曹鳳華， 李 慧， 張玉超， 劉志敏， 梅宇飛， 尚 帥， 楊 旭， 丁書茂

(華中師范大學 生命科學學院 遺傳調控與整合生物學湖北省重點實驗室， 武漢 430079)

?

甲醛對小鼠器官組織內cAMP含量的影響及其機理探討

曹鳳華， 李 慧， 張玉超， 劉志敏， 梅宇飛， 尚 帥， 楊 旭， 丁書茂*

(華中師范大學 生命科學學院 遺傳調控與整合生物學湖北省重點實驗室， 武漢 430079)

為探討甲醛是否通過信號分子途徑影響造血系統(tǒng)的代謝調節(jié)，選用雄性Balb/c小鼠為研究對象，采用動態(tài)吸入方式染毒7 d，每天8 h，染毒濃度分別為0，0.5，1.0，3.0 mg/m3.染毒結束后，檢測小鼠腦、血漿、骨髓中cAMP含量變化.結果表明，在不同濃度的甲醛暴露條件下，與空白對照組相比，腦組織中cAMP含量沒有顯著性變化；血漿中cAMP含量與對照組相比，0.5、3.0 mg/m3染毒組出現(xiàn)極顯著性差異(P<0.01)，1.0 mg/m3染毒組出現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)；骨髓中cAMP含量與對照組相比，0.5，1.0，3.0 mg/m3染毒組都出現(xiàn)顯著性差異(P<0.05).研究表明，甲醛暴露對造血系統(tǒng)的毒性與胞內信號分子cAMP傳導途徑相關.

甲醛； 小鼠； cAMP； 機制

甲醛是一種常見的裝修型室內空氣污染物[1-2]，甲醛暴露對動物甚至人類的毒性作用是多種多樣的，不僅對免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)產生毒性，還具有遺傳毒性、神經毒性和致癌作用[3].2004年，IARC明確指出：甲醛能嚴重影響人類健康，并確定甲醛是A1組人類致癌物[4].2011年11月，美國國立衛(wèi)生研究所確定甲醛暴露可以引發(fā)白血病[5]，但誘導人感染白血病產生的機制尚不清楚.

甲醛與白血病關系的研究，關鍵在于造血系統(tǒng)是否受甲醛暴露影響，其中，骨髓組織是一個非常重要的靶器官.Heck[6]等的實驗結果表明，體內甲醛濃度一直保持在恒定水平，不隨外界甲醛濃度改變而改變，但有研究表明吸入性甲醛對血液、骨髓等組織存在一定的毒性[7-8].甲醛也是一種生物內源性有機化合物，甲醛污染所造成的毒性，很可能不是甲醛分子本身具有毒性，而是直接進入到組織后，破壞機體甲醛濃度的平衡，作為信號分子干擾了造血系統(tǒng)的代謝調節(jié).

3’，5’-環(huán)磷酸腺苷(cyclicadenosine monophosphate，cAMP)是最早發(fā)現(xiàn)的細胞內信使，由于參與細胞內多種調節(jié)機制，將cAMP稱為第二信使，它是ATP在腺苷酸環(huán)化酶(AC)的作用下生成，在正常細胞中的含量甚微.許子亮[9]等的研究表明，血中cAMP含量的變化與白血病及再生障礙性貧血癥有相關性.為研究吸入性甲醛是否以信號分子的途徑對造血系統(tǒng)機制產生影響，選擇小鼠骨髓、血漿、腦為研究材料，檢測其cAMP含量的變化，以探索甲醛引起白血病的分子機理.

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

SPF級雄性Balb/c小鼠，購于湖北省預防醫(yī)學科學院動物實驗中心.

1.2 主要試劑和儀器

試劑:10%的甲醛溶液(Sigma公司)；小鼠環(huán)磷酸腺苷ELSA檢測盒(濟南朋遠生物技術有限公司).

儀器:HOPE-MED 8050動式染毒控制系統(tǒng)；4160-2型甲醛測定儀(Interscan公司)；冷凍離心機(Eppendof-5415R)；全波長酶標儀(BIO-TEK，美國)等.

1.3 實驗方法1.3.1染毒 將24只Balb/c小鼠隨機分為1個對照組和3個染毒組，每組6只，甲醛經HOPE-MED 8050動式染毒控制系統(tǒng)調配后，持續(xù)穩(wěn)定地輸出濃度為0.5 mg/m3[10]，1.0 mg/m3，3.0 mg/m3[11]的甲醛氣體，染毒組在染毒艙中連續(xù)動態(tài)染毒7 d，每天8 h.在染毒期間，所有小鼠禁止進食和飲水.1.3.2小鼠血漿的采集 本實驗采用心臟取血的方法進行采血.染毒結束后，腹腔注射麻醉劑(1%戊巴比妥鈉溶液，生理鹽水配制)使各染毒組小鼠麻醉.每只小鼠的麻醉劑量依小鼠體重而定:0.02 mL/kg.待小鼠徹底麻醉以后，用一次性1 mL注射器抽取950 μL～1 000 μL血液.抽血前每只注射器先抽取少量濃度為15 g/L的EDTA(抗凝劑)來回浸潤.抽血結束后立即將得到的血液注入新的裝有少量抗凝劑的EP管中，3 000 r/min離心15 min，取上清，用于cAMP含量的檢測.

