張雪娟 周知里 朱仁斌 巨苗苗 何承忠 田 斌,3

(1.西南林業(yè)大學國家林業(yè)局西南生物多樣性保育重點實驗室，云南 昆明 650224；2.西北農(nóng)林科技大學資源環(huán)境學院，陜西 楊凌 712100；3.中國科學院昆明植物研究所，云南 昆明 650201)

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地構葉和廣東地構葉基因組大小測定

張雪娟1周知里1朱仁斌2巨苗苗1何承忠1田 斌1,3

(1.西南林業(yè)大學國家林業(yè)局西南生物多樣性保育重點實驗室，云南 昆明 650224；2.西北農(nóng)林科技大學資源環(huán)境學院，陜西 楊凌 712100；3.中國科學院昆明植物研究所，云南 昆明 650201)

以水稻為外標，采用流式細胞儀測定2種地構葉屬植物地構葉和廣東地構葉的基因組大小。結(jié)果表明：地構葉的基因組大小(2C DNA含量)平均為(0.81±0.02)pg，廣東地構葉的基因組大小(2C DNA含量)平均為(0.85±0.02) pg。

地構葉屬；地構葉；廣東地構葉；基因組大小；流式細胞儀

地構葉屬(Speranskia)隸屬于大戟科鐵莧菜亞科，為我國特有屬，僅包含2個植物種。其中地構葉(S.tuberculata)，又名瘤果地構葉、珍珠透骨草等，廣泛分布于我國的北方地區(qū)，如東北、華北和西北地區(qū)東部。廣東地構葉(S.cantonensis)又名華南地構葉、蛋不老等，廣泛分布于秦嶺淮河以南，南嶺以北的亞熱帶地區(qū)，如安徽、四川、江西、湖南等省[1]。該屬植物被應用在多種中藥配方中，是一種重要的民間藥用植物，主治風濕痹痛、疔瘡腫痛、跌打損傷。

作為重要的藥用資源植物，目前對地構葉屬的研究主要集中在植物化學成分的提取與天然產(chǎn)物以及藥理活性的研究等方面。范云柏等[2]首次從地構葉的地上部分提取出軟脂酸、香草酸和阿魏酸等化學物質(zhì)；李艷梅等[3]從地構葉中提取出了地構苷、香葉素以及多種黃酮類化合物；高海翔等[4]對地構葉的揮發(fā)油成分進行了進一步的分析。王璇等[5]比較了5種中藥名為“透骨草”植物的抗炎和鎮(zhèn)痛活性，并進行了急性毒性實驗，其中尤以地構葉和角蒿最安全。然而，涉及地構葉屬植物基本生物學特性尤其是遺傳背景的研究甚少。

基因組大小(C值)是指單倍體細胞核中所含的DNA總量,也是生物基因組多樣性非常重要的基本參數(shù)[6]。確定物種基因組大小是物種今后的基因組資源利用以及遺傳改良的基礎。一般以質(zhì)量計算，其單位為皮克(pg)或是以核苷酸堿基對數(shù)目表示(Mb)，1 pg等于978 Mb。植物的C值目前被廣泛應用于植物系統(tǒng)分類學、植物生理學和植物進化生物學等領域，C值與植物的性狀特征、生理特性以及基因組進化等相關問題，已引起了眾多科研工作者的廣泛關注[7-8]。然而，地構葉屬植物作為傳統(tǒng)中藥和藥用活性成分提取的材料，其C值還未被測定，有關C值在藥用植物的系統(tǒng)演化和進化等方面的研究，還沒有引起重視。

近年已經(jīng)發(fā)展起來的測定基因組大小的方法主要有孚耳根微顯影、基因組測序法和流式細胞術(Flow cytometry, FCM)3種。對比這一系列不同的方法，我們會發(fā)現(xiàn)孚耳根微顯影的操作過程相對繁雜，而基因組測序法花費比較大，顯然流式細胞術操作十分簡單、分析非?？焖?、相對比較準確，而且廣泛應用于不同物種基因組大小測定的研究[8-10]。Bennett統(tǒng)計結(jié)果顯示，近30年中有84.5%的植物C值是采用FCM法測定[11]。本研究擬應用流式細胞儀對大戟科地構葉屬植物地構葉及廣東地構葉的基因組大小進行測定并加以分析，以期為地構葉屬植物資源的充分利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為地構葉和廣東地構葉野外采集種子播種后長成的健康植株，每個植物種收集分別來自2個不同種群的3個葉片作為重復，樣品信息見表1。用作外標的水稻品種日本晴(Oryzasativasubsp.japonicaKato cv. Nipponbare)取自中國科學院昆明植物研究所。

