌變等，影響著生命過(guò)程。Wnt通路包括以下3條途徑：(1)經(jīng)典Wnt信號(hào)途徑，即Wnt/β-連環(huán)蛋白(Wnt/β-catenin)信號(hào)途徑，調(diào)控細(xì)胞的增生和分化；(2)平面細(xì)胞的極性(the planar cell polarity，PCP)途徑，即Wnt/PCP途徑，在脊椎動(dòng)物中又稱Wnt/JUN激酶途徑；(3)Wnt/Ca2+途徑[8,9]。其中經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，即Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)作為肺部發(fā)育所必需的分子信息傳遞系統(tǒng)，其表達(dá)異常與肺纖維化也密切相關(guān)，引起眾多學(xué)者的廣泛研究。該通路表達(dá)如下：當(dāng)Wnt蛋白與細(xì)胞表面卷曲蛋白受體(Fzzled，F(xiàn)z)以及輔助受體LRP5/6(低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6)結(jié)合，Wnt信號(hào)通路被激活，活化的蓬亂蛋白(Dishevelled，Dsh或Dvl)抑制糖原合成酶3β(GSK-3β)活性，從而β-catenin磷酸化減少，導(dǎo)致β-catenin不能被泛素連接酶識(shí)別，從而不能被蛋白酶復(fù)合體降解，β-catenin在胞質(zhì)內(nèi)大量積累，并向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，與核內(nèi)含有高遷移組非組蛋白盒(HMG—BOX)的轉(zhuǎn)錄因子T細(xì)胞因子/淋巴細(xì)胞增強(qiáng)因子(T cell factor/lymphoid enhancer factor，Tcf/LEF)家族成員結(jié)合，啟動(dòng)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。相關(guān)研究表明，當(dāng)β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)聚集時(shí)，可作為該信號(hào)通路激活的標(biāo)志[10]。Jésus等[11]在呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷(Ven- tilator Induced Lung Injury，VILI)的研究中認(rèn)為，Wnt5a、β-catenin激活下游靶基因中基質(zhì)金屬蛋白酶7(matrix metalloproteinase 7，MMP7)、細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、軸蛋白AXIN2，在VILI早期即可引起肺纖維化。另有研究通過(guò)基因重組方法，使人胚肺成纖維細(xì)胞高表達(dá)β-catenin，發(fā)現(xiàn)可降低上皮型鈣黏連素的表達(dá)和細(xì)胞間黏附，促進(jìn)細(xì)胞趨化，由此認(rèn)為β-catenin在肺纖維化的發(fā)生中起推動(dòng)作用[12]。Chilosi等[13]對(duì)特發(fā)性肺纖維化的研究中發(fā)現(xiàn)，在胞核內(nèi)β-catenin水平增加的同時(shí)，Wnt信號(hào)通路下游靶基因cyctin D1和MMP基因轉(zhuǎn)錄也隨之增強(qiáng)，這可能是成纖維細(xì)胞異常增殖的原因之一。此外，Wnt通路與多個(gè)信號(hào)途徑,如Smad途徑有交叉對(duì)話，通過(guò)β-catenin影響轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)的轉(zhuǎn)錄活性，促使肺泡上皮細(xì)胞向成肌纖維樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化，增加細(xì)胞外基質(zhì)的堆積；TGF-β亦可正向調(diào)節(jié)Wnt通路，與肺纖維化的發(fā)生密切相關(guān)[14,15]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)模擬體內(nèi)環(huán)境，將HLFs直接暴露在直線加速器X線下，照射劑量5 Gy[16,17],體外檢測(cè)Wnt信號(hào)通路中的關(guān)鍵信號(hào)表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)照射組β-catenin蛋白水平較對(duì)照組明顯高表達(dá)，證實(shí)經(jīng)放射線照射刺激后，Wnt/β-catenin信號(hào)通路被激活。因此β-catenin被視作Wnt信號(hào)通路中的關(guān)鍵信號(hào)因子，在肺纖維化的各個(gè)環(huán)節(jié)扮演著重要角色，有望成為調(diào)控Wnt信號(hào)通路和干預(yù)肺纖維化過(guò)程的靶點(diǎn)。