1.3.3 小鼠腦組織勻漿的制備 心臟取血后，用頸椎脫臼法處死小鼠，立即取腦組織，根據(jù)小鼠環(huán)磷酸腺苷ELSA檢測盒說明書，將腦組織在冰冷的生理鹽水中漂洗，用濾紙拭干，腦組織加生理鹽水制成10%勻漿液，低溫離心后取上清，用于cAMP含量的檢測.

1.3.4 小鼠骨髓細胞的制備 取出雙側股骨，用1 mL生理鹽水吹出骨髓組織細胞，4℃，500 g離心5 min，棄上清.配制骨髓組織細胞懸液，濃度為1×106個/mL.取細胞懸液1 mL，加60 μL細胞裂解液，裂解20 min，混勻5次，再裂解20 min，4℃，12 000 g離心5 min，取上清，用于cAMP含量的檢測.

1.3.5 cAMP含量的測定 小鼠腦、血漿、骨髓組織中cAMP含量的測定，嚴格按照小鼠環(huán)磷酸腺苷ELSA檢測盒說明書進行測定.測得結果后，按要求作標準曲線，求算樣品中cAMP 含量.

2 實驗結果

2.1 氣態(tài)甲醛暴露對小鼠血漿中cAMP含量的影響

不同濃度氣態(tài)甲醛染毒下小鼠血漿中cAMP含量如圖1所示，隨著染毒濃度的升高，cAMP含量先升高后降低，其中，1.0 mg/m3染毒組與對照組存在顯著差異(P<0.05)，0.5、3.0 mg/m3染毒組與對照組存在極顯著差異(P<0.01).

2.2 氣態(tài)甲醛暴露對小鼠骨髓組織中cAMP含量的影響

如圖2所示，不同濃度氣態(tài)甲醛染毒下，小鼠骨髓組織cAMP含量均升高，0.5、1.0、3.0 mg/m3染毒組與對照組均存在顯著性差異(P<0.05).

(與對照組相比, *: P< 0.05， **: P< 0.01)

(與對照組相比， *: P< 0.05)

2.3 氣態(tài)甲醛暴露對小鼠腦組織中cAMP含量的影響

如圖3所示，不同濃度氣態(tài)甲醛染毒下，小鼠腦組織cAMP含量沒有發(fā)生顯著性變化.

(與對照組相比,*: P< 0.05)

3 討論

許多文獻表明，cAMP在細胞代謝及多種生理效應的實現(xiàn)中具有關鍵的作用，外源cAMP具有抑制腫瘤細胞生長、促進分化的作用，神經遞質的傳遞、基因表達、激素調節(jié)、免疫反應以及細胞的增殖和分化均與cAMP有關[12-14]，而且在腫瘤細胞內普遍存在著cAMP下降現(xiàn)象.在白血病致病機理的研究中，很多研究結果表明，白血病患者血液中cAMP含量低于正常值[9-15]，本實驗結果也表明甲醛染毒后，各組織器官中cAMP含量發(fā)生變化，由此可以推斷甲醛對造血系統(tǒng)的毒性很可能與cAMP信號分子途徑存在一定聯(lián)系.

3.1 甲醛暴露對小鼠血漿、骨髓、腦中cAMP含量的影響

本實驗結果表明，小鼠血漿、骨髓、腦三者的cAMP含量的本底水平存在差異，甲醛染毒后，cAMP含量變化趨勢也不相同.

小鼠血漿中cAMP含量出現(xiàn)了從高到低的顯著性變化.這種情況的出現(xiàn)值得思考，0.5 mg/m3染毒組顯著性升高的原因與Suat Erdogan[17]等的研究結果相關，機體內cAMP含量隨承受剌激強度的增加顯著增多，而cAMP含量升高能夠抵抗炎癥并且保護組織.在低濃度甲醛暴露時，小鼠自身的防御系統(tǒng)能夠通過提高cAMP含量從而減少甲醛毒性對機體的損傷.3.0 mg/m3染毒組出現(xiàn)顯著性降低是因為，當處于高濃度甲醛暴露環(huán)境中時，小鼠自身的防御系統(tǒng)因無法繼續(xù)維持而崩潰，最終導致cAMP含量極顯著性降低，組織器官受到損失，嚴重時可致癌.