1.2 儀器與試劑

儀器：流式細胞儀( CyFlow Space )。

試劑：碘化丙啶( propidiumiodide, PI )染液,其他均為常規(guī)分析純試劑。

1.3 試驗方法

1.3.1 提取液的選擇 不同提取液的解離效果不同，本試驗對制備細胞核懸液過程中所需要的提取液進行嘗試，比如常見的LB01[12]、GPB[13]、WPB[13]、Tris·MgCl2[14]、Galbraith[15]，以獲得適合地構葉及廣東地構葉的最佳提取液。適合的解離液能促進植物細胞破碎充分，細胞器分散徹底，從而解離出細胞核。由于植物材料不同，所以不同解離液的解離效果相差甚大[16-17]。

1.3.2 細胞核懸液的制備 分別取地構葉和廣東地構葉的新鮮幼嫩葉片約1.5 g，用蒸餾水快速沖洗，之后用濾紙吸干水分，放于培養(yǎng)皿中置于冰上預冷，后加入預冷的解離液(約1.5 mL)，用鋒利的刀片垂直快速切碎葉片。充分混勻后用濾膜過濾并用移液槍吸取至2 mL離心管，然后置于4 ℃冰箱中孵育5 min再取出，置于離心機1 000 r/min 4 ℃離心5 min。小心棄上清，向沉淀中加預冷的解離液150 μL，混勻置于冰上備用。采用相同方法獲得水稻葉片的細胞核懸液，置于冰上備用。操作時應注意刀片要鋒利，材料要完全浸入提取液，垂直快速切碎；每個樣品至少重復3次。

1.3.3 DNA特異性染色 將制備好的地構葉、廣東地構葉以及水稻的細胞核懸液放在冰上，分別往3種不同的細胞核懸液中加入預冷的碘化丙啶(PI)染料200 μL，再置于4 ℃冰箱中避光染色，8 min即可。

1.3.4 樣品測定及基因組大小計算 在樣品上機檢測前，將染過色的樣品輕輕振動6 s，然后移至上樣管，采用流式細胞儀測定。每個樣品收集8 000～15 000個細胞(核)，包括碎片。在測定過程中采用500 nm的藍光激發(fā)，后收集FL2通道的熒光并檢測PI發(fā)射的熒光強度。樣品核DNA含量的計算方法如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 提取液的選擇

在制備細胞核懸液的過程中，對常用的解離液進行嘗試。最后發(fā)現(xiàn)，裂解液WPB對地構葉及廣東地構葉的細胞核解離效果最佳，所得的峰形圖雜峰較少或沒有雜峰。WPB配方為：200 mmol Tris·HCl ，4 mmol MgCl2·6H2O，2 mmol EDTA·Na2·2H2O，86 mmol NaCl，10 mmol 焦亞硫酸鈉，1.0 %PVP-10，1.0 % (v/v) Triton X-100，pH 7.5，4 ℃下保存。

2.2 基因組大小的測定

由于采用內(nèi)標法難以對地構葉屬植物的離子團準確區(qū)分(圖1-A)。因此，本試驗采用水稻品種日本晴作為外標(圖1-B)，應用流式細胞儀測試6份水稻樣品計算G0/G1峰熒光均值為106.18，隨后又分別測定來自地構葉和廣東地構葉共12組樣品，每個樣品測3次重復。部分樣品的流式細胞圖譜見圖1-C和圖1-D。地構葉、廣東地構葉的二倍體DNA含量統(tǒng)計結(jié)果見表1。

表1 地構葉和廣東地構葉2C DNA含量測定結(jié)果Tab.1 2C DNA content measurement of Speranskia tuberculata and Speranskia cantonensis

由于水稻日本晴2C DNA含量為0.795 pg[18]，再以所測樣品的PI發(fā)射熒光強度為根據(jù)可計算出基因組的大小(2C DNA含量)，地構葉的基因組大小平均為(0.81±0.02) pg，變異系數(shù)為2.55%；廣東地構葉的基因組大小平均為(0.85±0.02) pg，變異系數(shù)為2.35 %。由此可知，地構葉和廣東地構葉的基因組大小很接近。