此外，研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)液中WISP-1表達(dá)升高。WISP-1是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的下游基因之一，是一種富含半胱氨酸的長(zhǎng)度為367個(gè)氨基酸的分泌性蛋白多肽，可由成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞合成分泌[18]。有研究表明，WISP-1在肺纖維過(guò)程中出現(xiàn)過(guò)表達(dá)[19]。同時(shí)，在體內(nèi)試驗(yàn)中抑制WISP-1可減輕實(shí)驗(yàn)性肺纖維化[20]。WISP-1表達(dá)的變化表明與肺纖維化密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Wnt/β-catenin通路活化后，其下游的靶基因WISP-1表達(dá)明顯升高，提示放射線照射活化該通路后導(dǎo)致HLFs產(chǎn)生WISP-1顯著增加，從而促進(jìn)的纖維化的形成。就此推測(cè)WlSP-1可能是抗肺纖維化治療的又一潛在靶點(diǎn)，為纖維化疾病的治療提供了新視角。

本研究表明，HLFs經(jīng)放射線照射后高表達(dá)β-catenin、WISP-1，提示放射線可激活HLFs中經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，且該通路下游可過(guò)表達(dá)靶基因WISP-1。目前發(fā)現(xiàn)該通路中的主要組分均在放射性肺纖維化發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色[21,22]。本研究證實(shí)，作為放射性肺損傷中的重要效應(yīng)細(xì)胞，HLFs在放射線照射后，有可能通過(guò)活化該通路參與到放射性肺損傷的過(guò)程。因此，通過(guò)抑制Wnt/β-catenin通路中的關(guān)鍵因子可能會(huì)達(dá)到阻滯纖維化進(jìn)展的目的，為今后臨床上靶向治療肺纖維化提供方向和思路。此外，由于傳統(tǒng)治療肺纖維化的方法局限，收效甚微，關(guān)于干細(xì)胞治療肺纖維化的研究已經(jīng)廣泛展開(kāi)，且已有研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞可以修復(fù)肺泡上皮細(xì)胞和抑制纖維增生[23,24]，延緩肺纖維化的進(jìn)展，其治療機(jī)制尚未完全闡明。因此，對(duì)于干細(xì)胞是否通過(guò)抑制HLFs中經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，從而影響肺纖維化的發(fā)生發(fā)展是筆者課題組目前正在研究的內(nèi)容。本實(shí)驗(yàn)僅僅在體外單一細(xì)胞水平研究了放射線對(duì)纖維化的影響，尚需更多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，為臨床治療肺纖維化奠定基礎(chǔ)。

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(2015-01-14收稿 2015-02-28修回)

(責(zé)任編輯 梁秋野)

Effect of X-ray linear accelerator on the signaling proteins of canonical Wnt pathway in human lung fibroblasts

ZHU Yan1,ZHANG Chunyang2, FENG Huasong2,CHEN Xuxin2,and WANG Wei3.

1.Navy Clinical Academy,Anhui Medical Uiniversity,Hefei 230032,China;2.Respiratory Diseases Department,3.Radiation Oncology, Navy General Hospital,Beijing 100048,China

Objective To investigate the effect of irradiation with X-ray linear accelerator on the key signaling proteins of canonical Wnt pathway in human lung fibroblasts (HLFs). Methods HLFs were divided into irradiated group and normal group. R group was irradiated by linear accelerators X-ray(5 Gy). After 24 hours, the expression of the protein levels of β-catenin in nucleus was examined by Western blot, the mRNA level of the HLFs was examined by real time PCR,and the levels of WISP-1 protein in conditioned medium (CM) was examined by ELISA. Results Compared with the normal control group, the protein and gene expression level of beta-catenin increased in irradiated group HLFs,the same to the protein expression levels of WISP-1，which were statistically significant(P<0.05).Conclusion Irradiation with X-ray linear accelerator can induce the activation of canonical Wnt signaling pathway in HLFs and promote the formation of pulmonary fibrosis,which probably provide the new target of the treatment of radiation-induced lung injury.

radiation-induced lung injury; Wnt signaling pathway; lung fibroblasts; pulmonary fibrosis;linear accelerator

基金支持：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81300050)

祝 艷，碩士研究生，E-mail：zhuyan890925@126.com

1.230032 合肥，安徽醫(yī)科大學(xué)海軍臨床學(xué)院；100048 北京，海軍總醫(yī)院：2.呼吸內(nèi)科，3.放射腫瘤科

馮華松，E-mail：fenghs99@163.com

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