小鼠骨髓中cAMP含量出現(xiàn)顯著性升高.甲醛暴露能夠影響小鼠骨髓細胞的分裂與分化，對骨髓細胞的生長產生毒害作用[7]，而cAMP信號通路下游的cAMP 反應元件結合蛋白(CREB)能夠促進一些控制骨髓細胞增殖和分化的基因表達[18]，所以cAMP含量的升高，可能刺激控制骨髓細胞增殖和分化的基因表達，從而減少甲醛暴露引起的骨髓細胞的損傷，但如果小鼠持續(xù)處于這種甲醛暴露環(huán)境中，這種防御機制無法維持身體正常運轉時，機體則會趨向于發(fā)生癌變.

有研究表明，腦損傷后會釋放各種神經介質、遞質和自由基，通過細胞內信號轉導機制，可導致血腦屏障開放，但提高內皮細胞內cAMP含量，能明顯阻止血腦屏障開放[16].本實驗中，小鼠腦中cAMP含量沒有發(fā)生顯著性變化，這說明短時間的甲醛染毒并沒有造成嚴重的腦損傷，血腦屏障有效的保護了腦組織，小鼠自身的血腦屏障以及信號轉導系統(tǒng)在一定程度上能夠自我恢復，從而減少機體損傷.

3.2 甲醛引起cAMP含量變化的機理

Peter Feick[19]等人的研究表明，低劑量甲醛對腸上皮細胞的暴露能夠導致MAP激酶的活化和整聯(lián)蛋白Paxillin酪氨酸和絲氨酸/蘇氨酸殘基的磷酸化，本實驗結果表明，甲醛確實能夠引起cAMP含量的變化，這說明甲醛分子可能通過MAPK信號通路的級聯(lián)反應傳遞信號，而MAPK信號通路對于細胞周期的運行和基因表達具有重要調控作用[20]，所以最終甲醛分子可以引起DNA轉錄.

cAMP途徑是MAPK信號通路中非常重要的一條路線，推測甲醛通過cAMP途徑引起DNA轉錄發(fā)生的機理如圖4所示，在整個級聯(lián)反應中，甲醛作為信號分子首先與受體結合通過G蛋白偶聯(lián)受體活化腺苷酸環(huán)化酶(AC)，導致細胞內cAMP濃度增高，從而激活下游蛋白激酶A(PKA)[21-22]，PKA激活Raf蛋白激酶，活化了的Raf 再激活Mek，Mek 經磷酸化最終激活Erk，Erk 能夠進入細胞核內，活化cAMP 反應元件結合蛋白(CREK)，進而啟動基因的轉錄[23]，因此，通過甲醛染毒可引起cAMP途徑中各級激酶的異常激活，最終引起基因的異常表達，嚴重時可引發(fā)癌癥.

圖4 甲醛通過cAMP途徑引起DNA轉錄機理圖

4 結語

本實驗研究結果表明，甲醛暴露對造血系統(tǒng)造成的毒性與信號分子途徑存在一定的關系，能夠引起胞內信使cAMP含量的變化，這為從信號分子途徑探討白血病的致病機制提供了一些支持.

[1] Sakr W， Knudsen H N， Gunnarsen L， et al. Impact of varying area of polluting surface materials on perceived air quality[J]. Indoor Air， 2003，13:86-91．

[2] 甘耀坤， 徐 錢， 彭光銀， 等. 甲醛致酵母菌與大腸桿菌DNA2蛋白質交聯(lián)作用的比較[J]. 微生物學報，2007，47(1):164-167．

[3] Pitten F A， Kramer A， Herrmann K. Formaldehyde neurotoxicity in animal experiments [J]. Pathol Res Pract， 2000，196(3):193-198．

[4] International Agency for Research on Cancer， WHO. IARC monographs on the evaluation of carcinogenic risks to human: volume 88 formaldehyde [R]. Lyon: France， 2006．

[5] NTP,The Report on Carcinogens, Twelfth Edition[R], Research Triangle Park, 2011.

[6] Heck H， Casanova M. The implausibility of leukemia induction by formaldehyde: a critical review of the biological evidence on distant-site toxicity [J]. Regul Toxicol Pharmacol， 2004(40):92-106．

[7] 柯玉潔， 秦曉丹， 李 蘭， 等. 甲醛對小鼠骨髓組織的毒性作用[J]. 中國環(huán)境科學，2012，32(6):647-652．

[8] 李 慧， 張玉超， 柯玉潔， 等. 甲醛對原癌基因c-myc、MDM2及抑癌基因p53的影響[J]. 中國環(huán)境科學，2013，33(8):1483-1486．

[9] 許子亮， 孫曉明， 許 晉， 等. 成年血液病患者血中環(huán)-磷酸腺苷和環(huán)磷酸鳥苷的含量測定分析[J]. 臨床血液學雜志，2013，26(3):199-201．

[10] TJ36-79工業(yè)企業(yè)設計衛(wèi)生標準[S].中華人民共和國衛(wèi)生部， 1999.