3 結(jié)論與討論

通常情況下利用流式細胞儀測定植物基因組大小采用內(nèi)標方法，內(nèi)標的選擇應該符合以下幾個條件[19]：相比于待測物種，要有相近的基因組大小，且較易區(qū)分；有穩(wěn)定的遺傳性；有可靠的基因組大小數(shù)據(jù)；能獲得大量樣品。由于地構葉和廣東地構葉與普遍使用的內(nèi)標如水稻和毛果楊(Populustrichocarpa)等基因組大小類似，且難以區(qū)分離子團(圖1)，又與玉米(Zeamays)等基因組大小相差較遠，計算誤差較大，難以得到準確的數(shù)據(jù)。因此，選用水稻作為外標的試驗方法測定地構葉屬的基因組大小。多次重復試驗表明，該手段同樣能得到較為準確的數(shù)據(jù)。

所測得的不同地構葉樣品和廣東地構葉樣品的變異系數(shù)分別為2.55%和2.35%，說明同一物種的不同植株和不同材料的基因組大小存在一定差異。目前普遍認為,變異系數(shù)在低于3 %時，被認為實驗結(jié)果是準確的，變異系數(shù)低于5%也是可以接受的范圍[19]。地構葉和廣東地構葉基因組大小的變異系數(shù)均小于3%，因此，認為此差異對于應用流式細胞儀來測定植物基因組大小并沒有造成實質(zhì)性的影響，測出的基因組大小數(shù)據(jù)很可靠。

楊德奎等[20]對地構葉的核型分析表明，地構葉為二倍體植物(2n=14)，我們本次測得的地構葉和廣東地構葉的DNA含量接近(表1)，因此，可以推斷廣東地構葉和地構葉一樣,也應該是一個二倍體植物，并且染色體條數(shù)有可能一致，均為14條。廣東地構葉基因組(0.85±0.02)pg稍大于地構葉(0.81±0.02)pg，很可能是在進化過程中某些染色體或者基因片段發(fā)生了重復的結(jié)果。根據(jù)邱園的植物 DNA C-值數(shù)據(jù)庫(http: //data. kew. org / cvalues / homepage. html)中的數(shù)據(jù)，大戟科的植物基因組大小差異很大，范圍在0.30～14.35，平均值為3.59，我們的結(jié)果表明：地構葉屬在大戟科中屬于DNA含量較小的基因組，和巴豆亞科的木薯屬(Manihot)、以及同為鐵莧菜亞科的蓖麻屬(Ricinus)的基因組大小類似，表明基因組大小不能反映大戟科植物的系統(tǒng)演化關系，這與自然界普遍存在的“C值悖論”[21]吻合。

本研究以日本晴作為外標，測定了地構葉屬植物地構葉和廣東地構葉的基因組大小，這些數(shù)據(jù)將有利于地構葉屬植物遺傳學和基因組學研究方案的制定以及數(shù)據(jù)的分析，也為可測定其他藥用植物C值提供參考和借鑒。

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(責任編輯 趙粉俠)

Estimation of Genome Sizes ofSperanskiatuberculataandSperanskiacantonensis

ZHANG Xue-juan1，ZHOU Zhi-li1，ZHU Ren-bin2，JU Miao-miao1，HE Cheng-zhong1，TIAN Bin1,3

(1.Key Laboratory of Biodiversity Conservation in Southwest China,State Forestry Administration, Southwest Forestry University,Kunming Yunnan 650224,China;2.College of Resource and Environment,North West Agriculture and Forestry University,Yangling Shaanxi 712100, China;3.Kunming Institute of Botany,Chinese Academy of Sciences,Kunming Yunnan 650201,China)

Using rice (Oryzasativ) as an external standard,the genome sizes ofSperanskiatuberculataandSperanskiacantonensiswere determined by flow cytometry.As a result, the average genome sizes (the content of 2C DNA) ofSperanskiatuberculataandSperanskiacantonensiswere about (0.80±0.02) pg and (0.85±0.02)pg, respectively.

Speranskia;Speranskiatuberculata;Speranskiacantonensis; the genome sizes;flow cytometry

2014-12-30

國家自然科學基金項目(NSFC 31260050)資助。

田斌(1983—)，男，博士，講師。研究方向：植物遺傳育種及群體遺傳學。Email：tianbinlzu@gmail.com。

10.11929/j.issn.2095-1914.2015.04.015

S718.46

A

2095-1914(2015)04-0086-05

第1作者：張雪娟(1988—)，女，碩士生。研究方向：植物遺傳育種及群體遺傳學。Email:juanzi888168@126.com。