[11] GBZ 2-2002工作場所有害因素職業(yè)接觸限值[S]. 中華人民共和國衛(wèi)生部，2002.

[12] 陳 敏， 馮 立， 楊季國， 等. 環(huán)-磷酸腺苷在疾病中的信使作用研究 [J]. 浙江中醫(yī)藥大學學報， 2009，33(3):447-449．

[13] 許湘南. 環(huán)-磷酸腺苷(cAMP)在疾病過程中的變化和作用 [J]. 臨床醫(yī)學雜志， 2003， 31(4S):16-18．

[14] Gong Shouliang， Dong Lihua， Liu Guangwei， et al. Effects of corticosterone， cAMP， cGMP， Ca2， and protein kinase C on Apoptosis of Mouse Thymocytes Induced by x-ray Irradiation[J]. Biomedical And Environmeatal Sciences， 2008， 21: 167-172．

[15] 呂燦群， 黃雪玉， 唐世超. 粒細胞白血病患者環(huán)核普酸代謝的研究[J]. 中國病理生理雜志， 1995， 11(2):158-161．

[16] 徐如祥， 李良平， 鐘世鎮(zhèn). 信號轉導機制在大鼠腦損傷后血腦屏障損害中的作用[J]. 解放軍醫(yī)學雜志， 2001， 26(3):186-188．

[17] Erdogan S， Aslantas O， Celik S， et al. The effects of increased cAMP content on inflammation， oxidative stress and PDE4 transcripts during[J]. Brucella Melitensis Infection, 2008， 84(1):18-25．

[18] 肖佩芳， 柴憶歡. cAMP 反應元件結合蛋白在造血和白血病中的作用 [J]. 國際兒科學雜志， 2006， 33(4):253-255．

[19] Peter Feick， Stephan R L，Manfred V. et al. Low-dose exposure of intestinal epithelial cells to formaldehyde results in MAP kinase activation and molecular alteration of the focal adhesion protein paxillin [J]. Toxicology， 2006， 219:60-72．

[20] 范衡宇， 佟 超， 孫青原. 絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路的研究進展 [J]. 動物學雜志， 2002， 37(5):98-102．

[21] 翟中和， 王喜忠， 丁明孝. 細胞生物學[M]. 北京：高等教育出版社，2007．

[22] Linda C Enns， Warren Ladiges. Protein kinase a signaling as an anti-aging target [J]. Ageing Research Reviews，2010， 9:269-272．

[23] Mc Cubrey J A， Steelman L S， Chappell W H， et al. Roles of the Raf/MEK/ERK pathway in cell growth， malignant transformation and drug resistance[J]. Biochimica et Biophysica Acta， 2007， 1773(8):1263-1284．

Study on the mechanism of the change of cAMP concentration in mouse tissues induced by formaldehyde exposure

CAO Fenghua， LI Hui， ZHANG Yuchao， LIU Zhimin， MEI Yufei，SHANG Shuai， YANG Xu， DING Shumao

(Hubei Key Laboratory of Genetic Regulation and Integrative Biology， College of Life Science，Central China Normal University， Wuhan 430079)

In order to explore whether formaldehyde have an effect on the metabolic regulation of hematopoietic system through the signalling pathway， SPF grade Balb/c malemice were selected as the target in this study. After a 7 day(8 h/d) dynamic and inhalational exposure to gaseous formaldehyde with three different concentrations (0.5 mg/m3， 1.0 mg/m3and 3.0 mg/m3， respectively)， the concentrations of cAMP in brain， plasma and bone marrow tissue of mice were determined. The contents of cAMP in brain tissue did not change under different concentrations of formaldehyde compared with the control group. The contents of cAMP in plasma of mice all changed compared with the control group， the 0.5， 3.0 mg/m3group appeared extremely significant difference (P<0.01)， the 1.0 mg/m3group appeared significant difference (P<0.05). The contents of cAMP in the bone marrow of all the experimental groups had significant difference compared with that of control group (P<0.05). The results indicated that the toxicity of formaldehyde on mouse hematopoietic system is related to intracellular cAMP signaling pathways．

formaldehyde; mice; cAMP; mechanism

2014-04-30.

國家自然科學基金重點項目(51136002).

1000-1190(2015)01-0098-04

R995

A

*通訊聯(lián)系人. E-mail: dingsm@mail.ccnu.edu.cn.